DE102007063019A1 - Verfahren und Arbeitsbesteck zum Aufschluss von Zellen sowie zur Konservierung und Extraktion von Nukleinsäuren aus lebenden Zellen oder Geweben - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Probenfixierung, zur Probenkonservierung, zum Zellaufschluss und zur Extraktion von Nukleinsäuren aus lebenden Zellen, Zellverbänden und Gewebeproben sowie ein Arbeitsbesteck zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren besteht darin, die lebenden Zellen oder Gewebestücke mit einer nahezu wasserfreien, mit Wasser mischbaren und flüchtigen organischen Flüssigkeit zu äquilibrieren und anschließend die entwässerten Zellen durch Generation mechanischer Impulse in der flüchtigen organischen Flüssigkeit aufzuschließen, diese Flüssigkeit abzutrennen und den Rückstand in einem wässrigen Extraktionspuffer zu dispergieren. Das erfindungsgemäße Arbeitsbesteck umfasst mindestens ein verschließbares Gefäß, eine flüchtige organische Flüssigkeit, ein zur Bindung von Wasser aus dieser Flüssigkeit geeignetes festes Entwässerungsmittel und eine an das Gefäß angepasste Menge an feinen, harten Mahlpartikeln. Es kann in Verbindung mit einer Vorrichtung zur Erzeugung von Scher- und/oder Prallkräften und einer Vorrichtung zur Isolation von Nukleinsäuren aus dem Rohextrakt zur Fixierung, Langzeitkonservierung und Isolation hochmolekularer DNA und RNA aus lebenden Zellen, Zellverbänden und Gewebeproben eingesetzt werden. Der Vorteil der Erfindung besteht darin, dass auf Kühlung und starke mechanische Impulse zum Aufbrechen der Zellen verzichtet werden kann.

Description

• Bei der Gewinnung von Nukleinsäuren aus lebenden Zellen ist es für zahlreiche molekularbiologische Anwendungen notwendig, den enzymatischen Abbau dieser Makromoleküle im zellfreien Extrakt zu unterbinden. Insbesondere Bakterien, Pilze und Pflanzenzellen müssen mechanisch aufgeschlossen werden, weil die Zellwände für polymere Nukleinsäuren undurchlässig sind. Das gegenwärtig übliche Verfahren besteht im mechanischen Aufbrechen der in flüssigem Stickstoff gefrorenen Zellen. Zellverbände oder Gewebeproben und deren anschließende Überführung in einen wässrigen Extraktions- oder Lysepuffer. Der für den mechanischen Aufschluss notwendige Energieeintrag bedingt eine Gefahr des lokalen Auftauens und der hierdurch möglichen Reaktion von Nukleasen. Außerdem wirken starke Scherkräfte im wässrigen Milieu depolymerisierend auf die Nukleinsäuren. Beim Konservieren der Rohextrakte oder der Zellen bei tiefen Temperaturen kommt es zusätzlich leicht zur Fragmentation der Nukleinsäure. Diese kann beispielsweise durch das Wachstum von Eiskristallen induziert werden. Der für die Gefrierkonservierung und den Aufschluss der Zellen in flüssigem Stickstoff erforderliche technische Aufwand erschwert molekularbiologische Untersuchungen im Freiland und verursacht Kosten beim Transport der Proben.
• Hieraus leitet sich die Aufgabe ab, hochmolekulare DNA und RNA aus lebenden Zellen, Zellverbänden und Gewebeproben, so zu konservieren und zellwandumhüllte Bakterien, Pilze und Pflanzenzellen unter weitgehender Vermeidung enzymatischer oder mechanischer Depolymerisation mechanisch so aufzuschließen und zu extrahieren, dass alle Schritte bei Normaltemperatur durchgeführt werden können.
• Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und durch ein Arbeitsbesteck nach Anspruch 5 gelöst. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausführungsvarianten der Erfindung.
• Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass sich gegen mechanischen Aufschluss sehr resistente Hefe- und Bakterienzellen mit geringer mechanischer Leistung in kurzer Zeit vollständig aufbrechen lassen, nachdem sie in einer organischen Flüssigkeit, z. B. Aceton oder Ethanol, weitgehend entwässert wurden. Beispielsweise genügt das Schütteln einer nahezu wasserfreien Hefesuspension in Aceton mit einem Pulver aus feinen Glasperlen (1–20 μm) und einigen große Glasperlen (3 mm) auf einem konventionellen, zum Mischen kleiner Flüssigkeitsvolumina ausgelegten Kleinschüttler (Vortex-Prinzip), um die Wände aller Zellen zu zerstören. Es kam zu keiner erkennbaren Zellzerstörung bei gleicher Schütteldauer, und -intensität, wenn sich die Glasperlen und Hefezellen im gleichen Volumen eines üblichen wässrigen Milieus befanden. Die Effizienz des Zellaufschlusses war stark von der Entwässerung des organischen Mediums und der Zellen abhängig. Bereits ein geringer Wassergehalt der organischen Flüssigkeit, wie er durch das Eingeben von 50 mg der wasserhaltigen Zellen in 1,2 ml reines Acetons entsteht, beeinträchtigte die Effizienz der Zellfragmentierung. Es ist daher erforderlich, die organische Flüssigkeit und die Zellen, Zellverbände bzw. Gewebeproben weitgehend von Restwasser zu befreien, um die selektive Solvatation der hydrophilen Polymere der Zellwand und des Protoplasten mit Wasser zu verhindern. Es zeigte sich auch an anderen biologischen Materialien, dass erst im weitgehend entwässerten Zustand die Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben so brüchig wurden, dass die verhältnismäßig schwachen mechanischen Impulse, die durch das Schütteln auf dem erwähnten einfachen Schüttelgerät erzeugt werden können, zum Aufbrechen der Zellen führten.
• Eine vorteilhafte Variante der Erfindung besteht darin, zur Suspension der Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben mit einem Flüssigkeitsvolumen, das vorzugsweise 40 bis 60% des Gefäßvolumens beträgt, ein Pulver aus feinen und harten Mahlpartikeln, beispielsweise polydispersen oder monodispersen feinen Glasperlen mit einem Durchmesser von 1 bis 50 μm, vorzugsweise mit einem Anteil am Gefäßvolumen von 5 bis 30%, und gleichzeitig einem oder mehreren größere harten Mahlkörper mit einer Masse von mindestens 1 mg hinzuzufügen. Die größeren Mahlkörper verstärken auf Grund ihrer Trägheit die Strömungsgeschwindigkeit und Strömungsgeschwindigkeitsgradienten in der Suspension. Die hohe Konzentration feiner Mahlpartikeln erhöht die Frequenz der zellwandbrechenden mechanischen Impulse, welche auf die entwässerten Zellen, Zellverbände bzw. Gewebeproben einwirken.
• Erfindungsgemäß kann dem für die Probenkonservierung genutzten Gefäß mit der organischen flüchtigen Flüssigkeit ein zu ihrer Entwässerung geeignetes Mittel, z. B. ein hierfür geeignetes Molsieb oder ein wasserfreies Salz wie Natriumsulfat, Magnesiumsulfat oder dergleichen in ausreichender Menge hinzugefügt werden. Um das in der Probe vorhandene Wasser annähernd vollständig zu binden, soll das Produkt aus der Masse des Entwässerungsmittels und seiner auf die Masse bezogenen Wasserbindungskapazität den Wassergehalt der Probe übersteigen. In diesem Fall bindet das Entwässerungsmittel das im Aufschlussgefäß vorhandene Wasser nahezu vollständig, so dass auf den mehrfachen Austausch der organischen Flüssigkeit verzichtet werden kann.
• Ein wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass organische, mit Wasser mischbare Flüssigkeiten wie Aceton und Ethanol sehr schnell in Zellen und kleine Gewebeschnitte eindringen, wodurch die Nukleasen deaktiviert und somit unwirksam werden. Bei der Inkubation der Zellen, Zellverbände und Gewebeproben in den wasserfreien Lösungsmitteln werden diese Enzyme außerdem irreversibel denaturiert.
