DE69929445T2 - Methoden und reagenzien zur erhaltung der rna in zellen und geweben - Google Patents

Methoden und reagenzien zur erhaltung der rna in zellen und geweben Download PDF

Info

Publication number
DE69929445T2
DE69929445T2 DE69929445T DE69929445T DE69929445T2 DE 69929445 T2 DE69929445 T2 DE 69929445T2 DE 69929445 T DE69929445 T DE 69929445T DE 69929445 T DE69929445 T DE 69929445T DE 69929445 T2 DE69929445 T2 DE 69929445T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
rna
sample
use according
salt
samples
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69929445T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69929445D1 (de
Inventor
S. Eric Austin LADER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ambion Inc
Original Assignee
Ambion Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ambion Inc filed Critical Ambion Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69929445D1 publication Critical patent/DE69929445D1/de
Publication of DE69929445T2 publication Critical patent/DE69929445T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und stellt ein neues Verfahren und ein Reagens zur Konservierung und zum Schutz des Ribonukleinsäuregehalts (RNA-Gehalts) von Gewebe- oder Zellproben vor Degeneration vor der RNA-Isolierung bereit.
  • Intakte RNA hoher Qualität zu gewinnen ist der erste und oft der wichtigste Schritt bei der Durchführung vieler molekularbiologischer Grundlagenexperimente. Intakte RNA ist für die quantitative und qualitative Analyse der RNA-Expression durch Northern-Blot-Hybridisierung, Nukleaseschutztests und RT-PCR erforderlich.
  • Es gibt zahlreiche veröffentlichte Berichte, die Verfahren zur Isolierung intakter RNA aus frischen (oder schockgefrorenen) Zellen oder Geweben beschreiben. Bei den meisten dieser Techniken erfolgt ein rascher Zellzerstörungsschritt, bei dem das Gewebe in einer ein Chaotropikum (z.B. Guanidinium- oder Lithiumsalz) enthaltenden starken Proteindenaturierungslösung dispergiert wird. Diese rasche Zerstörung der Zellmembranen und die Deaktivierung endogener Ribonuklease ist wichtig, um eine Degeneration der RNA zu verhindern.
  • Für den Erhalt qualitativ hochwertiger RNA ist es notwendig, dass die Aktivität der bei der Zelllyse freigesetzten RNase auf ein Minimum reduziert und eine RNA-Degeneration aus anderen Quellen verhindert wird. Dies erfolgt normalerweise durch Verwendung von Isolierungsverfahren, die Gewebe zerstören und gleichzeitig RNase deaktivieren bzw. inhibieren. Bei Proben mit geringem Gehalt an endogener Ribonuklease werden in den Isolierungsprotokollen für gewöhnlich Extraktionspuffer, die Detergenzien zur Löslichmachung von Membranen enthalten, sowie Inhibitoren der RNase, z.B. Plazentaribonukleaseinhibitor oder Vanadylribonukleosidkomplexe verwendet. Die RNA-Isolierung aus schwierigeren Proben, z.B. intakten Geweben oder Zellen mit hohem Gehalt an endogener Ribonuklease, erfordert einen aggressiveren Ansatz. In diesem Fall werden das Gewebe oder die Zellen in einem starken Proteindenaturierungsmittel (für gewöhnlich Guanidiniumisothiocyanat) rasch homogenisiert, um Nukleasen irreversibel zu deaktivieren und die Zellmembranen löslich zu machen. Kann eine Gewebeprobe nicht sofort homogenisiert werden, muss sie durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff rasch gefro ren und bei –80°C gelagert werden. Auf diese Weise eingefrorene Proben dürfen vor der RNA-Isolierung auf keinen Fall mehr aufgetaut werden, da die RNA ansonsten durch die RNase, die während der beim Einfrieren erfolgenden Zelllyse freigesetzt wird, rasch degeneriert wird. Das Gewebe muss in einen Pool aus flüssigem Stickstoff eingetaucht und mittels Mörser und Stößel zu einem feinen Pulver gemahlen werden. Sobald es in Pulverform vorliegt, wird das noch immer gefrorene Gewebe in einem RNA-Extraktionspuffer homogenisiert. Im Labor hat das Schockgefrieren von Proben zur Verzögerung der RNA-Extraktion den Nachteil, dass sich die manuelle Behandlungszeit erheblich verlängert. Die Behandlung mehrerer Proben mit flüssigem Stickstoff und Mörser und Stößel ist extrem umständlich.
  • Schockgefrieren ist zwar außerhalb der Laborumgebung sogar noch unzweckmäßiger, wird aber vom Fachmann dennoch als notwendig erachtet. Wissenschaftler, die vor Ort Muster für die Analyse sammeln, haben keinen Zugang zu Hochgeschwindigkeitshomogenisatoren. Sie sind gezwungen, einen Vorrat von flüssigem Stickstoff oder Trockeneis anzulegen, der für die Lagerung der Proben bis zur Übertragung in einen Ultraniedrigtemperaturgefrierschrank groß genug ist. Auch aus humanen Biopsieproben extrahierte RNA degeneriert für gewöhnlich teilweise oder größtenteils, weil Pathologen die Muster nicht routinemäßig schockgefrieren, um die RNA zu konservieren.
  • Es wurden Versuche unternommen, RNA aus Archivproben zu isolieren, die nicht nach der Schockgefriermethodik hergestellt worden waren. Esser et al., 1995, beanspruchen beispielsweise die Isolierung von RNA voller Länge aus mit 5% Essigsäure und 95% Ethanol fixierten Zellen mit RNase-Inhibitoren. In diesem Paper wurden allerdings isolierte Zellen in Suspension in einer Lösung von Essigsäure/Ethanol bei –20°C fixiert und anschließend bei 4°C relativ kurz gelagert. Leider zeigten die Tests des Erfinders, dass die 95% Ethanol/5% Essigsäure-Lösung von Esser et al. den Leistungsstandards der vorliegenden Erfindung nicht gerecht wird. RNA, die aus bei 4°C 20 Stunden lang gelagerten Gewebeproben und Milzzellen in Suspension rückgewonnen wurde, erschien teilweise degeneriert, wohingegen RNA, die aus bei Raumtemperatur gelagerten. Geweben isoliert wurde, vollständig degeneriert war. Die von Esser et al. berichteten Experimente zeigen, dass das Verfahren zu einem RNA-Verlust infolge des ethanol-induzierten Austretens aus den Zellen führt. Bei Verwendung dieses Verfahrens gehen 70% der RNA unmit telbar bei der Fixierung verloren; nach 1 Stunde fehlen 80% der RNA. Weiterhin degenerierte die RNA von Zell- und Gewebeproben vollständig in einem Test, bei dem Gewebeproben und Milzzellen über Nacht in der 95% Ethanol/5% Essigsäure-Lösung bei 25°C gelagert wurden. Die Daten sind in 1 dargestellt.
  • Die Verwendung hochreiner, intakter RNA ist für die Durchführung verschiedener molekularbiologischer Tests und Experimente wie z.B. Northern-Blot-Hybridisierung, Nukleaseschutztests, RT-PCR sowie die medizinische Diagnose grundlegend. Die innere Instabilität der RNA und die Gegenwart von RNasen in den Proben macht die Isolierung intakter RNA zu einer schwierigen Aufgabe. Weiterhin ist die Isolierung und Testung RNA-haltiger Proben typischerweise zeitaufwendig und mühsam. Die Kontaminierung eines molekularbiologischen Labors mit RNasen durch menschliches Versagen kann katastrophale Folgen haben. Daher besteht nach wie vor die Notwendigkeit der Entwicklung verbesserter Techniken, damit die Verfahren zur Isolierung und Testung von RNA empfindlicher, spezifischer, schneller, leichter durchführbar und weniger anfällig für menschliches Versagen und Handhabungsfehler werden. Es wäre daher in vielen Fällen vorteilhaft, wenn Forschungseinrichtungen ein automatisiertes RNA-Konservierungsprotokoll anwenden würden. Die vorliegende Erfindung könnte z. B. für eine effiziente automatisierte RNA-Konservierung und -Analyse mit RNA-Schnelltesttechniken kombiniert oder in Nukleinsäurediagnosegeräte integriert werden (US-Patent 5,726,012, US-Patent 5,922,591, auf die hierin Bezug genommen wird).
  • Das US-Patent Nr. 5,256,571 berichtet über eine Zellkonservierungslösung, die einen mit Wasser mischbaren Alkohol in einer Menge, die für das Fixieren von Säugetierzellen ausreicht, ein Antiverklumpungsmittel und ein Puffermittel umfasst. Mindestens ein Paper, Dimulescu et al., berichtet über die scheinbare Verwendung dieses Fixierungsmittels zur Konservierung von Gebärmutterhalskrebszellen und Nabelschnurblutlymphozyten vor der RNA-Isolierung.
  • Zahlreiche Literaturstellen deuten darauf hin, dass Kombinationen von Ethanol und Aceton die bekanntesten Fixierungsmittel für die zukünftige Rückgewinnung von Nukleinsäuren aus Archivgewebe sind. Angesichts der Studien der Erfinder bietet ein solches. Ethanol/Aceton-Gemisch jedoch nicht alle gewünschten Eigenschaften eines RNA-Konservierungsmediums. Die Mischungen schützen die RNA bei Umgebungstemperatur nicht, erlauben keine Konservierung von RNA in fes ten, mehrzelligen Proben und sind außerdem entflammbar, was sie als Reagens für den allgemeinen Gebrauch per se weniger attraktiv macht.
  • Der Stand der Technik behandelt (peripher) Aspekte der Konservierung bzw. Rückgewinnung von RNA aus fixierten oder konservierten Gewebeproben. Diese Berichte schließen zahlreiche Bewertungen der Eignung histologischer Fixierungsmittel zur Maximierung des durch in situ-Hybridisierung erhaltenen Signals zum Nachweis (nicht zur Rückgewinnung) von RNA in Gewebeproben ein (z.B. US-Patente Nr. 5,196,182 und 5,260,048). Andere Berichte erläutern detailliert Verfahren zur Rückgewinnung fragmentierter RNA aus fixierten Geweben für eine begrenzte Molekularanalyse mittels PCRTM (Koopman et al., Foss et al., Stanta et al., Houze et al.). Zur Rückgewinnung dieser fragmentierten RNA werden die Proben typischerweise mit Proteinase K behandelt, um die Strukturkomponenten des Gewebes zu degenerieren. Anschließend wird die RNA mit einer Lösung auf Guanidiniumbasis extrahiert. Die aus fixiertem Gewebe rückgewonnene RNA hat eine extrem schlechte Qualität und eine Größe von durchschnittlich etwa 200 Basen (Stanta, 1991). Dies ist wahrscheinlich die Folge einer Reihe von Faktoren wie z.B. der Wirkung der endogenen RNase und der Vernetzung der RNA in der intrazellulären Matrix bei der Fixierung. Da die RNA größtenteils degeneriert, kann sie nicht für eine Northern-Blotting-Analyse oder Nukleaseschutztests verwendet werden. Sie kann für RT-PCR eingesetzt werden, jedoch nur zur Amplifikation sehr kleiner Fragmente.
  • Die Verwendung von Ammoniumsulfat zum Ausfällen von Proteinen aus der Lösung ist im Stand der Technik bekannt, die Verwendung von Ammoniumsulfat zur Konservierung von RNA nach Wissen des Erfinders nicht. Zwei Berichte beschreiben die Verwendung von Ammoniumsulfat zur Untersuchung der Faltung und Aktivität von Säugetierribonuklease A (Alleweil et al. und Lin et al.). Alleweil et al. untersuchten die Wirkung von Ammoniumsulfat auf die Faltung und Aktivität von RNase A. Bei pH 5,5 wird die Aktivität der Ribonuklease A über einen breiten Ammoniumsulfatkonzentrationsbereich auf etwa 10% der unbehandelten Kontrollkonzentration supprimiert. Diese Aktivitätssuppression wurde von den Autoren erwartet; sie scheint Folge einer salzinduzierten Denaturierung des Proteins zu sein. Leider degeneriert eine RNase-Aktivität von nur 10% die RNA einer Probe im Laufe der Zeit erheblich. Daher reicht diese Inhibition bei vielen Verwendungszwecken nicht aus, um die RNA zu schützen. Beträgt der pH von Ammoniumsulfat 7,0, wird die RNase A-Aktivität wie erwartet bei geringen Konzentrationen supprimiert, steigt aber bei höheren Konzentrationen (3M) unerwarteterweise auf 110% der Konzentration der unbehandelten Kontrolle an. Die Autoren stellen die Theorie auf, dass die Kombination des neutralen pH und der hohen Salzkonzentration eine Umfaltung des Proteins in eine alternative, hochaktive Konfiguration erzwingt. Die Gruppe von Alleweil et al. untersuchte jedoch die Aktivität reiner RNase A in Lösung und nicht in einer viele RNasen enthaltenden Zellprobe.
  • Angesicht dieser Tatsachen besteht ein Bedarf an Verfahren und Reagenzien, die die Konservierung und Rückgewinnung qualitativ hochwertiger, intakter RNA aus bei (oder nahe) Umgebungstemperatur gelagerten Gewebeproben erlaubt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren und Reagenzien zur Konservierung der RNA in Gewebefragmenten bei Temperaturen über dem Gefrierpunkt der Konservierungsmittel über einen längeren Zeitraum (Tage bis Monate) vor der RNA-Isolierung. Es gibt keinen Bericht aus dem Stand der Technik, der ein Reagens oder Verfahren offenbart, das dem in dieser Anmeldung beschriebenen ähnlich ist. Dieser Durchbruch lindert die Notwendigkeit, Proben zur Extraktion der RNA entweder sofort zu behandeln oder Gewebe nur noch dort zu isolieren, wo flüssiger Stickstoff oder Trockeneis zur Verfügung steht.
  • Die vorliegende Anmeldung betrifft Verfahren zur Konservierung von RNA, die Folgendes umfassen: (1) Gewinnen einer RNA-haltigen Probe; und (2) Behandeln der Probe mit einem RNA-Konservierungsmedium, das die Probe infiltriert und die RNA vor Nukleasen schützt. In einer bevorzugten Ausführungsform führt das RNA-Konservierungsmedium dazu, dass die RNA in der Probe zusammen mit Zellprotein ausfällt. Man glaubt, dass dieses gleichzeitige Ausfallen von RNA und Zellproteinen bewirkt, dass die RNA für die Nukleasen physikalisch nicht mehr zugänglich ist, während die Wirkung des RNA-Konservierungsmediums die Wirkung der Nukleasen gleichzeitig deaktiviert bzw. hemmt.
  • Das RNA-Konservierungsmedium umfasst ein Salz in einer Konzentration von 40 g/100 ml bis zur Sättigungskonzentration des Salzes, das die RNA in der Probe zusammen mit dem Zellprotein ausfällt. Das Salz ist Ammoniumsulfat oder Cäsiumsulfat. In derzeit bevorzugten kommerziellen Ausführungsformen ist das Salz Ammoniumsulfat.
  • Es werden insbesondere Salzkonzentrationen von 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 oder 150 g/100 ml verwendet; die Konzentration kann ein zwischen zwei dieser Konzentrationen definierter Bereich sein.
  • Natürlich kann es bei Gebrauch zu einer gewissen Verdünnung der Salzkonzentration infolge von z.B. Flüssigkeit in der Probe kommen. Daher können diese Salzkonzentrationen höher sein als die bei einigen Verwendungszwecken erzielten endgültigen Salzkonzentrationen. Weiterhin wird erwogen, bezüglich der vorliegenden Erfindung Salzmengen jenseits der Sättigungskonzentration zu verwenden. In solchen Ausführungsformen kann das RNA-Konservierungsmedium noch Salz enthalten, das nicht in Lösung ist. Dies sollte die Fähigkeiten der Medien zur RNA-Konservierung aber nicht beeinträchtigen. De facto können Medien, deren Konzentration die Sättigungskonzentration eines Salzes überschreitet, bei Verwendungszwecken, bei denen die Medien einer flüssigen Probe zugegeben werden, sogar in gewisser Weise nützlich sein. In solchen Fällen kann Salz, das sich vor der Zugabe nicht in Lösung befindet, bei Zugabe zu der flüssigen Probe infolge des erhöhten Flüssigkeitsvolumens löslich werden.
