CN107227306B - 一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液 - Google Patents

一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液 Download PDF

Info

Publication number
CN107227306B
CN107227306B CN201710493469.7A CN201710493469A CN107227306B CN 107227306 B CN107227306 B CN 107227306B CN 201710493469 A CN201710493469 A CN 201710493469A CN 107227306 B CN107227306 B CN 107227306B
Authority
CN
China
Prior art keywords
swab
eluent
sample
nucleic acid
surfactant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710493469.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107227306A (zh
Inventor
高利飞
秦明明
高歌
肖李亚
李振红
李桂林
付光宇
吴学炜
苗拥军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Autobio Diagnostics Co Ltd
Original Assignee
Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Autobio Diagnostics Co Ltd filed Critical Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority to CN201710493469.7A priority Critical patent/CN107227306B/zh
Publication of CN107227306A publication Critical patent/CN107227306A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107227306B publication Critical patent/CN107227306B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，是由异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、缓冲液、二硫苏糖醇、表面活性剂、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去离子水组成，其中洗脱液中各组分的含量为20%～55%[w/v]异硫氰酸胍，1mM‑25mM乙二胺四乙酸，20‑100mM缓冲液，二硫苏糖醇1%‑5%[w/v]，1%‑5%表面活性剂，玻璃珠或聚丙烯塑料珠3‑10粒。本发明配制的洗脱液具有成本低，性能稳定，配制的洗脱液可以保存DNA/RNA,实现拭子样本洗脱和常温保存运输：并且可以灭活病原体，具有样本的灭活作用，可大大降低实验室暴露感染的风险，由于洗脱液中用到的异硫氰酸胍是常见的核酸提取用化学组分，所以还不影响后续核酸提取。

