CN111088319B - 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法，其中保存液包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V）。本发明保存液安全无毒、配制简单、使用方便；病毒进入保存液即可使病毒灭活，无须冷藏运输及灭活处理；能在室温下避免RNA降解，可多次冻融而不影响RNA提取的质量；提取过程中也能防止RNA降解，提取的RNA完整性更好，特别适用于有强感染性的流行病毒样本的采集。

Description

一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法。

背景技术

2019新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株，该病毒潜伏期具有传染性，所致疾病没有特异治疗方法，对于数量庞大的疑似患者和密切接触者，早发现、早报告、早隔离、早治疗仍是基本的防控措施。新型冠状病毒目前最常用的检测方法是核酸检测，但火速上市的核酸检测试剂盒出现了阴性率高的问题，这个问题可能让漏诊病例助推疫情蔓延。病毒的核酸检测需要经过采样、运输、提取核酸，RT-qPCR检测这些步骤才能最终获得检测结果，每一个步骤都可能出问题而导致结果不准确，如何控制这些环节的出错率，提升检测的准确性和灵敏度，是亟待解决的问题。

根据《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第四版）》，在普遍用于新冠病毒样本采集的病毒保存液是可保存病毒活性的等渗盐溶液或磷酸盐缓冲液，里面的成分主要是氯化钠，能保存病毒的活性，但无法抑制RNA的降解。这种病毒保存液存在两个问题，第一个问题是，有活性的病毒使运输和检测人员处于被感染的风险中，特别是采集高传染性、高致病性的病毒（如新型冠状病毒）；第二个问题是，该保存液无法避免RNA的降解，采样后需低温运输，并且不能反复冻融，否则，RNA极易受到RNA酶的降解，这些苛刻的条件使检测更困难，RNA的降解是检测阴性率高的其中一个原因。

因此，开发可灭活病毒并保护RNA免受RNA酶降解的病毒RNA保存液是优化病毒样本采集这一步骤的关键，也是为后续荧光定量或测序检测提供有质量保证核酸的关键。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法，其中保存液安全无毒，使用简单，可常温保存病毒样本，保质期达到1年；病毒样本无须冷藏运输及灭活处理，病毒样本进入保存液即可使病毒灭活，并在室温下有效避免RNA降解，冻存的病毒样本可多次冻融而不影响RNA提取的质量；病毒样本保存液可与大多数RNA分离纯化实验操作兼容，特别适用于有强感染性的流行病毒样本的采集。

本发明的技术方案如下：提供一种灭活型病毒样本RNA保存液，包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V）。

进一步地，所述柠檬酸钠的终浓度为15mM~30mM，所述蛋白酶K的终浓度为100~600μg/ml，所述浓硫酸的终浓度为1%~3%（V/V），所述乙二胺四乙酸的终浓度为7mM~30mM，所述硫酸铵的终浓度为50%~70%（W/V）。

进一步地，所述保存液还包括溶剂，所述溶剂为灭菌水。

进一步地，所述保存液的pH值为4.2~6.5。

进一步地，所述保存液的pH值为4.5~5.8。

进一步地，所述保存液的适用样本包括上呼吸道标本、下呼吸道标本、眼结膜拭子、肛拭子、人组织的离体样本、动植物组织的离体样本、人工培养的细胞、血液、体液。

进一步地，所述上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物；所述下呼吸道标本包括深咳痰液、呼吸道抽取物、肺泡组织活检标本。