  • In einer bevorzugten kommerziellen Ausführungsform ist das Salz Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 70 g/100 ml.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung von Ammoniumsulfat beschränkt; Cäsiumsulfat kann für den Schutz der RNA in Gewebe- und Zellproben aus nachfolgend genannten Gründen ebenfalls nützlich sein. Die Löslichkeit einzelner Proteine hängt stark vom pH und der Salzkonzentration der wässrigen Umgebung ab. Praktisch alle Proteine sind in reinem Wasser unlöslich. Mit steigender Ionenstärke des Mediums wird das Protein löslicher. Dies ist als "Einsalzen" der Proteine bekannt. Jenseits einer bestimmten Ionenstärke nimmt die Löslichkeit des Proteins ab. Die genauen Bedingungen, unter denen dies geschieht, sind für jede Protein/Salz-Kombination einzigartig. De facto kann ein Protein bei bestimmten Salzkonzentrationen vollständig unlöslich sein, ein anderes dagegen maximal löslich. Dieses Phänomen ist als "Aussalzen" bekannt. Man glaubt, dass die Funktion der erfindungsgemäßen RNA-Schutzmedien auf der Aussalzwirkung höherer Salzkonzentrationen beruht. Gemäß der Theorie ist es das Aussalzen von Proteinen in den Zellen der Gewebe- oder Zellproben, das zur Bildung der RNA-Schutzprotein/RNA-Komplexe führt. Das "Aussalz"-Phänomen ist bei diesem Ver wendungszweck in mehrfacher Hinsicht von Bedeutung. Erstens unterstreicht es, dass die Wirksamkeit des RNA-Schutzes durch Proteinausfällung mittels hoher Salzkonzentrationen komplex ist und bestimmte Kombinationen aus Ionenstärke (Salzkonzentration) und pH bewirken können, dass ein Salz in einer Formulierung wesentlich wirksamer ist als bei einem anderen pH oder einer anderen Konzentration. Zweitens stellt es ein stabiles wissenschaftliches Fundament für die grundlegenden Wirkmechanismen der Reagenzien in dieser Anmeldung bereit und dient als Richtschnur bei der Suche nach zusätzlichen RNA-Schutzverbindungen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Um zu bestimmen, ob ein anderes Salz oder eine mutmaßliche RNA-Schutzverbindung bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien funktionsfähig ist, muss ein Salz oder eine Verbindung lediglich wie in den Beispielen beschrieben gewonnen und getestet werden. Befolgt er die Lehren der Beispiele, kann der Fachmann leicht klären, ob eine Kandidatensubstanz tatsächlich eine RNA-Schutzverbindung ist. Drittens erklärt dies – basierend auf der Theorie, dass die Ausfällung intrazellulärer Proteine der Schlüssel zum RNA-Schutz in situ ist – warum Alkohol und Aceton (Substanzen, die ebenfalls Protein ausfällen können, wenn auch mit Hilfe eines anderen Mechanismus) RNA in Geweben teilweise wirksam schützen können, auch wenn sie nicht die Schutzwirkung bieten, wie sie bei den meisten Verwendungszwecken erforderlich ist.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das RNA-Konservierungsmedium eine Kombination aus zwei Salzen, die RNA in der Probe zusammen mit dem Zellprotein ausfällen.
  • Das RNA-Konservierungsmedium kann weiterhin Ethanol, Methanol, Aceton, Trichloressigsäure, 1-Propanol, 2-Propanol, Polyethylenglycol oder Essigsäure umfassen. Diese zusätzlichen potentiellen Komponenten können Proteine in konservierten Zellen ausfällen und dadurch die RNA schützen. Diese zusätzlichen potentiellen Komponenten sind jedoch keine Salze. Man erwartet, dass in einigen Ausführungsformen diese organischen Lösungsmittel in Kombination mit einer Salzkonzentration verwendet werden, um eines der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien zu erhalten.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das RNA-Konservierungsmedium ein Salz wie z.B. Ammoniumsulfat, Cäsiumsulfat, Methanol, Trichloressigsäure, 1-Propanol, 2-Propanol, Polyethylenglycol oder Essigsäure. Weiterhin kann das RNA-Konservierungsmedium einen Chelatbildner aus zweiwertigen Kationen, z.B. EDTA umfassen.
  • Typischerweise umfasst das RNA-Konservierungsmedium einen Puffer, so dass der pH konstant gehalten werden kann. Der Puffer kann z.B. Natriumcitrat, Natriumacetat, Kaliumcitrat oder Kaliumacetat sein. In einer derzeit bevorzugten kommerziellen Ausführungsform ist der Puffer Natriumacetat. Typischerweise besitzt das RNA-Konservierungsmedium einen pH von 4 bis B. In derzeit bevorzugten kommerziellen Ausführungsformen beträgt der pH 5,2.
  • Die in den RNA-Konservierungsmedien konservierte Probe kann jeder beliebige Probentyp sein. Die Probe kann beispielsweise eine Zellsuspension wie z.B. abgesaugtes Knochenmark, weiße Blutzellen, Sperma, Blut, Serum, Plasma, Bakterien, Gewebekulturzellen oder Algen sein. Alternativ kann die Probe ein festes Gewebe sein, z.B. eine Gewebeprobe aus Gehirn, Herz, Leber, Milz, Thymus, Niere, Hoden, Eierstock, Tumoren, Gewebebiopsien, Pflanzenstielen, -wurzeln oder -blättern. In einigen Fällen kann die Probe einen ganzen Organismus umfassen. Der Organismus kann beispielsweise ein Fisch, ein Insekt, eine Kaulquappe, eine Koralle oder ein Embryo sein. In einigen Protokollen ist es vorteilhaft, wenn der Organismus bzw. die Probe während der Präparation in dem RNA-Konservierungsmedium verbleibt. Es kann z.B. günstig sein, einen Organismus in dem RNA-Konservierungsmedium zu präparieren, wenn die Probe einen Organismus umfasst, bei dem es sich um einen Krankheitserreger in einer Gewebeprobe oder einem anderen Organismus handelt. Auf diese Weise kann die RNA des Krankheitserregers konserviert werden. Weiterhin wird die RNA der Gewebeprobe bzw. des anderen Organismus konserviert.
  • Bei vielen bevorzugten Verfahren umfasst die Ausübung der Erfindung weiterhin den Schritt der Isolierung der konservierten RNA. Einer der Vorteile der erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien ist, dass die RNA bei einer höheren Temperatur aus dem Gewebe isoliert werden kann, als herkömmliche Techniken es erlauben. Die RNA kann beispielsweise bei einer Temperatur von mehr als –20°C isoliert werden. De facto kann die RNA bei Raumtemperatur isoliert werden.
  • In einigen Fällen kann die Probe vor der Isolierung der RNA in dem RNA-Konservierungsmedium gelagert werden. Das Gewebe wird z.B. nicht gefroren bei –20°C bis 45°C gelagert. Aufgrund des Salzgehaltes einiger RNA-Konservierungsmedien frieren die Proben bei –20°C nicht ein. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Probe bei mehr als 0°C gelagert werden.
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Konservierung von RNA die Gewinnung einer RNA-haltigen Probe, die Bereitstellung eines Salzes und das Beimischen der Probe und des Salzes zu einer Flüssigkeit zur Bildung einer RNA-Konservierungszusammensetzung, die die Probe infiltriert und die RNA vor Nukleasen schützt. In einer Ausführungsform befindet sich die Probe vor dem Beimischen des Salzes zu der Probe in der Flüssigkeit. In einer weiteren Ausführungsform liegt das Salz vor seiner Beimischung zu der Probe und der Flüssigkeit in fester Form vor. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Salz vor seiner Beimischung zu der Probe in der Flüssigkeit enthalten.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Probe eine Blutzelle und die Flüssigkeit Blutserum. In einer weiteren Ausführungsform ist die Probe Urin. In anderen Ausführungsformen ist die Flüssigkeit Wasser. In wieder anderen Ausführungsformen ist die Flüssigkeit ein Puffer.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfassen die RNA-Konservierungszusammensetzungen die Gewinnung einer RNA-haltigen Probe, die Bereitstellung eines Salzes und die Beimischung der Probe und des Salzes zu einer Flüssigkeit. Die Flüssigkeit kann eine Komponente der Probe sein oder der Probe und dem Salz zugegeben werden. Das Salz liegt typischerweise in einer Konzentration vor, die ausreicht, die RNA in der Probe zusammen mit dem Zellprotein auszufällen. In einigen Fällen ist die Zugabe eines sehr konzentrierten Salzes oder eines gesättigten Salzes zu einer flüssigen Probe effizient. Die Zugabe von Salz, die wahrscheinlich zu einer höheren Konzentration als der Sättigungskonzentration des Salzes in der endgültigen flüssigen Probe führt, hat den Vorteil, dass die RNA-Konservierungskonzentrationen rasch erreicht und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Abwägung der für Erzielung einer spezifischen Konzentration in einer Probe notwendigen Salzmenge vermieden werden kann. Weiterhin beeinträchtigt ein Salz, das nicht in Lösung geht, die RNA-Konservierungseigenschaften der Zusammensetzung nicht.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die RNA-Konservierungszusammensetzung einen Chelatbildner aus zweiwertigen Kationen. In wieder anderen Ausführungsformen umfasst die RNA-Konservierungszusammensetzung einen Puffer, wobei der Puffer einen pH zwischen 4 und 8 hat.
  • Die festen Komponenten der vorliegenden Erfindung (z.B. Salze, Puffer und Schutzsubstanzen) können so hergestellt werden, dass sie bei Zugabe zu einer wässrigen Probe die gewünschten Endkonzentrationen der Komponenten in Lösung liefern. Die festen Komponenten können weiterhin als Pulver, Tabletten, Pillen oder andere geeignete Formulierungen, die einer RNA-Konservierungszusammensetzung die gewünschten Eigenschaften verleihen, bereitgestellt werden. Feste Komponenten können der Probe direkt zugegeben werden, einem Gemisch aus Probe und Flüssigkeit zugegeben werden oder vor dem Sammeln einer Probe oder eines Probe/Flüssigkeit-Gemisches in einem Sammelbehälter vorliegen. Die Zugabe von Arzneimittelträgern und Füllstoffen wie Mannitol, Lactose, Stärke, Cellulose und dergleichen zur Verleihung der gewünschten Festkörpereigenschaften (z.B. verbesserte Löslichkeit, Lagerstabilität, Partikeldispersion) erfolgt ebenfalls als Pulver, Tabletten und Pillen. Die festen Komponenten der vorliegenden Erfindung können vor und/oder nach dem Sammeln der Probe zugesetzt werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung können zuvor abgemessene Aliquote einer festen oder flüssigen RNA-Konservierungszusammensetzung in Probensammelbehälter gefüllt und ein geeignetes Volumen einer RNA-haltigen Probe zugegeben werden. Der Sammelbehälter wird dann gerührt, wobei sich die festen Komponenten der RNA-Konservierungszusammensetzung lösen, so dass der Experimentator der RNA-Probe möglichst wenig ausgesetzt ist. Eine feste RNA-Konservierungszusammensetzung könnte z.B. eines der zuvor beschriebenen Salze sein. Daher wird in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung die Stabilisierung der RNA in einem biologischen Muster wie z. B. Blut oder Urin wie zuvor beschrieben erwogen.
  • In einem Beispiel könnte eine Ampulle zum Sammeln eines Musters wie z.B. Urin oder Blut mit zuvor abgemessenen Allquoten einer RNA-Konservierungszusammensetzung befüllt werden. Unmittelbar nach dem Sam meln des Musters könnte die Ampulle gerührt und der RNA-Konservierungszusammensetzung das RNA-haltige Muster (z.B. Probe) beigemischt werden. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird eine Vakuumampulle zum Sammeln von Blut mit einer nach außen ragenden Nadel (US-Patent 5,090,420, auf das in seiner Gesamtheit hierin speziell Bezug genommen wird) zum raschen Sammeln und Mischen der RNA-haltigen Proben erwogen. In einer Ausführungsform wird eine automatisierte RNA-Konservierung erwogen. Verfahren zur automatisierten RNA-Konservierung wären weniger mühsam, schneller, leichter durchführbar und weniger anfällig für menschliches Versagen und Handhabungsfehler.
  • Klinische Mustersammelkits, die sich zur Versendung per Post eignen, werden zur Verwendung mit zuvor abgemessenen Aliquoten einer erfindungsgemäßen RNA-Konservierungszusammensetzung ebenfalls erwogen (US-Patent 5,921,396, auf das in seiner Gesamtheit hierin speziell Bezug genommen wird). Die RNA-haltigen Proben könnten gesammelt (z.B. von einer Laboreinrichtung) und mit den zuvor abgemessenen Aliquoten der RNA-Konservierungszusammensetzung in der Ampulle gemischt werden, so dass die RNA für die Versendung an einen geeigneten RNA-Analyseort konserviert wird.
  • Alternativ kann die RNA-Konservierungszusammensetzung zu einer Tablette oder Pille gepresst und als Schüttmasse gelagert werden. Tabletten wären eine zweckmäßige Lagerzusammensetzung und könnten einer Probe einer beliebigen Größe in einem beliebigen Behältertyp in der richtigen Menge zugegeben werden. Daher werden in anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung RNA-Konservierungskomponenten in Form von Tabletten oder Pillen für das Sammeln von Proben vor Ort aus solchen Quellen wie Wasserreservoirs, Abwasseranlagen oder der Milchindustrie erwogen. In bestimmten Fällen könnten die RNA-Konservierungsmedien, die die zuvor bestimmten endgültigen Salzkonzentrationen oder übersättigten Salze umfassen, in Paketform geliefert werden. Die Pakete mit RNA-Konservierungssalz oder übersättigtem Salz wären besonders für Feldstudien nützlich, da dort der Raum bzw. die Ressourcen für die Analyseausrüstung eventuell begrenzt sind. Pakete könnten z.B. als zuvor abgemessene und verpackte 1 ml-, 5 ml- oder 10 ml-Probenaliquote geliefert werden. Natürlich könnte jede Paketgröße zur Aufnahme verschiedener Salzmengen entweder als wasserfreies Pulver, wasserhaltiges Pulver, als einzeln verpacktes) Pulver/Flüssigkeit oder als Kombination daraus bereitgestellt werden. Daher würde man zur Konservierung der RNA in einer Probe den Paketinhalt der Probe einfach zugeben und mischen.
  • Bestimmte Vorteile der Verwendung einer RNA-Konservierungszusammensetzung aus festen Komponenten wären die Gewichtseinsparung bei Lagerung und Transport, ein weniger wahrscheinliches Austreten fester Komponenten und ein reduziertes Volumen (d.h. die Konservierung von Proben mit trockenen Reagenzien würde das Endvolumen der Probe auf ein Minimum reduzieren).
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung umfassen die RNA-Konservierungszusammensetzungen weiterhin die Isolierung der konservierten RNA, wobei die RNA bei einer Temperatur von mehr als –20°C isoliert wird. In anderen Ausführungsformen wird die Probe vor der RNA-Isolierung gelagert, wobei die Probe bei Temperaturen von mehr als 0°C gelagert wird.