• Die Flüchtigkeit der organischen Flüssigkeit ermöglicht ihre Abtrennung durch Verdunsten. Dieser Prozess kann rationell gestaltet werden. Werden beispielsweise 2-ml-Probenröhrchen aus Polypropylen (Eppendorf-Tubes) als Probenaufschlussgefäße eingesetzt, genügt kurze Inkubation im Vakuum bei Raumtemperatur oder Erwärmen auf in einem handelsüblichen Heizblock, um die organische Flüssigkeit vollständig zu entfernen. Die weitgehende Entwässerung der Probe und der organischen Flüssigkeit verhindert das Verkleben der hydrophilen Zellfragmente und feinen Partikeln. Daher kann das beim Trocknen entstandene Pulver aus Zellbruchstücken und Mahlpartikeln problemlos in einem wässrigen Extraktionspuffer, der an Downstreamprozesse (z. B. Isolationsverfahren für Nukleinsäuren) angepasst ist, dispergiert werden.
• Vor der weiteren Verarbeitung können feine Mahlpartikeln und Zellwandfragmente durch Mikrofiltration, Zentrifugieren oder einfaches Sedimentieren aus der Dispersion entfernt werden. Erfindungsgemäß kann auf diesen Schritt verzichtet werden, wenn z. B. zur Isolation der Nukleinsäuren ein chromatographisches Trennbett eingesetzt wird. In diesem Fall ist vorteilhaft, in der verwendeten Einwegsäule das chromatographische Trennbett mit einem Mikrofilter abzudecken und die Dispersion über dieses Mikrofilter in das Trennbett einströmen zu lassen. Beispielsweise kann vorteilhaft ein aus Sporopollenin-Mikrokapseln bestehendes Trennbett nach DE 19902724 , das sich in einer Säule entsprechen DE 102004030878 befindet, eingesetzt werden. Dabei verlassen die von den Mikrokapseln selektiv ausgeschlossenen hochmolekularen RNA- und DNA-Moleküle als erste Fraktion die Säule und werden in einer Sammelfaser konzentriert.
• Für das erfindungsgemäße Verfahren wird, wie bei anderen Zellaufschlussverfahren, ein Generator für mechanische Impulse in einem Flüssigkeitsvolumen, z. B. ein Schüttelgerät, ein Rührgerät, ein manuell zu betätigender Rührstab, eine Ultraschall-Quelle oder dergleichen oder eine Kombination derartiger Impulsgenereratoren eingesetzt. Anschließend an die Dispersion der Zellbruchstücke in einem wässrigen Extraktionspuffer wird für die Isolation der Nukleinsäuren eine der bekannten Ausrüstungen zum Abtrennen hochmolekularer Nukleinsäuren von Proteinen und anderen löslichen Extraktbestandteilen benötigt.
• Zusätzlich wird ein erfindungsgemäßes Arbeitsbesteck für die Konservierung der hochmolekularen Nukleinsäuren, den Zellaufschluss in der organischen Flüssigkeit und die Extraktion der Nukleinsäuren eingesetzt. Es umfasst eine weitgehend wasserfreie flüchtige, mit Wasser mischbare organische Flüssigkeit, wie Aceton oder Ethanol, und mindestens ein verschließbares Gefäß für die Konservierung der Probe durch Entwässerung in der organischen Flüssigkeit. Das gleiche Gefäß oder ein weiteres Gefäß kann für den Zellaufschluss eingesetzt werden. Vorteilhaft ist ein Arbeitsbesteck, das neben den genannten Bestandteilen für jede Probe ein bereits erwähntes Entwässerungsmittel in der bereits erläuterten Menge, eine auf das Gefäßvolumen abgestimmte Menge feiner, harter Mahlpartikel sowie einen oder mehrere größere harte Mahlkörper mit den bereits dargestellten Eigenschaften enthält. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Entwässerungsmittel in der Form eines oder mehrerer poröser fester Körper gestaltet ist, der/die bequem nach erfolgter Bindung des Wassers aus dem verschließbaren Gefäß entnommen werden kann/können. Nach der Entnahme des Entwässerungsmittels und anschließender Zugabe der Mahlpartikeln kann das bisher zum Konservieren der Probe eingesetzte verschließbare Gefäß für den Zellaufschluss eingesetzt werden.
• Anwendungsbeispiel
• Das für die Anwendung benutzte Aceton wurde in einer Flasche über wasserfreiem Natriumsulfat aufbewahrt. Proben von 50 μl einer konzentrierten Hefesuspension, die durch Mischen der zentrifugierten Hefe mit Wasser im Volumenverhältnis 1/1 entstand, wurden in verschließbare 2-ml-Konservierungsgefäße (Eppendorf-Röhrchen) dosiert, in denen sich 1,2 ml des wasserfreien Acetons und 200 mg wasserfreien Natriumsulfats befanden. Zur Kontrolle wurde in Konservierungsgefäße, die nur 1,2 ml wasserfreies Aceton oder Wasser enthielten, ebenfalls 20 μl der Hefesuspension dosiert. Die Aufschlussgefäße wurden dicht verschlossen und bei Raumtemperatur inkubiert. In den ersten Stunden wurden die Gefäße gelegentlich oder ständig geschüttelt.