进一步地，所述适用样本为病毒样本。

本发明还提供一种制备如上所述的灭活型病毒样本RNA保存液的方法，包括以下步骤：

配置乙二胺四乙酸水溶液，调PH至7.0~8.5；

配置柠檬酸钠水溶液；

配置蛋白酶K溶液；

配制硫酸铵溶液，在溶剂中加入硫酸铵搅拌使其溶解；

将上述各配置溶液按比例混合并搅拌均匀后用浓硫酸调pH至4.5~5.8，再用溶剂定容，使各组分达到权利要求1所述浓度；

用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述灭活型病毒样本RNA保存液。

进一步地，所述溶剂为灭菌水；所述滤膜的孔径为0.15μm~0.35μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明保存液安全无毒，使用简单，可广泛用于医院、家庭、科研院所等常温条件下生物样本的大规模采集与保存；采集的病毒样本置于保护液中，无须冷藏运输及灭活处理，病毒进入保存液即可使病毒灭活，使运输和检测人员免于感染的风险；并能在室温下有效避免RNA降解，一定条件下冻存的病毒样本可多次冻融而不影响RNA提取的质量；提取过程中也能防止RNA降解，提取的RNA完整性更好，特别适用于有强感染性的流行病毒样本的采集。

附图说明

图1为慢病毒在灭活型病毒样本RNA保存液中分别保存1d、4d或8d，RT-qPCR检测GFP基因的结果图；

图2为慢病毒在PBS或病毒RNA保存液中保存过夜，稀释后感染293T细胞，荧光显微镜下观察病毒感染活性的结果图；

图3为细胞样本室温放置3天后的RNA凝胶电泳图；

图4为小鼠肝脏样本室温放置4天后的RNA凝胶电泳图；

图5为小鼠肝脏样本室温放置7天后的RNA凝胶电泳图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、本发明灭活型病毒样本RNA保存液的配方主要包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，优选为10mM~30mM；蛋白酶K的终浓度为50 ~800 μg/ml，优选为100 ~600μg/ml；浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），优选为1%~3%（V/V）；乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，优选为7mM~30mM；硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V），优选为50%~70%（W/V）。上述保存液还包括溶剂，优选为灭菌水。上述保存液的pH值为4.2~6.5，优选pH值为4.5~5.8。

上述保存液的适用样本包括上呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物）、下呼吸道标本（深咳痰液、呼吸道抽取物、肺泡组织活检标本）、眼结膜拭子、肛拭子、人组织的离体样本、动植物组织的离体样本、人工培养的细胞、血液、体液。适用样本优选为病毒样本。

二、配置所述灭活型病毒样本RNA保存液，具体方法为：

配置乙二胺四乙酸（EDTA）水溶液，调PH至7.0~8.5；配置柠檬酸钠水溶液；配置蛋白酶K水溶液；在灭菌水中加入硫酸铵搅拌使其溶解；将上述各配置溶液按比例混合搅拌均匀后用浓硫酸调pH至4.5~5.8，用灭菌水定容，使各组分达到上述要求的终浓度；用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述灭活型病毒样本RNA保存液。

下面提供本发明的六种具体实施方式，所述灭活型病毒样本RNA保存液的配方如表1所示。

表1

组份	终浓度范围	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
								柠檬酸钠	10mM~35mM	15	25	22	28	25	20
蛋白酶K	50 ~800 μg/ml	50	100	200	300	400	550
								浓硫酸	0.5%~5%（V/V）	2	3	2.5	3	3.2	3.5
EDTA	5mM~50mM	20	10	15	8	10	18
								硫酸铵	45%~80%（W/V）	50	70	65	60	68	73

三、以上述实施例3中的所述灭活型病毒样本RNA保存液为例，具体说明本发明RNA保存液的应用：

应用一：所述灭活型病毒样本RNA保存液在病毒样本RNA保存中的应用：

第一步，设置实验组和对照组，实验组：取20μl 滴度为2x10^8 TU/ml 的慢病毒（一种RNA工具病毒）置于500μl 上述实施例3的RNA保存液中，分别置于室温和4℃中；对照组：将上述慢病毒未加上述RNA保存液置于-80℃保存。将实验组和对照组在分别放置1天、4天或8天后，分别提取病毒RNA和RT-qPCR检测。