  • Die Forschung des Erfinders deutet darauf hin, dass 3M Ammoniumsulfat bei pH 7,0 intakte RNA in intakten Gewebeproben bei fast extremen Temperaturen (37°C-42°C) einigermaßen wirksam konserviert. Man geht davon aus, dass Ammoniumsulfat bei Verwendung in der Probe in das Gewebe und die Zellen diffundiert und bewirkt, dass die Zellproteine (wahrscheinlich zusammen mit RNA, die mit vielen verschiedenen Proteinen in vivo eng verbunden ist) in Schutzkomplexen ausfallen. Darüber hinaus kann die sich in den zytoplasmatischen Vesikeln befindliche RNase ebenfalls ausgefällt und für zelluläre RNA unzugänglich gemacht werden.
  • Man glaubt, dass sich der Wirkmodus der beanspruchten Erfindung von dem Wirkmodus des Gemisches von Allewell et al. unterscheidet. Wäre der Wirkmodus der erfindungsgemäßen Lösungen derselbe wie bei Allewell et al., würde man erwarten, dass die RNA, die aus dem in den erfindungsgemäßen Puffern gelagerten Gewebe isoliert worden ist, degeneriert. Allewell et al. berichten, dass RNase mit pH 5 aktiver ist als normal. Würde also RNAlaterTM nach demselben Mechanismus funktionieren, würde man einen Anstieg der RNase-Aktivität erwarten. Offensichtlich würde dies die Fähigkeit der RNA-Konservierungsmedien zur Konservierung von RNA beschränken. Basierend auf der Beobachtung, dass eine solche Dege neration nicht erfolgt, funktioniert die vorliegende Erfindung nach einem anderen Mechanismus als dem von Alleweil et al. beschriebenen.
  • Der Begriff "RNAlaterTM" ist die Handelsbezeichnung von Ambion, Inc. für bestimmte kommerzielle Formulierungen der hierin offenbarten RNA-Konservierungsmedien. Allgemein dient der Begriff "RNAlaterTM" der Bezeichnung der in Beispiel 2 offenbarten Formulierung aus 25 mM Natriumcitrat, 10 mM EDTA und 70 g Ammoniumsulfat/100 ml Lösung, pH 5,2. Dieses Reagens wirkt, indem es die Zellen rasch mit einer hohen Ammoniumsulfatkonzentration infiltriert und eine Massenausfällung von Zellproteinen bewirkt. Bemerkenswerterweise bleibt die Zellstruktur dabei intakt. Der Vorteil hierbei ist, dass die Zellen konserviert und dennoch histologisch identifiziert werden können.
  • Gemäß dem langjährigen Patentgesetz bezeichnen die Worte "ein" und "eine" in Verbindung mit dem Wort "umfassend" in den Ansprüchen oder der Beschreibung ein oder mehrere.
  • Die folgenden Zeichnungen sind Bestandteil der vorliegenden Beschreibung und sind beigefügt, um bestimmte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung weiter aufzuzeigen. Die Erfindung wird besser verständlich anhand einer oder mehrerer dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der hierin dargelegten speziellen Ausführungsformen.
  • 1 – Alkohol und Aceton eignen sich nicht für die Konservierung von Zellproben.
    RNA, isoliert aus über Nacht bei 4°C (Bahnen 1-5) bzw. 37°C (Bahnen 6-10) gelagerter Mäuseleber. Bahnen 1 und 6: Lagerung in Ethanol. Bahnen 2 und 7: Lagerung in angesäuertem Ethanol pH 4,0. Bahnen 3 und 8: Lagerung in Aceton. Bahnen 4 und 9: Lagerung in angesäuertem Aceton pH 4,0. Bahnen 5 und 10: Lagerung in RNAlaterTM.
  • 2 – RNA in frischen Gewebeproben ist labil.
    Frische Proben von Leber (Bahnen 1 und 2), Hoden (Bahnen 3 und 4) und Milz (Bahnen 5 und 6) von Mäusen wurden 12 Stunden lang bei 4°C entweder in RNA laterTM (Bahnen 2, 4 und 6) (25 mM Natriumcitrat, 10 mM EDTA und 70 g Ammoniumsulfat/100 ml Lösung pH 5,0) oder in eine 4M RNA-Extraktionslösung auf der Basis von Guanidiniumisothiocyanat (GITC) (Bahnen 1, 3 und 5) gelegt. Die RNA wurde extrahiert und mittels Gelelektrophorese analysiert. Intakte RNA wurde nur in den Bahnen beobachtet, die den in RNAlaterTM konservierten Geweben entsprachen (Bahnen 2, 4 und 6).
  • 3 – Definition des wirksamen Konzentrationsbereiches des RNA in Gewebe schützenden Ammoniumsulfats.
    Fragmente frisch isolierter Mäuseleber wurden in RNAlaterTM mit verschiedenen Mengen Ammoniumsulfat gelegt. Die Proben enthielten 0, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% bzw. 70% Ammoniumsulfat (Bahnen 1-7). Nach 24-stündiger Inkubation bei 4°C wurde die RNA aus der Probe extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 4 – Verstärkung der Potenz von RNAlaterTM bei extremen Temperaturen durch Optimierung von pH und Ammoniumsulfatkonzentrationen.
    Die Wirkung von pH und Ammoniumsulfat bei extremen Temperaturen wurde bewertet. Frische Mäuseleber wurde bei Raumtemperatur bzw. 37°C über 24 Stunden in 4 Formulierungen der RNAlaterTM-Lösung gelagert. Bahn 1: pH 7,0, 70 g/100 ml Ammoniumsulfat, Bahn 2: pH 5,0, 55 g/100 ml Ammoniumsulfat, Bahn 3: Original-RNAlaterTM-Formulierung (mit 55 g/100 ml Ammoniumsulfat, pH 7,0), Bahn 4: pH 5,0, Konzentration 70 g/100 ml Ammoniumsulfat.
  • 5 – Spezifität von Ammoniumsulfat bei der Wirksamkeit von RNAlaterTM.
    Tafel A und B: Frische Leberproben wurden über 3 Tage in 5 Puffern bei 25°C (5A) bzw. 37°C (5B) mit RNAlaterTM plus Ammoniumcarbonat (Bahn 1), RNAlaterTM plus Ammoniumchlorid (Bahn 2), RNAlaterTM plus Kaliumsulfat (Bahn 3), RNAlaterTM plus Magnesiumsulfat (Bahn 4) und RNAlaterTM plus Ammoniumsulfat (Bahn 5) inkubiert. 5C: Frische Leber wurde über Nacht bei 4°C in RNAlaterTM plus Cäsiumchlorid (Bahn 1), RNAlaterTM plus Cäsiumsulfat (Bahn 2) und RNAlaterTM plus Ammoniumsulfat (Bahn 3) inkubiert.
  • 6 – RNA, isoliert aus bei 4°C in RNAlaterTM gelagerten Säugetiergeweben.
    Frisches Hirn, Herz, Niere, Leber und Milz von Mäusen (Bahnen 1-5) wurden in eine RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 4°C gelagert. Nach einer Inkubation von einer Woche (6A), zwei Wochen (6B) bzw. 4 Wochen (6C) wurde die RNA aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 7 – RNA, isoliert aus bei Umgebungstemperatur (25°C) in RNAlaterTM gelagerten Säugetiergeweben.
    Frisches Hirn, Herz, Niere, Leber und Milz von Mäusen (Bahnen 1-5) wurden in eine RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 25°C (Umgebungstemperatur) gelagert. Nach einer Inkubation von zwei Wochen (7B) bzw. 4 Wochen (6C) wurde die RNA aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 8 – RNA, isoliert aus bei extremen Temperatur (37°C) in RNAlaterTM gelagerten Säugetiergeweben.
    Frische Leber, Niere und Milz von Mäusen wurden in eine RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 37°C gelagert. Nach 3-tägiger Inkubation wurde die RNA aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • 9 – Verwendung von Ambion zur Herstellung von RNA aus in RNAlaterTM konservierten Geweben.
    Die Bahnen 1-3 sind Leber, Herz und Niere plus ToTally RNATM, die Bahnen 4-6 sind Leber, Herz und Niere plus RNAqueousTM. Frische Proben von Leber (Bahnen 1 und 4), Herz (Bahnen 2 und 5) und Niere (Bahnen 3 und 6) von Mäusen wurden in eine RNAlaterTM-Lösung gelegt und über Nacht bei 4°C gelagert. Die RNA wurde aus gleich großen Proben entweder mittels des ToTally RNATM-Kits von Ambion (Bahnen 1-3) oder mittels des RNAqueousTM-Kits von Ambion (Bahnen 4-6) extrahiert. Bahn 1 diente als Molekulargewichtsmarker.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und stellt neue Verfahren und Reagenzien zur Konservierung und zum Schutz des Ribonukleinsäure (RNA)-Gehalts RNA-haltiger Proben vor Degeneration vor der RNA-Isolierung bereit. Auffallenderweise erfolgt dies ohne Lagerung bei Ultraniedrigtemperatur oder Zerstörung der Proben. Isoliertes humanes Biopsiegewebe z. B. kann in ein RNA-Konservierungsmedium gelegt und gekühlt über einen längeren Zeitraum gelagert werden, bis der Forscher Zeit hat, die RNA zwecks Analyse zu extrahieren.
  • Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen den Nutzen der vorliegenden Erfindung. In allen Beispielen werden frisches Gewebe aus Tieren oder Pflanzen, lebende Zellen in Suspension oder andere RNA-haltige Proben verwendet. Die Verfahren und Zusammensetzungen eignen sich zur Konservierung von RNA aus einer großen Palette von Bakterien-, Pflanzen- und Tierspezies inklusive dem Menschen. In diesen Experimenten rückgewonnene RNA-Proben wurden mittels Formaldehyd/Agarose-Gelelektrophorese, Färben mit Ethidiumbromid und Belichtung mit 300 nm ultraviolettem Licht (beschrieben in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al. ) analysiert.
  • Die Beispiele sollen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen. Der Fachmann sollte erkennen, dass die in den nachfolgenden Beispielen offenbarten Techniken vom Erfinder entdeckte Techniken darstellen, die in der Praxis der Erfindung gut funktionieren und daher als bevorzugte Ausführungsmodi gelten können.
  • Beispiel 1
  • Kriterien für die Analyse von RNA zur Ermittlung ihrer "Intaktheit"
  • Der Erfinder führt routinemäßig RNA-Tests durch, mit deren Hilfe bewertet wird, ob solche Proben intakt sind. Dieses Kriterium wurden in den nachfolgenden Beispielen angewandt, um die Qualität der RNA, die aus den in RNAlaterTM, anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien oder anderen Lösungen konservierten Geweben rückgewonnen wurde, objektiv zu bewerten.
  • RNA wird mittels Elektrophorese auf Formaldehydagarosegel unter Verwendung des in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Maniatis, Fritsch, Sambrook, Hrsg., Cold Spring Harbor Press) beschriebenen Basisprotokolls analysiert. Um die RNA in dem Gel sichtbar zu machen, wird den Proben der interkalierende Farbstoff Ethidiumbromid zugegeben. Ethidiumbromid fluoresziert bei Interkalation in Nukleinsäure unter ultraviolettem Licht und erlaubt die Sichtbarmachung der Nukleinsäure. Intakte RNA erscheint als breiter Ausstrich heterogener mRNA (0,5 bis etwa 10 kb) mit zwei sehr auffallenden, einzelnen Banden (28S und 18S ribosomale RNA), die den Hintergrundausstrich im Verhältnis 2:1 überlagern. Es dürfte sehr wenig Hinweise auf diskrete Banden mit einer Größe zwischen 18S und 28S RNA geben. Teilweise degenerierte RNA ist durch einen Verlust hochmolekularer heterogener RNA, verschiedene kleinere ribosomale RNA-Spaltprodukte und eine Abweichung vom 2:1-Verhältnis von 28S zu 18S (28S degeneriert leichter) gekennzeichnet. Stark degenerierte RNA hat ein 28S:18S-Verhältnis kleiner als 1:1 und weist einen Ausstrich degenerierter ribosomaler RNA von etwa 2 bis < 0,1 kb auf.
  • Der Begriff "teilweise degeneriert", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, bedeutet, dass das Verhältnis von 28S:18S rRNA abweicht und unter Umständen nur noch 1:1 beträgt, die rRNA-Banden jedoch noch immer deutlich sind.
  • Der Begriff "größtenteils degeneriert", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, bedeutet, dass das Verhältnis von 28S:18S unter 1:1 liegt. 28S ist möglicherweise kaum sichtbar, doch es ist immer noch Nukleinsäure in einem sich von der ungefähren Position von 28S rRNA nach unten erstreckenden Ausstrich enthalten.
  • Die Begriffe "vollständig degeneriert" und "degeneriert", wie sie in dieser Beschreibung verwendet werden, bedeuten, dass die RNA nur in einem Ausstrich mit niedrigem Molekulargewicht unterhalb der normalen Position von 18S rRNA vorliegt.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines exemplarischen RNAlaterTM-RNA-Konservierungsmediums Die Beschreibung in diesem Beispiel stellt eine Art und Weise dar, in der sich
  • RNAlaterTM herstellen lässt. Erstens sollte man folgende Stammlösungen und Reagenzien herstellen oder gewinnen: 0,5M EDTA-Dinatrium/Dihydrat (18,61 g/100 ml, pH mit NaOH unter Rühren auf 8,0 eingestellt); 1M Natriumcitrat-Trinatriumsalz/Dihydrat (29,4 g/100 ml, Rühren bis zur Lösung); Ammoniumsulfat, pulversiert; steriles Wasser.
  • In einem Becher werden 40 ml 0,5M EDTA, 25 ml 1M Natriumcitrat, 700 g Ammoniumsulfat und 935 ml steriles destilliertes Wasser kombiniert und auf einem Heizplattenrührer bei niedriger Hitze bis zur vollständigen Auflösung des Ammoniumsulfats gerührt. Nach dem Abkühlen wird der pH der Lösung mit 1M H2SO4 auf pH 5,2 eingestellt, die Lösung in eine Flasche mit Schraubverschluss übertragen und diese entweder bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank gelagert.
  • Beispiel 3
  • Exemplarische allgemeine Art und Weise der Konservierung von Gewebe in RNA-Konservierungsmedien
  • Gewebeproben, die in RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien gelagert werden sollen, sollten so schnell wie möglich aus der Quelle ausgeschnitten und in RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien gelegt werden. Manche Gewebeproben können eine Schutzmembran oder eine andere Barriere aufweisen, die die rasche Infusion von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien behindert, z.B. die wachsartige Beschichtung eines Blattes oder die Kapsel einer Niere oder eines Hodens. Diese Schutzbarrieren sollten zerstört werden, um eine rasche Infiltration von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien in die Probe zu erlauben. Darüber hinaus sollten große Proben in kleinere Fragmente zerlegt werden, um die Diffusion zu maximieren. Als generelle Richtlinie wäre die Dicke der Probe auf 0,5 cm in mindestens zwei Dimensionen beschränkt. Proben, die aus Zellen in Suspension bestehen, sollten durch leichtes Zentrifugieren mit Erdbeschleunigung auf ein kleines Volumen, das ausreicht, die Zellen ohne Beschädigung zu pelletieren, konzentriert, in einem Minimalvolumen des entfernten Überstandes erneut suspendiert und anschließend mit 5 Volumina RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien gemischt werden (v/v). Ist eine Konzentration nicht möglich, sollte die Zellsuspension in 10 Volumina RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien verdünnt werden. Alternativ kann jedes andere Volumen flüssiger, essentieller Medien bzw. jede Menge einer festen RNA-Konservierungszusammensetzung, die zu einer Konservierung der RNA führt, verwendet werden. Da der Puffer die Zellen nicht zerstört, kann die Konzentration durch Zentrifugieren später erfolgen.
  • Proben, die eine Woche oder weniger gelagert werden sollen, können bei Umgebungstemperatur (25°C) gelagert werden. Für eine längere Stabilität sollten die Proben im Kühlschrank gelagert werden. Für eine dauerhafte Archivlagerung (Monate bis Jahre) können die Proben in einem normalen Gefrierschrank (–20°C) gelagert werden. Zur Isolierung der RNA aus den behandelten Proben sollten die Gewebeproben direkt in den Gewebeextraktionspuffer übertragen werden. Zellen in Suspension müssen mittels Zentrifugieren pelletiert und anschließend erneut in RNA-Extraktionspuffern suspendiert und verarbeitet werden.