• Nach 24 h oder 8 Wochen wurde der Zellaufschluss vorgenommen. Hierzu wurde die Zellsuspension durch Dekantieren vom Entwässerungsmittel abgetrennt und in ein verschließbares Probenaufschlussgefäß überführt, das 200 mg feiner Glasperlen mit einem Durchmesser von 1 bis 10 μm (Spheriglas der Firma Potters Europe, Suffolk, UK) sowie 10 Glasperlen mit einem Durchmesser von 1,7 bis 2 mm enthielt. Die Aufschlussgefäße (Eppendorf-Röhrchen) wurden in horizontaler Lage auf einem einfachen handelsüblichen Kleinschüttler zum Mischen von Flüssigkeiten (Vortex-Prinzip) geschüttelt. Die lichtmikroskopische Bewertung ergab, dass die Zellen nach 30 min nahezu vollständig aufgeschlossen waren. Im Unterschied hierzu waren die Hefezellen in Vergleichsproben, die kein Entwässerungsmittel enthielten, nur unvollständig aufgeschlossen. Befand sich anstelle von Aceton Wasser in den Aufschlussgefäßen, waren die Zellen überhaupt nicht aufgebrochen. Die Aufschlussgefäße, welche die vollständig entwässerten Hefezellen enthielten, wurden geöffnet, mit einer perforierten Folie abgeschlossen und das Aceton in einem schwachen Vakuum, welches z. B. mit einer Wasserstrahlpumpe erzeugt werden kann, verdampft. Der Rückstand wurde mit 0,4 ml eines wässrigen Extraktionspuffers (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8, 1,4% Natriumdodecylsulfat) auf dem Mischgerät 10 min lang geschüttelt. Zur Abtrennung der hochmolekularen Nukleinsäuren aus den erhaltenen Dispersionen wurden 50 μl dieser Dispersionen auf eine Säule zur Isolation von Nukleinsäuren nach DE 199 02 724 und DE 102004030878 aufgetragen. Der Rest der Dispersionen im Extraktionspuffer wurde bei 37°C bis zu 24 h lang inkubiert. Von so inkubierten Dispersionen im wässrigen Extraktionspuffer wurden nach verschiedenen Zeiten weitere Proben genommen und chromatographiert. Die Säulen enthielten über dem aus Sporopollenin-Mikrokapseln bestehenden Trennbett (1 ml) eine etwa 3 mm-dicke Filterpackung aus feinen Partikeln (5–10 μm). Die Elution erfolgte mit Na-EDTA (10 mM, pH 8). Mit dem Elutionsmittel waren die Säulen bereits äquilibriert. Bei einem Elutionsvolumen von bis 0,37 ml wurden hochmolekulare DNA und RNA eluiert und in der Sammelfaser am Ausgang der Säule konzentriert. Die elektrophoretische Analyse der Eluate ergab, dass in allen Eluaten eine hochmolekulare DNA-Fraktion vorlag. Sie bildete bei der Elektrophorese im Agarose-Gel (0,8%) eine scharfe Bande mit einem Polymerisationsgrad weit über 10000 bp. Die hohe Qualität der eluierten RNA ergibt sich daraus, dass die deutlich stärkere Bande für die ribosomole RNA der großen Untereinheit gut von derjenigen der kleinen Untereinheit getrennt war. Hochmolekulare RNA-Moleküle unterschiedlicher Molmasse (mRNA) war ebenfalls nachweisbar. Die Dauer der Konservierungsperiode (24 h oder 8 Wochen) hatte keinen Einfluss auf die Schärfe und Lage der Banden des Elektropherogramms. Bemerkenswert ist, dass auch die Inkubation der Dispersionen in einem wässrigen Extraktionspuffer bei 37°C bis zu 24 h die Dispersität der RNA und DNA nicht beeinflusste. Elektrophoretisch konnte kein Abbau der Nukleinsäuren im Extraktionspuffer festgestellt werden. Hierdurch ist nachgewiesen, dass das verwendete Konservierungs- und Aufschlussverfahren die endogenen Nukleasen irreversibel deaktiviert.