第二步，病毒RNA的提取（采用OMEGA公司的E.Z.N.A. Viral RNA Kit R6874进行提取）：

加入500μl QVL Lysis Buffer 到1.5mL 离心管中；

加入100μl含上述病毒的RNA保存液（实验组）或4μl上述慢病毒至管中，涡旋混匀30s；

室温放置5-10min，短暂离心收集管盖上液体；

加入350μl 无水乙醇至管中，涡旋30s 混匀，短暂离心收集管盖上液体；

将HiBind® RNA Mini Column 套入到2mL 收集管中（收集管由试剂盒提供），转移750μl 混合液至HiBind® RNA Mini Column 中，最大速度＞13,000xg 离心15s，弃除废液；重复此步骤，直至所有混合液通过，即把未转移完的混合液再次加到结合柱中，离心，弃除废液；

将HiBind® RNA Mini Column 套回到2mL 收集管中（收集管由试剂盒提供），加入500μl 已稀释的VHB Buffer，最大速度＞13,000xg 离心15s，弃除废液；

将HiBind® RNA Mini Column 套入到新的2mL 收集管中（收集管由试剂盒提供），加入500μl 已稀释的RNA Wash Buffer II，最大速度＞13,000xg 离心15s，弃除废液；重复此步骤，即进行第二次RNA Wash Buffer II 洗涤；

将HiBind® RNA Mini Column 套回到2mL 收集管中，最大速度＞13,000xg 离心2min 至柱基质完全干燥；

将HiBind® RNA Mini Column 套入到新的1.5mL 离心管中，加入20μl DEPCWater，最大速度＞13,000xg 离心1min 洗脱RNA。

上述提取RNA的方法不是使用本发明所述灭活型病毒样本RNA保存液时提取RNA的唯一方法，磁珠纯化法、传统的氯仿抽提法、Trizol法等也可配合使用。

第三步，将通过上述提取方法获得的RNA进行逆转录反应，采用TAKARA 公司的PrimeScript™ RT Master Mix（RR036A）试剂进行逆转录反应。

配置逆转录反应体系，配方如表2所示：

表2

试剂	使用量
		5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)	2μl
Total RNA	8μl

轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下: 37℃×15 min（反转录反应），85℃×5min（反转录酶的失活反应），4℃×5min。

第四步，荧光定量PCR反应：每个反应管添加40μl灭菌水稀释cDNA，采用TAKARA 公司的TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)（RR820A）试剂进行荧光定量PCR反应，检测慢病毒中的绿色荧光（GFP）基因。

配置荧光定量PCR反应体系，配方如表3所示：

表3

试剂	使用量(μl)
		TB Green® Premix ( 2X )	10
GFP Forward Primer (10 μM)	0.5
		GFP Reverse Primer (10 μM)	0.5
ROX Reference Dye (50X)	0.4
		cDNA	8.6
Total	20

轻柔混匀后进行荧光定量PCR反应，条件如表4所示：

表4

结果分析：

从图1的结果可以看出，使用本发明所述灭活型病毒样本RNA保存液保存的病毒，在室温或者4℃下保存1-8天，与未加上述保存液置于-80℃的病毒相比，荧光定量PCR检测的GFP基因表达量并无差异，这说明慢病毒在室温下并未发生RNA的降解，证明本发明保存液能稳定有效的在室温下保存病毒的RNA长达8天。

另外，为了测试本发明所述灭活型病毒样本RNA保存液是否能灭活病毒，我们还做了病毒活性检测：

第一步，设置实验组和对照组，实验组：取20μl 滴度为2x10^8 TU/ml 的慢病毒置于500μl上述实施例3的RNA保存液中。对照组：取20μl 滴度为2x10^8 TU/ml 的慢病毒置于500μl PBS（磷酸缓冲液）中。将实验组和对照组分别置于室温和4℃中1d。