  • Beispiel 4
  • RNA in frischen Gewebeproben ist labil
  • Frische Proben von Leber, Hoden und Milz von Mäusen (etwa 0,5 cm3) wurden über 12 Stunden bei 4°C entweder in RNAlaterTM oder in eine 4M RNA-Extraktionslösung auf Basis von Guanidiniumisothiocyanat (GITC) oder Wasser gelegt. Diese Guanidiniumlösung ist ein typischer RNA-Extraktionspuffer (enthalten in den im Handel erhältlichen ToTally RNATM- und RNAqueousTM-Kits von Ambion). GITC ist ein starkes Chaotropikum, das entweder allein oder in Verbindung mit anderen Reagenzien in praktisch allen RNA-Isolierungsprotokollen verwendet wird. Nach der Inkubation über Nacht wurde die RNA aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert. Intakte RNA wurde nur in den Bahnen beobachtet, die den in RNAlaterTM konservierten Geweben entsprachen. RNA, die aus in GITC gelagerten Proben extrahiert wor den waren, war stark degeneriert. Daher konserviert GITC die RNA in intakten Gewebeproben nicht. In Wasser oder biologischen Puffern wie normaler Salzlösung gelagerte tierische Gewebe lieferten keine messbare RNA nach einer identischen Inkubation über Nacht. Die Daten sind in 2 dargestellt.
  • Beispiel 5
  • Ermittlung der Ammoniumsulfatkonzentration, die RNA in Gewebe wirksam schützt
  • Frisch isolierte Mäuseleber wurde in eine Vielzahl mutmaßlicher RNA-Konservierungsmedien mit verschiedenen Ammoniumsulfatkonzentrationen gelegt. Die Proben enthielten 0, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% bzw. 70% Ammoniumsulfat. Nach 24-stündiger Inkubation bei 4°C wurde die RNA aus der Probe extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • In der Probe ohne Ammoniumsulfat wurde lediglich ein Ausstrich mit niedrigem Molekulargewicht beobachtet. Spezifische Banden ribosomaler RNA konnten nicht beobachtet werden. Bei 10% Ammoniumsulfat konnten geringe Hinweise auf rRNA-Banden beobachtet werden. Bei 20% Ammoniumsulfat war die 18S-Bande deutlicher und der Ausstrich degenerierter 28S-rRNA, die sich von der erwarteten Position der 28S-rRNA nach unten erstreckt, stärker. Eine spezifische 28S-Bande wurde nicht beobachtet. Bei 30% Ammoniumsulfat war zwar die 28S- und die 18S-rRNA-Bande sichtbar, doch es lag eine ausgedehnte Degeneration vor (basierend auf dem abweichenden Verhältnis von 28S:18S) und es wurden zahlreiche kleinere Banden beobachtet. Die Probe mit 40% Ammoniumsulfat schien größtenteils intakt, die Ausbeute war 10 Mal höher als bei 30%. Diese Experimente deuten zwar auf eine Minimalanforderung von 30-40% Ammoniumsulfat für den Schutz der Gewebe-RNA, doch die wirksame Konzentration hängt von dem Gewebetyp, der Größe des Gewebefragmentes, der Lagertemperatur und der Lagerdauer ab.
  • Unter stringenteren Inkubationsbedingungen ist eine höhere Ammoniumsulfatkonzentration für die Konservierung der RNA notwendig. Zum Schutz der RNA in Gewebeproben sind bei 25°C zum Beispiel 55 g/100 ml erforderlich und, wie in Beispiel 6 beschrieben, sind bei 37°C anscheinend 70 g/100 ml für den maximalen Schutz der RNA in Gewebeproben erforderlich. Außerdem liefern zumindest eini ge Studien bei Lagerung der Proben in 55 g oder weniger Ammoniumsulfat bei 37°C über 24 Stunden teilweise degenerierte RNA, wie aus einem 1:1-Verhältnis von 28S:18S-rRNA geschlossen werden kann. Die Daten sind in 3 dargestellt.
  • Beispiel 6
  • Verstärkung der Potenz der RNA-Konservierungsmedien bei extremen Temperaturen durch Optimierung von pH und Ammoniumsulfatkonzentrationen
  • Die Wirkung von pH und Ammoniumsulfat bei extremen Temperaturen wurde bewertet. Frische Mäuseleber wurde in 4 Formulierungen der Testlösung der RNA-Konservierungsmedien gelegt und bei Raumtemperatur bzw. 37°C über 24 Stunden gelagert. Die RNA wurde aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Formulierung, die 55 g/100 ml Ammoniumsulfat mit pH 7,0 enthielt, war bei Raumtemperatur wirksam, schützte die RNA aber bei 37°C nicht vollständig. Eine Kombination aus niedrigem pH (5,0) und einer höheren Ammoniumsulfatkonzentration (70 g/100 ml) war bei hohen Temperaturen wesentlich wirksamer als die Originalformulierung und lieferte nach 3 Tagen bei 37°C intakte RNA. Keine der Modifikationen (niedriger pH oder höhere Ammoniumsulfatkonzentration) alleine verstärkte die Stabilität der RNA wesentlich über die der Originalformulierung hinaus. Die Daten sind in 4 dargestellt.
  • Beispiel 7
  • Spezifität von Ammoniumsulfat bei der Wirksamkeit von RNA-Konservierungsmedien
  • Es wurden vier weitere Formulierungen der Test-RNA-Konservierungsmedien hergestellt. Das Ammoniumsulfat wurde durch sättigende Mengen Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid, Kaliumsulfat oder Magnesiumsulfat ersetzt. Frische Leberproben wurden in diesen Puffern 3 Tage lang bei 25°C bzw. 37°C inkubiert. Die RNA wurde extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert. Lediglich die Ammoniumsulfatsteuerung verhinderte eine Degeneration der RNA. Ein maximaler Schutz scheint hohe Konzentrationen von Ammonium- und Sulfationen zu erfordern. Ammoniumsulfat ist wahrscheinlich das wirksamste der getesteten Salze, da es in Wasser weitaus löslicher ist als die anderen Salze und Formulierungen mit sehr hohem Salzgehalt ermöglicht. Diese Hypothese wurde durch die Bewertung zweier esoterischer (und teurerer) Salze, Cäsiumsulfat (welches relativ löslich ist – Sättigung bei 362 g/100 ml) und Cäsiumchlorid (70 g/100 ml), in Frage gestellt. Diese Salze ersetzten (in gleicher Menge) das Ammoniumsulfat in der in Beispiel 2 beschriebenen Lösung und den zuvor verarbeiteten Leberproben. Cäsiumsulfat und Cäsiumchlorid ermöglichten einen Teilschutz der Leber-RNA bei 4°C. Zusammengefasst deuten die Daten darauf hin, dass von den getesteten Salzen Ammoniumsulfat RNA vor der Degeneration in intakten Geweben überlegen schützen kann. Der Teilschutz, der nach Meinung der Erfinder auf den hohen Konzentrationen anderer Salze beruht, deutet jedoch auf einen gemeinsamen Wirkmechanismus mit variierendem Wirkungsgrad hin. Die Daten sind in 5 dargestellt.
  • Beispiel 8
  • RNA, isoliert aus bei 4°C in RNAlaterTM gelagerten Säugetiergeweben
  • Frische Proben von Gehirn, Herz, Niere, Leber und Milz von Mäusen wurden in eine wie gemäß der Lehre von Beispiel 2 hergestellte RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 4°C gelagert. Nach einer Inkubation von 1, 2 bzw. 4 Wochen wurde die RNA aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese analysiert. Sämtliche RNA-Proben waren intakt. Frische Proben von Gehirn, Niere, Leber und Milz von Mäusen wurden in 10 Volumina RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 4°C gelagert. Nach einer Inkubation von 1, 2 bzw. 4 Wochen wurden Gewebefragmente äquivalenten Gewichts entfernt und verarbeitet. Die Gewebeproben wurden einzeln in eine Guanidiniumisothiocyanat-Lyselösung gelegt, homogenisiert und mit Hilfe des RNAqueousTM-Kits von Ambion (wie in Beispiel 20 beschrieben) isoliert. Die RNA-Konzentration wurde durch Messen der Extinktion bei O.D.260 ermittelt. Die RNA wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, mittels Formaldehyd/Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
  • Sämtliche RNA-Proben wurden basierend auf sauberen, scharfen Banden ribosomaler RNA in einem 2:1-Verhältnis von 28S:18S als "intakt" bewertet. Darüber hinaus wurde die Gesamtqualität mit Hilfe eines sichtbaren Hintergrundausstrichs heterogener RNA und fehlender sichtbarer Zersetzungprodukte aus ribosomaler RNA bewertet. Die Daten sind in 6 dargestellt.
  • Beispiel 9
  • RNA, isoliert aus bei Umgebungstemperatur (25°C) in RNAlaterTM gelagerten Säugetiergeweben
  • Frische Proben von Gehirn, Herz, Niere, Leber und Milz von Mäusen wurden in eine RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 25°C (Umgebungstemperatur) gelagert. Nach einer Inkubation von 2 bzw. 4 Wochen wurde die RNA aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese wie zuvor beschrieben analysiert. Die nach zwei Wochen rückgewonnene RNA war intakt. Die nach 1-monatiger Inkubation rückgewonnene RNA war gemäß Bewertung des Aussehens der 18S- und 28S-Banden der ribosomalen RNA noch immer zu etwa 50% intakt. Die Daten sind in 7 dargestellt.
  • Beispiel 10
  • RNA, isoliert aus bei extremen Temperaturen (37°C) in RNAlaterTM gelagertem Säugetiergewebe
  • Frische Proben von Leber, Niere und Milz von Mäusen wurden in eine RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 37°C gelagert. Nach 3-tägiger Inkubation wurde die RNA aus den Gewebeproben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese wie zuvor beschrieben analysiert. Die isolierte RNA war intakt. Die RNA, die aus 1 Woche bis 10 Tage inkubierten Geweben isoliert wurde, ist teilweise degeneriert (zu etwa 50% intakt). Diese RNA ist noch immer ein geeignetes Substrat für Nukleaseschutztests oder RT-PCR (reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion), beides Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Die Daten sind in 8 dargestellt.
  • Beispiel 11
  • RNA, isoliert aus bei 4°C in RNAlaterTM gelagertem Gewebe von Amphibien Fischen, Insekten, Bakterien und Pflanzen
  • Der Erfinder testete die Wirksamkeit von RNAlaterTM bei der Konservierung von RNA in Xenopusherz und -leber, Goldfischleber, einem ganzen Käfer, einer ganzen Drosophila, E. coli, Tabak und Luzerne. Sie wurden jeweils in eine RNAlaterTM-Lösung gelegt und bei 4°C gelagert. Nach 24-stündiger Inkubation wurde die RNA aus den Proben extrahiert und mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Sämtliche RNA erschien intakt. Dies belegt die Wirksamkeit von RNAlaterTM als für Gewebe verschiedener Organismen nützliches allgemeines Reagens.
  • Beispiel 12
  • Nachweis der Eignung von RNAlaterTM-RNA als Target der Northern-Blot-Hybridisierungsanalyse
  • Frische Proben von Leber, Niere und Milz von Mäusen wurden 24 Stunden lang bei 25°C bzw. 37°C inkubiert. Die RNA wurde extrahiert, mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese erneut gelöst, auf eine positiv geladene Nylonmembran (Brightstar PlusTM, Ambion, Austin, Texas) übertragen und mit einer radioaktiv markierten Antisense-β-Actin-RNA-Sonde gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Northern MaxTM-Kit, Ambion, Austin, Texas) hybridisiert. Das diskrete Signal, das dem in allen Proben nachgewiesenen β-Actintranskript von 1,8 kb entspricht, deutet darauf hin, dass die Boten-RNA in sämtlichen Proben vollständig intakt und für die Hybridisierung durch Northern-Blot-Analyse verfügbar war.
  • Beispiel 13
  • Eignung von RNAlaterTM-RNA als Schablone für die RT-PCR-Analyse
  • RNA, die aus in RNAlaterTM bei 37°C 24 Stunden lang gelagerter Leber, Milz, Niere und Hoden von Mäusen hergestellt worden war, wurde als Schablone für die RT-PCR von zwei PCRTM-Primer-Paaren für konstitutiv exprimierte Gene (House keeping-Gene Cyclophilin und RIG/S15) bei einer Multiplex-RT-PCR-Amplifikation verwendet. In allen Fällen erhielt man die erwarteten Produkte (Cyclophilin mit 216 Basenpaaren, RIG/S15 mit 324 Basenpaaren). Daher eignet sich die rückgewonnene RNA für die RT-PCR-Analyse.
  • Beispiel 14
  • Verwendung der RNA-Konservierungsmedien zum Schutz klinischer Proben
  • Es besteht ein wachsender Trend zur genetischen Analyse humaner klinischer Proben mittels RT-PCR. Zu diesen klinischen Proben gehören feste Tumore, isolierte Zellen, Serum, Urin, Blut oder Kot. Biopsien fester Tumore werden häufig zur Expression spezifischer Indikatorgene wie p53, dessen abweichende Expression eine zentrale Rolle bei einer Reihe von Krebsarten spielt, analysiert. Aus normalem oder leukämischem Blut gewonnene weiße Blutzellen werden häufig bezüglich der Expression von Interleukingenen analysiert. Urin, Blut, Serum, Plasma und Kot werden häufig auf die Anwesenheit pathogener Organismen hin analysiert. Bei einem erwarteten Verwendungszweck können RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien als Haltepuffer für in einem klinischen Umfeld isolierte Patientenmuster verwendet werden. Die RNA in diesen Proben wäre dann bis zur Übertragung der Proben in ein Laborumfeld, wo intakte RNA zur Analyse extrahiert wird, geschützt. Bei einem erwarteten Verwendungszweck können RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien zur Stabilisierung normalerweise instabiler viraler RNA (z.B. HIV) in Blutprodukten zur anschließenden Diagnose verwendet werden.
  • Beispiel 15
  • Verwendung von RNA-Konservierungsmedien zur Konservierung von Feldmustern
  • Feldbiologen auf der ganzen Welt stehen dem gemeinsamen Problem gegenüber, wie die vor Ort gesammelten Proben für die spätere Analyse im Labor konserviert werden können. Oft wird die Erforschung der RNA-Expression aufgrund der logistischen Schwierigkeiten beim Gefrorenhalten der Muster in Trockeneis oder flüssigem Stickstoff einfach vermieden. Bei einem erwarteten Verwendungszweck kön nen RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien von Wissenschaftlern, die Proben bis zu einer späteren Rückführung in die Laborumgebung konservieren müssen, als Haltepuffer für vor Ort isolierte Muster verwendet werden. Ein wichtiger Nutzen von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien ist, dass kleine Muster (z.B. Mikroorganismen) intakt bleiben. Daher können komplexe Muster wie z.B. eine aus Wasserproben isolierte Mikroorganismenpopulation en masse konserviert, im Labor nach Klassifikation sortiert und anschließend zur Genexpression analysiert werden.
  • Beispiel 16
  • Verwendung von RNA-Konservierungsmedien als Präparationsmedium
  • Biologen müssen häufig eine komplizierte Präparation durchführen, um ein Muster für die RNA-Analyse zu isolieren. Oft bedeutet die Zeitverzögerung, dass die aus der Probe isolierte RNA eine schlechte Qualität aufweist. Entwicklungsbiologen, die die frühe Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen, müssen zur Isolierung früher Embryos aus der Dezidua des Uterus peinlich genaue Präparationen durchführen. In einem anderen Beispiel müssen Neuroanatomen komplizierte Präparationen durchführen, um einen speziellen Teil eines Gehirns zur RNA-Analyse zu entfernen. Bei einem erwarteten Verwendungszweck wären RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien ein sehr wirksames Präparationsmedium. Durch Eintauchen einer Probe in RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien wird die RNA bei der Präparation geschützt und die Probenintegrität gleichzeitig bewahrt (andere Reagenzien wie z.B. Guanidinium würden eine umfangreiche Zelllyse bewirken und die Präparation gefährden). Die Verwendung von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien würde eine längere Präparation einer Probe ohne die Angst vor einer Degeneration der RNA in der Probe erleichtern.