Description

一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液
技术领域
本发明涉及生物样本处理液，尤其是涉及一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液。
背景技术
为准确诊断疾病，采用拭子采集标本（微生物、脱落的细胞或分泌物等），并对标本进行保存、培养、分离等进一步处理，是临床医学检查常用的方法。
核酸样本DNA/RNA降解是PCR检测中常见问题。目前常见的样品处理液一般为生理盐水或PBS洗脱液，经过这些洗脱液处理后的核酸样本保存过程中，病原体会破裂，释放出核酸，但生理盐水和PBS洗脱液无法抑制DNase/RNase 活性，核酸很容易被降解，从而影响检测结果的准确性。实际临床核酸检测中，部分标本还需要寄送到第三方检验中心进行检测，运输过程中需要维持低温保存冷链运输，代价比较高。因此标本的常温运输保存也是需要解决的问题。
检测过程中还会遇到一些有生物危害性的样本，比如呼吸道传播疾病或接触传播疾病，这些样品采集后，医护人员在检验操作过程中容易带来实验室暴露感染。所以如何实现这些有生物危害性的样本采集后就被灭活，以减少实验室检验人员感染的风险，也是需要解决的问题。
中国发明专利《一种宫颈脱落细胞保存液》（CN200810200008.7）公开了一种保存液，包括以下组分及含量(重量)：醇类20％-50％；抗聚集试剂15％-50％；缓冲液5％-10％；离子强度维持试剂1％-20％；抗微生物试剂0.01％-0.5％；粘液溶解试剂0.1-5％；清洁剂0-0.5％。该专利的主要功能可使细胞在体外液体悬浮液环境中保持细胞形态。但是，该保存液对样本中的RNA样本无保存效果；同时，由于细胞未被灭活，细胞中的病毒有可能在操作中传染给检验操作人员。
在该技术领域，还有采用Trizol 保存液的，该保存液可以较好的保存RNA样本，也可通过加热灭活病毒，但由于存在有毒挥发气体，对操作者有危害。
除此之外，还有采用RNase inhibitor 酶类来保存RNA样本，但是成本较贵，其应用受限。
综上所述，开发一种能够有效实现拭子样本的常温保存运输，阻止Dnase/RNase降解核酸，灭活病原体，并且不影响后续检测的拭子洗脱液，对拭子样本的分子生物学研究和临床上的应用非常重要，也是目前迫切需要解决的重要技术难题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，是由异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、缓冲液、二硫苏糖醇、表面活性剂、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去离子水组成，其各组分的含量为：
20%～55%[w/v]异硫氰酸胍，1mM-25mM乙二胺四乙酸，20-100mM缓冲液，二硫苏糖醇1%-5%[w/v]，1%-5%表面活性剂，玻璃珠或聚丙烯塑料珠3-10粒。
所述缓冲液可以为Tris缓冲液，也可以为磷酸盐缓冲系统。
所述表面活性剂为Triton X-100、SDS、Tween 20、Triton X-100、NP_40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB中任意一种或其中2-3种的组合，浓度为1-5%。优选的表面活性剂为TritonX-100。
本发明的优点在于该洗脱液具有成本低，性能稳定，洗脱后样本可室温保存运输，并且具有样本的灭活作用，可大大降低实验室暴露感染的风险。
本发明配制的洗脱液可以保存DNA/RNA,实现拭子样本洗脱和常温保存运输：采用异硫氰酸胍作为离液剂和强变性剂，用于变性裂解细胞，具有抑制Dnase/RNase活性功能，可用于保存DNA和RNA不被酶降解；玻璃珠或聚丙烯塑料珠可以通过物理涡旋撞击作用，促进细胞从拭子上脱落；乙二胺四乙酸和缓冲液维持了DNA/RNA的缓冲环境，维持核酸的稳定性。
本发明配制的洗脱液可以灭活病原体：高浓度20%～55%[w/v]异硫氰酸胍作为离液剂和蛋白强变性剂，用于变性裂解细胞；二硫苏糖醇被用于蛋白质中二硫键的还原，促进细胞破裂；表面活性剂（如Triton X-100）是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂），它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性，促进细胞破裂，从而灭活病原微生物。
本发明配制的洗脱液不影响后续核酸的提取：由于洗脱液中用到的异硫氰酸胍是常见的核酸提取用化学组分，所以不影响后续核酸提取。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做更加详细的说明。
实施例1
1、拭子洗脱液的配制：
取合适体积的烧杯，按照下表1配方称量试剂并依次加入烧杯，添加去离子水400ml，加热搅拌溶解，恢复室温后，用盐酸调节pH至6.0，补足去离子水至1L，搅拌后，制备得到1L 拭子洗脱液。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2、标本采集处理：取临床PCR鉴定甲流阳性的患者拭子标本，病毒滴度有代表性，高中低（Realtime PCR检测CT值分别为26 、29、 32左右）各1例，分别浸入含8ml拭子洗脱液的10ml离心管中；
在涡旋仪上涡旋震荡5s，丢弃拭子，洗脱物分装2ml/支；
将洗脱物分别放置于37℃，常温，4℃，-20℃四个温度下进行热稳定性考核。
洗脱物37℃ 条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物常温条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物4℃条件放置1周，2周，3周，4周，5周，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本4℃条件放置是否稳定。
洗脱物-20℃条件放置1月，2月，3月，6月，7月，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本-20℃条件放置是否稳定。
3、样本提取和Realtime PCR检测：
采用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit 货号：80204
甲流Realtime PCR检测试剂采用自配试剂，荧光定量PCR体系：1*PCR buffer、2.5mM镁离子、0.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP，上、下游引物（SEQ ID NO 1-2）量均为200nM，检测探针 FAM BHQ1 标记（SEQ ID NO 3）量为100nM。其引物序列见下表2。