第二步，将上述实验组和对照组进行稀释，稀释后分别取8x10^2 TU的病毒液感染293T细胞（293T细胞提前一天种于96孔板中），感染2天后，在荧光显微镜下观察病毒感染活性。

结果分析，如图2所示，保存在PBS中的慢病毒仍具有感染细胞的活性，从显微镜下能观察到数十个荧光蛋白（GFP）的表达，但保存于本发明RNA保存液的慢病毒，在显微镜下未观察到一个荧光蛋白，这个结果说明，本发明RNA保存液能有效的灭活RNA病毒。

应用二、本发明所述灭活型病毒样本RNA保存液除了应用于病毒样本RNA的保存，还可用于常见组织及人工培养细胞中RNA的保护，具体应用方法如下：

分别收集新鲜的细胞和小鼠肝脏组织，加入适量的上述实施例3的RNA保存液后室温放置数天，使用Zymo Research的Direct-zolTM RNA MiniPrep试剂盒提取RNA，并进行RNA电泳鉴定提取质量，结果如图3至图5所示。

图3为细胞样本室温放置3天后的RNA凝胶电泳图，图中从左到右，M表示DNAMarker、1道表示添加了上述实施例3的RNA保存液的样本、2道表示未添加任何保护液的样本。

图4为小鼠肝脏样本室温放置4天后的RNA凝胶电泳图，图中从左到右，M表示DNAMarker、1道表示添加了上述实施例3的RNA保存液的样本、2道表示未添加任何保护液的样本。

图5为小鼠肝脏样本室温放置7天后的RNA凝胶电泳图，图中从左到右，M表示的是DNA Marker、1道表示添加了上述实施例3的RNA保存液的样本、2道表示未添加任何保护液的样本。

图3至图5中，注明的DNA Marker指示的条带大小为10000bp、2000bp和300bp。从图3至图5中可知，没有添加任何保护液的样本RNA完全降解，说明RNA在没有适当的保存情况下极易降解；新鲜样本在添加了本发明所述的灭活型病毒样本RNA保存液后，在室温下能有效避免RNA降解，良好保存样本RNA的稳定。

综上所述，本发明的有益效果是：本发明保存液安全无毒，使用简单，可广泛用于医院、家庭、科研院所等常温条件下生物样本的大规模采集与保存；采集的病毒样本置于保护液中，无须冷藏运输及灭活处理，病毒进入保存液即可使病毒灭活，使运输和检测人员免于感染的风险；并能在室温下有效避免RNA降解，一定条件下冻存的病毒样本可多次冻融而不影响RNA提取的质量；提取过程中也能防止RNA降解，提取的RNA完整性更好，特别适用于有强感染性的流行病毒样本的采集。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，硫酸铵的浓度为45%~80%（W/V）；所述保存液的适用样本包括动物组织的离体样本、人工培养的细胞和病毒样本；所述保存液的pH值为4.5~5.8。

2.根据权利要求1所述的灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，所述柠檬酸钠的终浓度为15mM~30mM，所述蛋白酶K的终浓度为100~600μg/ml，所述浓硫酸的终浓度为1%~3%（V/V），所述乙二胺四乙酸的终浓度为7mM~30mM，所述硫酸铵的终浓度为50%~70%（W/V）。

3.根据利要求1或2所述的灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，还包括溶剂，所述溶剂为灭菌水。

4.制备权利要求1所述的灭活型病毒样本RNA保存液的方法，其特征在于，包括以下步骤：

配置乙二胺四乙酸水溶液，调PH至7.0~8.5；

配置柠檬酸钠水溶液；

配置蛋白酶K溶液；

配制硫酸铵溶液，在灭菌水中加入硫酸铵搅拌使其溶解；

将上述各配置溶液按比例混合并搅拌均匀后用浓硫酸调pH至4.5~5.8，再用灭菌水定容，使各组分达到权利要求1中所述浓度；

用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述灭活型病毒样本RNA保存液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.15μm~0.35μm。

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