  • Beispiel 17
  • Verwendung von RNA-Konservierungsmedien zur Konservierung von Proben bei Tests auf Krankheitserreger
  • Die Nukleinsäureanalyse für den Nachweis und die Klassifizierung pathogener Organismen ist eine schnell wachsende Technologie. Bei einem erwarteten Verwendungszweck können RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien als Haltepuffer für von Gesundheitsinspektoren vor Ort gesammelte Muster verwendet werden. Durch Legen der Proben in RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien würde die RNA in den Proben konserviert. Die Proben könnten dann mittels Nukleinsäuretechnologie auf das Vorhandensein pathogener Organismen getestet werden. Ein USDA-Inspektor könnte beispielsweise Fleischproben aus einem Schlachthaus sammeln und sie in RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien legen. Die RNA in pathogenen Organismen auf der Oberfläche der Probe würde intakt konserviert bleiben. Das Fleisch kann später aus der Probe entfernt, die Krankheitserreger aus RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien rückgewonnen und die RNA zur Analyse isoliert werden. Ein wichtiges Merkmal von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien ist, dass sie Bakterien abtöten, aber nicht zur Zelllyse führen. Daher verändert sich der Titer pathogener Organismen während der Lagerung der Proben nicht und die offensichtliche Anzahl wird nicht verzerrt; außerdem können die Proben auch mikroskopisch auf zusätzliche Informationen hin analysiert werden.
  • Beispiel 18
  • Verwendung von RNA-Konservierungsmedien zur Konservierung von Krankheitserregern
  • Jedes Jahr werden Tausende von Mustern gelagert und auf Trockeneis zu Zentrallabors geschickt, die eine RNA-Analyse zum Nachweis von Krankheitserregern durchführen. Bei einem erwarteten Verwendungszweck können RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien als Transportpuffer für die Konservierung der RNA in infektiösen Krankheitserregern verwendet werden.
  • RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien erlauben den Transport der Proben bei (oder nahe) Umgebungstemperatur ohne Angst vor einer RNA-Degeneration. Eine Organisation, die sowohl von dem zusätzlichen Schutz, den RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien bieten, als auch von signifikanten Einsparungen bei den Transportkosten profitieren würde, ist The Centers For Disease Control (CDC), die viele Proben von Mensch und Tier zum Test auf Krankheitserreger erhält.
  • Beispiel 19
  • Verwendung von RNA-Konservierungsmedien bei der FACS-Sortierung
  • Bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) handelt es sich um ein Verfahren, bei dem Zellen in Suspension aufgrund von Unterschieden der Zelloberflächenmarker getrennt werden können. Wir erwarten die Verwendung von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien als Suspensionslösung für Zellen, die durch eine FACS-Vorrichtung laufen sollen. Auf diese Weise würde die RNA in den Zellen konserviert. Sobald die Zellen sortiert sind, kann intakte RNA für die Analyse isoliert werden.
  • Beispiel 20
  • Verwendung von RNA-Konservierungsmedien zur Konservierung von Bodenbakterien
  • Mit der Entwicklung der RT-PCR-Methodik zur Identifizierung von Bakterienspezies besteht ein wachsender Bedarf an Verfahren zur Isolierung von Bodenbakterien aus Erde für die anschließende RNA-Isolierung. Bakterien-RNA ist jedoch extrem labil und degeneriert während des Isolierungsprotokolls rasch. Ein erwarteter Verwendungszweck von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien ist ein erster Schritt bei der RNA-Isolierung aus Bodenbakterien. Die Erde kann in RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien dispergiert werden, was zu einem unverzüglichen Schutz der RNA in den Bakterien führt, die Bakterien jedoch intakt gehalten werden. Die Erde kann dann durch Zentrifugieren mit niedriger Drehzahl sicher entfernt werden; anschließend können die Bakterien durch Zentrifugieren mit höherer Dreh zahl rückgewonnen werden. RNAlaterTM oder andere erfindungsgemäße RNA-Konservierungsmedien verhindern, dass die RNA während des Isolierungsverfahrens degeneriert.
  • Beispiel 21
  • Verfahren zur Isolierung von in RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien konservierter RNA
  • Mehrere Verfahren zur Isolierung von RNA aus Gewebeproben wurden mittels in RNA-Konservierungsmedien konserviertem Gewebe bezüglich ihrer Eignung bewertet. Mehrere solche Verfahren können mit Kits von Ambion durchgeführt werden. Die Kits von Ambion sind natürlich für die Isolierung von RNA aus in RNA-Konservierungsmedien konservierten Geweben nicht erforderlich, und die Verwendung anderer Verfahren, oder Kits zur Isolierung von RNA aus in RNA-Konservierungsmedien konservierten Geweben und Zellen ist durch die vorliegende Beschreibung abgedeckt. Diesbezüglich können beispielsweise alle bekannten Verfahren zur Isolierung von RNA, z.B. die von Boom et al. (selektive Bindung und Retention von Nukleinsäure an Glasmatrix – QiaprepTM, Qiagen, Inc.), Chomczynski et al. (TrizolTM, MRC), Macfarlane et al. (Catrimox 14TM, Iowa Biotechnology, Inc.), Bugos et al. (Guanidin:Lithiumchlorid) oder Auffray et al. (LiCl:Harnstoffextraktion) oder Kits zur Durchführung solcher Verfahren eingesetzt werden.
  • Die nachfolgenden speziellen Beispiele beschreiben die Verwendung von Ambion-Kits zur Isolierung von RNA aus in RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien gelagerten Gewebeproben oder Zellen. Es wird erwogen, dass Ambion sich eventuell zum Verkauf eines kombinierten Kits für die Konservierung von RNA in Gewebeproben oder Zellen und die anschließende Isolierung der RNA aus diesen Proben entschließt.
  • Beispiel 22
  • Isolierung von Zell-RNA aus in RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien konservierten Proben mit Hilfe des ToTally RNATM-Kits von Ambion
  • Das ToTally RNATM-Kit von Ambion ist ein Guanidinium/Säurephenol-Verfahren zur Herstellung von Zell-RNA.
  • Um den Nutzen der Konservierung einer Gewebeprobe mit einer Kombination aus RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien und dem ToTally RNATM-Verfahren zu belegen, wurden in RNAlaterTM gelagerte Gewebeproben entnommen und in 10 Volumina einer Guanidiniumisothiocyanat-Lyselösung aus 4M Guanidiniumhydrochlorid, 0,5% Sarcosin, 25 mM Natriumcitrat und 0,1M 2-Mercaptoethanol homogenisiert. Die Proteine werden durch Extraktion mit gleichen Volumina Phenol:Chloroform (1:1) und anschließendes Zentrifugieren zur Trennung der wässrigen und der organischen Phase entfernt. Die wässrige Phase wird rückgewonnen und ein zweites Mal mit Phenol bei pH 4,7 extrahiert. Diese zweite Extraktion teilt die verbleibenden Proteine in der organischen Phase ab und der niedrige pH zwingt die DNA in die organische Phase. Die RNA verbleibt in der wässrigen Phase. Die wässrige Phase wird durch Zentrifugieren rückgewonnen. Die RNA wird durch Ausfällen mit 0,3M Natriumacetat und 2,5 Volumina Ethanol aus der wässrigen Phase rückgewonnen. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt.
  • Beispiel 23
  • Isolierung von Zell-RNA aus in RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien konservierten Proben mit Hilfe des RNAgueousTM-Kits von Ambion
  • Das RNAqueousTM-Kit von Ambion ist ein Guanidiniumlyseverfahren zur Isolierung von RNA, das keine organischen Lösungsmittel benötigt. Stattdessen basiert es auf der selektiven Adsorption von RNA auf einem Glasfaserfilter.
  • Um den Nutzen der Kombination des RNAqueousTM-Kits von Ambion mit RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien zu belegen, wurden in RNAlaterTM gelagerte Gewebeproben entnommen, direkt in die Guanidiniumisothiocyanat-Lyselösung in RNAqueousTM übertragen und homogenisiert. Das Homogenat wurde auf einen Glasfaserfilter aufgetragen und mit mehreren Puffern, die Protein und DNA entfernen, gewaschen. Die reine RNA wurde anschließend mit Wasser aus dem Filter eluiert. Die Kopplung von RNAlaterTM oder anderen erfindungsgemäßen RNA-Konservierungsmedien mit RNAqueousTM besitzt den Vorteil, dass während des gesamten Verfahrens keine ätzenden oder krebserregenden organischen Reagenzien (Phenol, Chloroform, Ethanol, Essigsäure, usw.) verwendet werden. Frische Proben bzw. in RNAlaterTM konservierte Proben wurden in 10 Volumina einer Lösung aus 4M Guanidiniumhydrochlorid, 1 % Sarcosin, 25 mM Natriumcitrat, 0,1M 2-Mercaptoethanol und 2% Triton X-100 homogenisiert. Das Homogenat wird zweimal verdünnt und über einen Glasfaserfilter geleitet. Unter diesen Bedingungen binden sich Nukleinsäuren an den Filter und die Proteine werden ausgewaschen. Mehrere aufeinander folgende Waschgänge mit hohem Salz- und Ethanolgehalt waschen die DNA selektiv aus und hinterlassen nur die an den Filter gebundene RNA. Die RNA wird nachfolgend durch Elution mit heißem Wasser rückgewonnen. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt.
  • Beispiel 24
  • Verwendung von fester RNAlaterTM zur Konservierung von Nukleinsäure in flüssigen Proben
  • Die festen Komponenten der bevorzugten RNA-Konservierungszusammensetzung können zur Stabilisierung direkt in einer flüssigen Probe gelöst, einem Probe/Flüssigkeit-Gemisch zugegeben oder einer Probe, die vor dem Sammeln einer Probe oder eines Probe/Flüssigkeit-Gemisches in eine Flüssigkeit gegeben wurde oder in einem Sammelbehälter vorliegt, zugegeben werden.
  • Die festen Komponenten können in einem Trockenmischer so zu der entsprechenden Zusammensetzung gemischt werden, dass die bevorzugte Salz-, Puffer- und Chelatbildnerkonzentration in Lösung bei Zugabe zu einer wässrigen Probe und Lösen erreicht wird. Die zuvor abgemessenen Aliquote pulverisierter, trocke ner Komponenten können in Probensammelbehälter gegeben und ein geeignetes Probenvolumen hinzu gegeben werden. Der Sammelbehälter würde dann gerührt, wobei sich die RNAlaterTM-Komponenten in der Lösung lösen. Dadurch wäre der Experimentator der Probe nur minimal ausgesetzt; dies wäre ein bevorzugtes Verfahren zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in einem biologischen Muster wie Blut oder Urin. Alternativ können die trockenen Komponenten zu Tabletten gepresst und als Schüttmasse gelagert werden. Die Tabletten wären ein zweckmäßiges Lagerformat und können einer Probe jeder beliebigen Größe in jedem beliebigen Behälter in der korrekten Menge zugegeben werden. Dies wäre ein bevorzugtes Verfahren für das Sammeln von flüssigen Proben vor Ort aus solchen Quellen wie Wasserreservoirs, Abwasseranlagen oder der Milchindustrie. Die Hauptvorteile der Verwendung des RNA-Konservierungsreagens im Trockenzustand wären die Gewichtseinsparungen bei Lagerung und Transport, ein weniger wahrscheinliches Austreten fester Komponenten und ein reduziertes Volumen, da die Konservierung von flüssigen Proben mit trockenen Reagenzien das Endvolumen der Probe auf ein Minimum reduzieren würde.
  • LITERATURLISTE
    • US-Patent 5,922,591
    • US-Patent 5,921,396
    • US-Patent 5,726,012
    • US-Patent 5,090,420
    • Allewell, N.M., Sama, A., "The effect of ammonium sulfate on the activity of ribonuclease A." Biochemica et Biophysica Acta 341:484-488 (1974).
    • Auffray, C., Rougeon, F., "Purification of mouse immunoglobulin heavy chain messenger RNAs from total myeloma tumor RNA." Eur. J. Biochemistry Jun; 107(2) 303-314 (1980).
    • Boom, W.R., Adriaanse, H., Kievits, T., Lens, P.F., US-Patent Nr. 5,234,809 mit dem Titel "Process for Isolating Nucleic Acid".
    • Bugos, R.C., Chiang, V.L., Zhang, X.H., Campbell, E.R., Podila, G.K., Campbell, W.H., "RNA isolation from plant tissues recalcitrant to extraction by guanidine." Biotechniques Nov; 19(5) 734-7 (1995).
    • Cairns, M.T., Church, S., Johnston, P.G., Phenix, K.V., Marley, JJ., "Paraffinembedded tissues as a source of RNA for gene expression analysis in oral malignancy." Oral Diseases Sep; 3(3):157-161 (1997).
    • Chomczynski, P., US-Patent Nr. 5,346,994 mit dem Titel "Shelf Stable Product and Process for Isolating RNA, DNA, and Proteins."
    • Dimulescu et al., "Characterization of RNA in Cytologic Samples Preserved in a Methanol-Based Collection Solution." Molecular Diagnosis 3(2):67-72 (1998).
    • Esser et al., "Isolation of full-sized mRNA from ethanol-fixed cells after cellular immunofluorescence staining and fluorescence-activated cell sorting." (FACS) Cytometry 1995 Dec 1; 21(4):382-386.
    • Foss, R.D., Guha-Thakurta, N., Conran, R.M., Gutman, P., "Effects of fixative and fixation time on the extraction and polymerase chain reaction amplification of RNA from paraffin-embedded tissue." Comparison of two housekeeping mRNA controls. Diagn Mol Pathol Sep; 3(3):148-155 (1994).
    • Houze, T.A., Gustavsson, B., "Sonification as a means of enhancing the detection of gene expression levels from formalin-fixed, paraffin-embedded biopsies." Biotechniques Dec; 21(6):1074-1078 (1996).
    • Hurley et al., US-Patent Nr. 5,256,571 mit dem Titel "Cell Preservation Solution" (1993).
    • Koopmans, M., Monroe, S.S., Coffield, L.M. and Zaki, S.R., "Optimization of extraction and PCR amplification of RNA extracts from paraffin-embedded tissue in different fixatives." J. Virol. Methods Jul; 43(2):189-204 (1993).
    • Lin, L.N., Brandts, J.F., "Refolding of ribonuclease in the presence and absence of ammonium sulfate pulses." Comparison between experiments and simulations. Biochemistry 26:1826-1830 (1987).
    • Macfarlane, D.E., US-Patent Nr. 5,010,183 mit dem Titel "Process for Purifying DNA and RNA using Cationic Detergents".
    • Stanta, G., Schneider, C., "RNA extracted from paraffin-embedded human tissues is amendable to analysis by PCR amplification." Biotechniques Se; 11(3):304 (1991).