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Patentliteratur
• - DE 19902724 [0009, 0013]
• - DE 102004030878 [0009, 0013]

Claims (8)

1. Verfahren zum Aufschluss von Zellen sowie zur Konservierung und Extraktion von Nukleinsäuren, bei dem lebende Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben in eine mit Wasser mischbare, flüchtige und weitgehend wasserfreie organische Flüssigkeit überführt und mit dieser äquilibriert werden, anschließend oder nach längerer Lagerung die Zellen in der weitgehend wasserfreien organischen Flüssigkeit mit Hilfe mechanischer Impulse, beispielsweise durch Schütteln, Rühren oder Mörsern mit harten Mahlpartikeln oder die Einwirkung von Ultraschall, aufgebrochen werden und danach die organische Flüssigkeit abgetrennt wird und der pulverförmige Rückstand in einem wässrigen Extraktionspuffer dispergiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, Zellverbände oder Gewebeproben und die organische Flüssigkeit vor dem Aufbrechen der Zellen gemeinsam mit einer für die Bindung des in der Probe vorhandenen Wassers ausreichenden Menge eines festen Entwässerungsmittels, z. B. eines porösen zum Trocknen organischer Flüssigkeiten geeigneten Molsiebs oder weitgehend wasserfreiem Natrium- oder Magnesiumsulfats oder dergleichen, in einem Konservierungsgefäß eingeschlossen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, bei dem die entwässerte organische Flüssigkeit mit den Zellen, Zellverbänden oder Gewebeproben und einem Pulver aus feinen, harten Mahlpartikeln mit einem vorzugsweise Durchmesser von 1 bis 50 μm sowie mit mindestens einem größeren, harten Mahlkörper, dessen Masse vorzugsweise 1 mg übersteigt, geschüttelt wird, wobei der Volumenanteil der Flüssigkeit am Gefäßvolumen vorzugsweise 40 bis 60% und der Volumenanteil der Mahlpartikel am Gefäßvolumen vorzugsweise 5 bis 30% beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, bei dem die organische Flüssigkeit nach dem Zellaufschluss durch Verdunsten entfernt wird und bei dem die ungefilterte Dispersion auf eine Chromatographiesäule aufgetragen wird, die über einem für die Isolation der Nukleinsäuren geeigneten Trennbett ein Mikrofilter für die feinen Mahlpartikeln und Zellwandbruchstücke enthält, das vorzugsweise aus einer Packung hydrophiler Partikeln mit einem Durchmesser von 2 bis 10 μm gebildet wird.
5. Arbeitsbesteck für die Konservierung und Extraktion hochmolekularer Nukleinsäuren aus lebenden Zellen, Zellverbänden und Gewebeproben, das für jede Probe mindestens ein verschließbares Gefäß, dessen Volumen vorzugsweise zu 40 bis 70% mit einer flüchtigen, weitgehend wasserfreien, mit Wasser mischbaren, organischen Flüssigkeit gefüllt ist, umfasst.
6. Arbeitsbesteck nach Anspruch 5, das zusätzlich für jede Probe harte, feine Mahlpartikeln, vorzugsweise mit einem Durchmesser von 1 bis 50 μm mit einem Gesamtpartikelvolumen, das 5 bis 25% des Gefäßvolumens beträgt, und mindestens einen festen Mahlkörper mit einer Masse über 1 mg umfasst.
7. Arbeitsbesteck nach Anspruch 6, mit einem zur Entwässerung organischer Flüssigkeiten geeigneten Entwässerungsmittel für organische Flüssigkeiten, beispielsweise kristallinem, weitgehend wasserfreiem Natrium- oder Magnesiumsulfat oder dergleichen oder einem zum Trocknen organischer Flüssigkeiten geeigneten Molsieb, wobei das Produkt aus der Masse des Entwässerungsmittels und der massebezogenen Wasserbindungskapazität den Wassergehalt der Probe übersteigt.
8. Arbeitsbesteck nach Anspruch 7, bei dem das Entwässerungsmittel in der Form eines porösen makroskopischen Körpers gebildet ist.