Claims (25)

  1. Verwendung eines RNA-Konservierungsmediums mit einem von Ammoniumsulfat oder Cäsiumsulfat gebildeten Salz in einer Konzentration von 40 g/100 ml bis zur Sättigungskonzentration des Salzes zum Konservieren von RNA in einer Probe.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Salz Ammoniumsulfat ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Salz in einer Konzentration von 50 g/100 ml vorliegt.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, wobei das Salz in einer Konzentration von 60 g/100 ml vorliegt.
  5. Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, wobei das Salz in einer Konzentration von 70 g/100 ml vorliegt.
  6. Verwendung nach Anspruch 1 bis 5, wobei das RNA-Konservierungsmedium ein organisches Lösungsmittel umfasst.
  7. Verwendung nach Anspruch 1 bis 6, wobei das RNA-Konservierungsmedium einen Chelatbildner aus zweiwertigen Kationen umfasst.
  8. Verwendung nach Anspruch 1 bis 7, wobei das RNA-Konservierungsmedium einen Puffer umfasst.
  9. Verwendung nach Anspruch 1 bis 8, wobei das RNA-Konservierungsmedium einen pH-Wert zwischen 4 und 8 hat.
  10. Verwendung nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Probe eine Zellsuspension ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Probe eine feste Gewebeprobe ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Probe eine Blutprobe ist.
  13. Verwendung nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Probe eine Wasserprobe ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 1 bis 9, wobei die Probe einen ganzen Organismus umfasst.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Organismus ein Krankheitserreger in einer Gewebeprobe oder ein sonstiger Organismus ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 1 bis 15, wobei die konservierte RNA isoliert wird.
  17. Verwendung nach Anspruch 1 bis 16, wobei die RNA bei einer Temperatur höher als –20°C isoliert wird.
  18. Verwendung nach Anspruch 1 bis 17, wobei die Probe vor Isolierung der RNA in dem RNA-Konservierungsmedium gelagert wird.
  19. Verwendung nach Anspruch 1 bis 18, wobei die Probe bei einer Temperatur höher als 0°C gelagert wird.
  20. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die RNA-haltige Probe und das Salz einer Flüssigkeit beigemischt werden.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Probe eine Blutzelle ist und die Flüssigkeit ein Blutserum ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Flüssigkeit Wasser ist.
  23. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Flüssigkeit ein Puffer ist.
  24. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Salz vor Beimischung zu der Probe und der Flüssigkeit in fester Form vorliegt.
  25. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Salz vor Beimischung der Probe zu dem Salz in der Flüssigkeit enthalten ist.
DE69929445T 1998-07-31 1999-07-30 Methoden und reagenzien zur erhaltung der rna in zellen und geweben Expired - Lifetime DE69929445T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/127,435 US6204375B1 (en) 1998-07-31 1998-07-31 Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples
US127435 1998-07-31
PCT/US1999/017375 WO2000006780A1 (en) 1998-07-31 1999-07-30 Methods and reagents for preserving rna in cell and tissue samples

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69929445D1 DE69929445D1 (de) 2006-04-06
DE69929445T2 true DE69929445T2 (de) 2006-09-14

Family

ID=22430096

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69942351T Expired - Lifetime DE69942351D1 (de) 1998-07-31 1999-07-30 Methoden und Reagenzien zur Erhaltung der RNA in Zellen und Geweben
DE69929445T Expired - Lifetime DE69929445T2 (de) 1998-07-31 1999-07-30 Methoden und reagenzien zur erhaltung der rna in zellen und geweben

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69942351T Expired - Lifetime DE69942351D1 (de) 1998-07-31 1999-07-30 Methoden und Reagenzien zur Erhaltung der RNA in Zellen und Geweben

Country Status (10)

Country Link
US (6) US6204375B1 (de)
EP (2) EP1657313B1 (de)
JP (1) JP4554080B2 (de)
AT (2) ATE315665T1 (de)
AU (1) AU745943B2 (de)
CA (1) CA2298841C (de)
DE (2) DE69942351D1 (de)
DK (1) DK1019545T3 (de)
ES (1) ES2255293T3 (de)
WO (1) WO2000006780A1 (de)

Families Citing this family (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69839963D1 (de) 1997-08-20 2008-10-16 Univ Miami Hochqualitatives durchlaufendes verfahren zur fixierung, dehydratisierung, entfettung und imprägnation von geweben
US6793890B2 (en) 1997-08-20 2004-09-21 The University Of Miami Rapid tissue processor
US7569342B2 (en) * 1997-12-10 2009-08-04 Sierra Molecular Corp. Removal of molecular assay interferences
US20080064108A1 (en) * 1997-12-10 2008-03-13 Tony Baker Urine Preservation System
US6204375B1 (en) * 1998-07-31 2001-03-20 Ambion, Inc. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples
US6777210B1 (en) * 1998-09-24 2004-08-17 Ambion, Inc. Method and reagents for inactivating ribonucleases RNase A, RNase I and RNase T1
US20040115692A1 (en) * 2000-04-03 2004-06-17 Cytyc Corporation Methods, compositions and apparatuses for detecting a target in a preservative solution
DE10031236A1 (de) 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
US20030228600A1 (en) * 2000-07-14 2003-12-11 Eppendorf 5 Prime, Inc. DNA isolation method and kit
US20020055116A1 (en) * 2000-09-12 2002-05-09 Cunningham Melissa M. Compositions, methods and kits for determining the presence of cryptosporidium organisms in a test sample
MX2008005896A (es) * 2000-12-01 2009-03-03 Response Genetics Inc Metodo in vitro para predecir la sensibilidad de un tumor a un regimen quimioterapico.
US7049059B2 (en) * 2000-12-01 2006-05-23 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 and TS expression
US6602670B2 (en) 2000-12-01 2003-08-05 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression
US6518416B1 (en) 2000-12-01 2003-02-11 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression
US6582919B2 (en) 2001-06-11 2003-06-24 Response Genetics, Inc. Method of determining epidermal growth factor receptor and HER2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates
ATE426678T1 (de) * 2001-01-25 2009-04-15 Qiagen Gmbh Ammoniumsulfat zur aufhebung von inhibitorischen effekten
US6956111B2 (en) 2001-03-02 2005-10-18 Response Genetics, Inc. Method of determining dihydropyrimidine dehydrogenase gene expression
US20030143571A1 (en) * 2001-08-08 2003-07-31 North Carolina State University Infectious disease microarray
ES2607978T3 (es) 2001-10-12 2017-04-05 Becton, Dickinson And Company Aparato para almacenar muestras biológicas
US20050032105A1 (en) * 2001-10-12 2005-02-10 Bair Robert Jackson Compositions and methods for using a solid support to purify DNA
US7148343B2 (en) * 2001-10-12 2006-12-12 Gentra Systems, Inc. Compositions and methods for using a solid support to purify RNA
ES2636974T3 (es) * 2001-10-12 2017-10-10 Becton, Dickinson And Company Aparato de tipo cesta para el transporte de muestras biológicas
US7893228B2 (en) * 2001-10-12 2011-02-22 Qiagen North American Holdings, Inc. Compositions and methods for using a solid support to purify RNA
JP4283112B2 (ja) * 2001-10-29 2009-06-24 アークレイ株式会社 試験装置
DE10153957A1 (de) * 2001-11-06 2003-05-22 Quiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
US8088602B1 (en) 2001-12-05 2012-01-03 Elizabeth Gay Frayne Manipulation of RNA stability and protein synthesis using thio-phosphate
US20030170617A1 (en) 2002-01-28 2003-09-11 Pasloske Brittan L. Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection
JP2005532824A (ja) * 2002-05-10 2005-11-04 ザユニバーシティー オブ マイアミ 細胞および組織のｒｎａおよび形態の保存
US7138226B2 (en) * 2002-05-10 2006-11-21 The University Of Miami Preservation of RNA and morphology in cells and tissues
DE10222494A1 (de) * 2002-05-15 2003-11-27 Europroteome Ag Verfahren zur parallelen Gewinnung von RNA und Proteinen aus einer Gewebeprobe
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
EP1413874A1 (de) 2002-10-16 2004-04-28 Streck Laboratories, Inc. Verfahren und Vorrichtung zum Sammeln und Konservieren von Zellen für die Analyse
US20040146871A1 (en) * 2003-01-29 2004-07-29 Hoyt Peter R. Method and high throughput adaptation thereof for RNA, DNA or protein isolation from animal tissues
US7517697B2 (en) 2003-02-05 2009-04-14 Applied Biosystems, Llc Compositions and methods for preserving RNA in biological samples
AU2004235298A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Preservation of RNA in a biological sample
US7267950B2 (en) * 2003-05-01 2007-09-11 Veridex, Lcc Rapid extraction of RNA from cells and tissues
US7488579B2 (en) * 2003-05-06 2009-02-10 Biochain Institute, Inc. Methods and compositions to extract DNA, RNA and protein simultaneously from biological samples
EP1475434A1 (de) * 2003-05-09 2004-11-10 Oncoscience AG Verfahren zur Lagerung von Tumorzellen
EP1676117B1 (de) * 2003-10-24 2009-09-09 The University Of Miami Vereinfachte gewebeverarbeitung
US20070148650A1 (en) * 2003-11-12 2007-06-28 Trustees Of Boston University Isolation of nucleic acid from mouth epithelial cells
CA2549985C (en) * 2003-12-16 2011-05-24 Gentra Systems, Inc. Formulations and methods for denaturing proteins
US20050160701A1 (en) * 2003-12-24 2005-07-28 Stevens Timothy A. Tissue preservation assembly and method of making and using the same
US20050208501A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-22 Ambion, Inc. Process and reagents for extraction of RNA from fractionated blood leukocytes
US7824855B2 (en) * 2004-03-26 2010-11-02 Fujifilm Corporation Method for selectively separating and purifying RNA and method for separating and purifying nucleic acid
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
MXPA06011580A (es) * 2004-04-08 2007-05-04 Biomatrica Inc Integracion de almacenamiento de muestras y administracion de muestras para las ciencias de la vida.
US20080176209A1 (en) * 2004-04-08 2008-07-24 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
WO2005113769A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Exact Sciences Corporation Method for stabilizing biological samples for nucleic acid analysis
US7361465B2 (en) 2004-09-07 2008-04-22 Applera Corporation Methods and compositions for tailing and amplifying RNA
AU2005305012C1 (en) 2004-11-05 2012-07-19 Qiagen North American Holdings, Inc. Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents
DE102005013261A1 (de) * 2005-03-22 2006-09-28 Adnagen Ag Reagenz und Verfahren zur Verhinderung der zeitabhängigen Expression in biologischen Zellen
DE102005015005A1 (de) * 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
EP2390347A1 (de) 2005-04-14 2011-11-30 Trustees Of Boston University Diagnose für Lungenerkrankungen mittels Klassenvorhersage
US20060234251A1 (en) * 2005-04-19 2006-10-19 Lumigen, Inc. Methods of enhancing isolation of RNA from biological samples
AU2006270063A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Applied Biosystems, Llc. Methods for RNA profiling
WO2007016935A1 (en) 2005-07-29 2007-02-15 Histogenex Nv Methods, reagents and instrumentation for preparing impregnated tissue samples suitable for histopathological and molecular studies
ATE488587T1 (de) 2005-12-06 2010-12-15 Ambion Inc Rückübertragungs-primer und verfahren zu deren entwurf
US20070190526A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-16 Nexgen Diagnostics Llc Methods of extracting nucleic acids
US8979770B2 (en) * 2006-02-24 2015-03-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Extraction and diagnostic fluid devices, systems and methods of use
US20070207483A1 (en) * 2006-03-02 2007-09-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. BUFFERS FOR DETECTION OF mRNA SEPARATED IN A MICROFLUIDIC DEVICE
WO2007103541A2 (en) 2006-03-09 2007-09-13 The Trustees Of Boston University Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells
US20080027353A1 (en) * 2006-07-31 2008-01-31 Kliman Harvey J Method of making and using a library of biological information
SG179454A1 (en) 2006-10-06 2012-04-27 Dna Genotek Inc Stabilizing compositions and methods for extraction of ribonucleic acid
US7748283B2 (en) * 2007-02-16 2010-07-06 Whatman, Inc. Controlled transfer biological sample collection devices and methods of using such devices
US7964350B1 (en) 2007-05-18 2011-06-21 Applied Biosystems, Llc Sample preparation for in situ nucleic acid analysis
DE102007025275A1 (de) 2007-05-31 2008-12-04 Qiagen Gmbh Butendisäure oder deren Derivate zur Behandlung einer biologischen Probe
DE102007025276A1 (de) 2007-05-31 2008-12-04 Qiagen Gmbh Aromatische Alkohole zur Behandlung einer biologischen Probe
DE102007025277A1 (de) * 2007-05-31 2008-12-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe
US20090053704A1 (en) * 2007-08-24 2009-02-26 Natalia Novoradovskaya Stabilization of nucleic acids on solid supports
AU2008302076B2 (en) 2007-09-19 2015-06-11 The Trustees Of Boston University Identification of novel pathways for drug development for lung disease
WO2009066695A1 (ja) * 2007-11-20 2009-05-28 Olympus Corporation 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット
EP2214824A4 (de) * 2007-11-28 2015-08-19 Smart Tube Inc Vorrichtungen, systeme und verfahren zur entnahme, stimulation, stabilisierung und analyse einer biologischen probe
DE102007063019A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-02 Humboldt-Universität Zu Berlin Verfahren und Arbeitsbesteck zum Aufschluss von Zellen sowie zur Konservierung und Extraktion von Nukleinsäuren aus lebenden Zellen oder Geweben
US20090298172A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-03 Steven Paul Wheeler Histological specimen treatment apparatus and method
WO2010028288A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US20100081928A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Histological Facilitation systems and methods
US9495515B1 (en) 2009-12-09 2016-11-15 Veracyte, Inc. Algorithms for disease diagnostics
WO2010071833A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Life Technologies Corporation Proteinase k inhibitors, methods and compositions therefor
EP2202320A1 (de) 2008-12-24 2010-06-30 Agendia B.V. Verfahren und Mittel zur Typisierung einer Probe mit Kolorektalkrebszellen
US11634747B2 (en) 2009-01-21 2023-04-25 Streck Llc Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma
CA2750661A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 L'air Liquide Societe Anonyme Pour L'etude Et L'exploitation Des Procede S Georges Claude Process for preserving biological materials for extended periods of time
ES2649572T3 (es) 2009-02-18 2018-01-12 Streck Inc. Conservación de ácidos nucleicos fuera de las células
WO2011008553A1 (en) * 2009-06-29 2011-01-20 Life Technologies Corporation Rna sample stabilization in the presence of a transitional metal
EP2454588B1 (de) * 2009-07-16 2015-07-15 The General Hospital Corporation Nukleinsäureanalyse
US8465471B2 (en) 2009-08-05 2013-06-18 Rocin Laboratories, Inc. Endoscopically-guided electro-cauterizing power-assisted fat aspiration system for aspirating visceral fat tissue within the abdomen of a patient
US20110213336A1 (en) 2009-08-05 2011-09-01 Cucin Robert L Method of and apparatus for sampling, processing and collecting tissue and reinjecting the same into human patients
US8348929B2 (en) 2009-08-05 2013-01-08 Rocin Laboratories, Inc. Endoscopically-guided tissue aspiration system for safely removing fat tissue from a patient
WO2011031877A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles
EP3865590B1 (de) 2009-09-09 2024-04-10 The General Hospital Corporation Verwendung von mikrovesikeln bei der analyse von kras-mutationen
CN106160992B (zh) * 2010-02-12 2020-07-03 交互数字专利控股公司 增强无线发射/接收单元的小区边缘性能的方法及网络
JP2013531987A (ja) 2010-06-14 2013-08-15 キアゲン ゲーエムベーハー 固定生物学的試料から生体分子を抽出するためのターゲット細胞または組織を決定するための方法
CA2806734A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
CA2806670A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012031008A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
CA2810931C (en) 2010-09-24 2018-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
AU2011308134B2 (en) 2010-09-28 2015-09-03 Agendia N.V. Methods and means for typing a sample comprising cancer cells based on oncogenic signal transduction pathways
AU2011326366B2 (en) 2010-11-10 2017-02-23 Exosome Diagnostics, Inc. Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids therefrom
EP2655661B1 (de) 2010-12-23 2015-03-11 Agendia N.V. Verfahren und mittel zur molekularen klassifizierung von kolorektalkarzinomen
EP2704740B1 (de) 2011-05-04 2016-10-05 Streck, Inc. Inaktiviertes schweinegrippe-virus und verfahren zu seiner herstellung
GB201107466D0 (en) * 2011-05-05 2011-06-15 Loktionov Alexandre Device and method for non-invasive collection of colorectal mucocellular layer and disease detection
CA2839693A1 (en) 2011-06-19 2012-12-27 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
EP2744916A4 (de) 2011-07-13 2015-06-17 Primeradx Inc Multimodale verfahren zur simultanen erkennung und quantifizierung mehrerer nukleinsäuren in einer probe
US9175351B2 (en) 2011-07-13 2015-11-03 Agendia N.V. Means and methods for molecular classification of breast cancer
US9377435B2 (en) 2011-10-11 2016-06-28 Honeywell International Inc. Auxiliary gas diffusion electrodes for diagnostics of electrochemical gas sensors
US9689833B2 (en) 2011-10-11 2017-06-27 Life Safety Distribution Ag Auxiliary micro-electrodes for diagnostics of electrochemical gas sensors
WO2013117967A1 (en) * 2012-02-10 2013-08-15 Reametrix Inc. Compositions and methods for sputum samples preparation, and kit
US8927214B2 (en) 2012-04-18 2015-01-06 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for dual extraction of protein and nucleic acid
US9822356B2 (en) 2012-04-20 2017-11-21 California Institute Of Technology Fluidic devices and systems for sample preparation or autonomous analysis
WO2013159116A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 University Of Chicago Fluidic devices for biospecimen preservation
US9044738B2 (en) 2012-04-30 2015-06-02 General Electric Company Methods and compositions for extraction and storage of nucleic acids
US9480966B2 (en) 2012-04-30 2016-11-01 General Electric Company Substrates and methods for collection, stabilization and elution of biomolecules
US9040679B2 (en) 2012-04-30 2015-05-26 General Electric Company Methods and compositions for extraction and storage of nucleic acids
US9040675B2 (en) 2012-04-30 2015-05-26 General Electric Company Formulations for nucleic acid stabilization on solid substrates
CN102680295B (zh) * 2012-05-21 2016-01-20 江苏省中医院 一种从he染色片提取残微核酸的方法
US9383297B2 (en) 2012-07-03 2016-07-05 The University Of Akron Decalcification solution with preservation of RNA
EP2906712A1 (de) 2012-10-10 2015-08-19 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Verfahren und mittel zur vorhersage der resistenz gegen eine krebsbehandlung
CA2892757A1 (en) 2012-11-26 2014-05-30 Ecole Polythechnique Federale De Lausanne (Epfl) Colorectal cancer classification with differential prognosis and personalized therapeutic responses
EP2934572A4 (de) 2012-12-20 2016-11-23 Biomatrica Inc Formulierungen und verfahren zur stabilisierung von pcr-reagenzien
CN105051514B (zh) 2013-01-24 2017-09-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 对从染色的FFPET切片显微切割的材料的RT‑qPCR分析
EP3626308A1 (de) 2013-03-14 2020-03-25 Veracyte, Inc. Verfahren zur bewertung eines copd-status
US11976329B2 (en) 2013-03-15 2024-05-07 Veracyte, Inc. Methods and systems for detecting usual interstitial pneumonia
WO2014151437A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Creatv Microtech, Inc. Urine preservative reagent for microfiltration
CA2917912C (en) 2013-07-24 2019-09-17 Streck, Inc. Compositions and methods for stabilizing circulating tumor cells
EP3074532A1 (de) 2013-11-28 2016-10-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Verfahren zur molekularen klassifizierung von brca-brust- und/oder eierstockkrebs
EP3154338B1 (de) 2014-06-10 2020-01-29 Biomatrica, INC. Stabilisierung von thrombozyten bei umgebungstemperatur
EP3169780B1 (de) * 2014-07-17 2020-02-12 Qiagen GmbH Verfahren zur isolierung von rna mit hoher ausbeute
EP3770274A1 (de) 2014-11-05 2021-01-27 Veracyte, Inc. Systeme und verfahren zur diagnose von idiopathischer pulmonaler fibrose auf transbronchialen biopsien mit maschinellem lernen und hochdimensionalen transkriptionsdaten
CN104480012A (zh) * 2014-11-27 2015-04-01 南方医科大学 一种粪便细菌的保存液
CN104673717B (zh) * 2015-02-12 2017-11-28 中国医科大学 一种生物组织rna保护试剂及其制备方法和应用
US11168351B2 (en) 2015-03-05 2021-11-09 Streck, Inc. Stabilization of nucleic acids in urine
EP3265558B1 (de) * 2015-03-06 2020-05-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Stabilisierte rna-lösungen
EP3271479B1 (de) 2015-03-17 2019-07-17 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Verfahren und mittel zur untertypisierung von invasivem lobulärem brustkrebs
CA2979647C (en) 2015-03-20 2023-07-18 Iq Products B.V. Novel marker for gestational diabetes
WO2016153355A2 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Microbiome Limited Novel isolation and amplification process control
US10365189B2 (en) 2015-05-07 2019-07-30 Steven Wheeler Histological specimen treatment
EP4035762B1 (de) 2015-09-09 2023-11-01 Drawbridge Health, Inc. Vorrichtungen zur probeentnahme, stabilisierung und konservierung
JP2017099376A (ja) * 2015-11-19 2017-06-08 株式会社日吉 環境水試料の前処理方法、環境水試料の前処理剤、並びに、生物相又は生物の量の推定方法
US20170145475A1 (en) 2015-11-20 2017-05-25 Streck, Inc. Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative
KR102589056B1 (ko) 2015-12-08 2023-10-12 바이오매트리카 인코포레이티드 적혈구 침강 속도의 감소
EP3430135A1 (de) 2016-03-19 2019-01-23 QIAGEN GmbH Stabilisierung von rna
JP7019590B2 (ja) * 2016-03-31 2022-02-15 バークレー ライツ，インコーポレイテッド 核酸安定化試薬、キット、及びその使用方法
WO2017198715A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 R-Biopharm Ag Nucleic acid stabilization agent
WO2018009765A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 President And Fellows Of Harvard College Determination of rna in blood or other fluids
WO2018009915A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Trustees Of Boston University Gene expression-based biomarker for the detection and monitoring of bronchial premalignant lesions
US11506655B2 (en) 2016-07-29 2022-11-22 Streck, Inc. Suspension composition for hematology analysis control
WO2018128544A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Agendia N.V. Biomarkers for selecting patient groups, and uses thereof.
MX2019006767A (es) 2017-01-16 2019-08-22 Spectrum Solutions L L C Solucion de conservacion de acido nucleico y metodos de elaboracion y uso.
CA3050906A1 (en) * 2017-01-22 2018-07-26 Chryos, Llc Composition and method of use of the same for preserving cells for analysis
US20190360051A1 (en) 2017-02-17 2019-11-28 Stichting Vumc Swarm intelligence-enhanced diagnosis and therapy selection for cancer using tumor- educated platelets
US11168323B2 (en) 2017-06-01 2021-11-09 Nantomics Llc DNA stabilization of RNA
CN107475251B (zh) * 2017-09-19 2021-02-02 成都导胜生物技术有限公司 一种裂解液及其在保存组织或细胞、提取rna中的应用
CN108094407A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 浙江今复康生物科技有限公司 一种细胞保存液及痰液细胞参考品的制备方法
US10046322B1 (en) 2018-03-22 2018-08-14 Talis Biomedical Corporation Reaction well for assay device
EP3884070A4 (de) 2018-11-20 2022-09-07 Spectrum Solutions, LLC Probensammelsystem mit verschlusskappe und ventil
GB201820300D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
WO2020255124A1 (en) * 2019-06-16 2020-12-24 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for stabilizing intracellular rna
US11701094B2 (en) 2019-06-20 2023-07-18 Spectrum Solutions L.L.C. Sample collection system including valve and plug assemblies
US10820847B1 (en) 2019-08-15 2020-11-03 Talis Biomedical Corporation Diagnostic system
WO2021118349A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Prinses Máxima Centrum Voor Kinderoncologie B.V. Methods of typing germ cell tumors
CN111363729B (zh) * 2020-03-12 2021-04-16 苏州白垩纪生物科技有限公司 一种rna病毒灭活保存液及其应用
CN111088319B (zh) * 2020-03-25 2020-07-21 深圳市上为生物科技有限公司 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法
EP4143344A1 (de) 2020-04-27 2023-03-08 Agendia N.V. Behandlung von her2-negativem mammaprint- brustkrebs mit hohem risiko 2
IT202000018682A1 (it) * 2020-07-30 2022-01-30 Biofarma S R L Soluzione acquosa per la conservazione di acidi nucleici
WO2023019124A1 (en) * 2021-08-09 2023-02-16 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Method to preserve nucleic acids in water samples
WO2023089183A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Branca Bunus Limited A composition comprising a therapeutically active agent packaged within a drug delivery vehicle
CN114410744A (zh) * 2022-01-27 2022-04-29 深圳安吉康尔医学检验实验室 一种处理样本的方法及其核酸提取方法与文库
WO2023162065A1 (ja) * 2022-02-24 2023-08-31 Ｂｌｕｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ株式会社 生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキット
CN116103280B (zh) * 2022-12-28 2024-03-15 上海亿康医学检验所有限公司 样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2623276A1 (de) * 1976-05-24 1977-12-08 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur fraktionierung und trennung von proteinen
US4746539A (en) * 1983-11-23 1988-05-24 The Ohio State University Research Foundation Purification of cancer-associated protein and preparation of antibody thereto
JPH0684543B2 (ja) 1985-12-18 1994-10-26 呉羽化学工業株式会社 選択的化学メッキ法
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5010183A (en) 1989-07-07 1991-04-23 Macfarlane Donald E Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents
US5256571A (en) * 1991-05-01 1993-10-26 Cytyc Corporation Cell preservative solution
US5422241A (en) * 1991-07-03 1995-06-06 Ambion, Inc. Methods for the recovery of nucleic acids from reaction mixtures
US5346994A (en) 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
JP3615545B2 (ja) * 1993-02-01 2005-02-02 キアゲン・エヌ・ブイ 第四級アンモニウム塩界面活性剤及びそのｒｎａの単離剤
JP3163224B2 (ja) * 1994-10-14 2001-05-08 三菱レイヨン株式会社 菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法
US5938621A (en) * 1997-09-12 1999-08-17 Becton Dickinson And Company Collection container assembly
US6204375B1 (en) * 1998-07-31 2001-03-20 Ambion, Inc. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples

Also Published As

Publication number Publication date
ES2255293T3 (es) 2006-06-16
US8178296B2 (en) 2012-05-15
US6528641B2 (en) 2003-03-04
EP1657313B1 (de) 2010-05-05
AU5461699A (en) 2000-02-21
EP1019545B1 (de) 2006-01-11
CA2298841A1 (en) 2000-02-10
JP4554080B2 (ja) 2010-09-29
US20120270316A1 (en) 2012-10-25
ATE466957T1 (de) 2010-05-15
EP1019545A1 (de) 2000-07-19
DE69942351D1 (de) 2010-06-17
WO2000006780A1 (en) 2000-02-10
CA2298841C (en) 2012-01-24
US6204375B1 (en) 2001-03-20
JP2002521071A (ja) 2002-07-16
EP1657313A3 (de) 2007-06-27
EP1657313A2 (de) 2006-05-17
DK1019545T3 (da) 2006-05-29
AU745943B2 (en) 2002-04-11
US20100028852A1 (en) 2010-02-04
DE69929445D1 (de) 2006-04-06
US20030114651A1 (en) 2003-06-19
US20010016312A1 (en) 2001-08-23
US20140295411A1 (en) 2014-10-02
ATE315665T1 (de) 2006-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69929445T2 (de) Methoden und reagenzien zur erhaltung der rna in zellen und geweben
EP2071037B1 (de) Gefäß zur Entnahme von Blut
EP1861495B1 (de) Verwendung von nukleasen zum abbau von nukleinsäure in gegenwart von chaotropen agenzien und/oder tensiden
EP1969341B1 (de) Ein verfahren zur behandlung einer biologischen probe
DE60035156T2 (de) Eine Zusammensetzung zur Bereitstellung von dauerhaft haltbaren Zellen für diagnostische Tests
EP2164963B1 (de) Verfahren zur stabilisierung einer biologischen probe
DE202010018524U1 (de) Blutsammelröhrchen
WO2002000599A1 (de) Neue kompositionen für die isolierung und/oder stabilisierung von nukleinsäuren in biologischen materialien
DE19900638A1 (de) Methode zur Isolierung von DNA aus biologischen Materialien
DE69333586T2 (de) Verfahren und zusammensetzung zur konservierung von antigenen und verfahren zur verwendung von durch selbiges verfahren hergestellten zytologischem material
DE112009001513B4 (de) Stabile Lysepuffermixtur zur Extraktion von Nukleinsäuren
DE4333805A1 (de) Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und Verfahren zum Nachweis spezifizierter Nucleinsäuresequenzen
DE102011054474B4 (de) System zur Stabilisierung, Aufbewahrung und Lagerung einer Nukleinsäure
DE112018002597B4 (de) Getrocknete zusammensetzungen, die flap-endonuklease enthalten
EP1534848B1 (de) Verfahren zur extraktion von proteinen
EP2220508A1 (de) Verfahren zur extraktion von membranproteinen
DE4447015C2 (de) Verfahren zur schnellen Isolierung und ggf. Lagerung von Ribonukleinsäuren
DE102005031910B4 (de) Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäuren
WO2012062841A1 (de) Feuchtigkeitsindikator

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8380 Miscellaneous part iii

Free format text: PFANDRECHT

8380 Miscellaneous part iii

Free format text: PFANDRECHT AUFGEHOBEN