表2
Figure 399121DEST_PATH_IMAGE002
实时荧光PCR设备采用安捷伦Mx3005P。
结果分析阈值线：300。
基线：3-15。
4、结果：
37℃保存7天以内，样本无明显降解，实验数据见下表3。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
注：第一天有异常数据，剔除。
常温保存7天以上样本无明显降解，实验数据见下表4。
表4
Figure 808937DEST_PATH_IMAGE004
4℃保存5周以上，样本无明显降解，实验数据见下表5。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE005
-20℃保存半年以上，样本无明显降解，实验数据见下表6。
表6
Figure 211843DEST_PATH_IMAGE006
通过上述考核，证明本发明配制的拭子洗脱液可以保存DNA/RNA,实现拭子样本洗脱和常温的保存。
5、本发明洗脱液的病毒灭活效果实验：
对拭子洗脱液进行稀释（稀释100倍），以去除对细胞的抑制效果，取200ul进行接种；
采用友康 NC0201 MDCK无血清细胞培养基配合NC0204 流感病毒分离无血清培养基，进行毒株活性验证。24h后，均无细胞病变，说明病毒已灭活。
6、上表3、4、5、6中拭子洗脱物提取和Realtime PCR结果正常，说明本发明配制的洗脱液对后续提取和Realtime PCR实验无影响。
实施例2
1、拭子洗脱液制备
取合适体积的烧杯，按照下表7配方称量试剂并依次加入烧杯，添加去离子水400ml，加热搅拌溶解，恢复室温后，用盐酸调节pH至6.0，补足去离子水至1L，搅拌后，即制备得到1L 拭子洗脱液。
表7
Figure DEST_PATH_IMAGE007
2、标本采集处理：取临床PCR鉴定支原体阳性的患者拭子标本，病毒滴度有代表性，高中低（样本Realtime检测CT值分别为23、26、30左右）各1例，分别浸入含8ml拭子洗脱液的10ml离心管中；
在涡旋仪上涡旋震荡5s，丢弃拭子，分装2ml/支；
将洗脱物分别放置于37℃，常温，4℃，-20℃进行稳定性考核。
洗脱物37℃ 条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物常温条件放置1天，2天，3天，6天，7天，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本是否稳定。
洗脱物4℃条件放置1周，2周，3周，4周，5周，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本4℃条件放置是否稳定。
洗脱物-20℃条件放置1月，2月，3月，6月，7月，进行核酸提取和Realtime PCR扩增检测。对多天的检测CT值进行汇总比较，确定样本-20℃条件放置是否稳定。
3、样本提取和Realtime PCR检测：
采用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit 货号：80204
支原体Realtime PCR检测试剂采用自配试剂，荧光定量PCR体系：1*PCR buffer、2.5mM镁离子、0.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP，上、下游引物（SEQ ID NO 4-5）量均为200nM，检测探针 FAM BHQ1 标记（SEQ ID NO 6）量为100nM，其引物序列见下表8。
表8
Figure 236080DEST_PATH_IMAGE008
实时荧光PCR设备采用：安捷伦Mx3005P
结果分析阈值线：300。
基线：3-15。
4、结果
37℃保存7天以上，样本无明显降解，实验数据见下表9。
表9
Figure DEST_PATH_IMAGE009
常温保存7天以上，样本无明显降解，实验数据见下表10。
表10
Figure 738868DEST_PATH_IMAGE010
4℃保存5周以上，样本无明显降解，实验数据见下表11。
表11
Figure DEST_PATH_IMAGE011
-20℃保存半年以上，样本无明显降解，实验数据见下表12。
表12
Figure 496084DEST_PATH_IMAGE012
5、本发明洗脱液的病毒灭活效果实验：
对拭子洗脱液进行稀释（稀释100倍），以去除对细胞的抑制效果，取200ul进行接种。
采用郑州安图生物工程股份有限公司生产的M0502 肺炎支原体培养试剂，进行毒株活性验证。48h后，均无病毒生长，说明支原体已灭活。
6、上表9、10、11、12中拭子洗脱物提取和Realtime PCR结果正常，说明本发明配制的洗脱液对后续提取和Realtime PCR实验无影响。

Claims (2)

1.一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，其特征在于：是由异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、缓冲液、二硫苏糖醇、表面活性剂、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去离子水组成，其各组分的含量为：
20%～55%异硫氰酸胍，1mM-25mM乙二胺四乙酸，20-100mM缓冲液，1%-5%二硫苏糖醇，1%-5%表面活性剂，玻璃珠或聚丙烯塑料珠3-10粒；
所述缓冲液为Tris缓冲液或磷酸盐缓冲系统；
所述表面活性剂为Triton X-100、SDS、Tween 20、Triton X-100、NP_40、十二烷基肌氨酸钠、CTAB中任意一种或2-3种的组合。
2. 根据权利要求1所述的具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液，其特征在于：所述表面活性剂为Triton X-100。
CN201710493469.7A 2017-06-26 2017-06-26 一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液 Active CN107227306B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710493469.7A CN107227306B (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710493469.7A CN107227306B (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107227306A CN107227306A (zh) 2017-10-03
CN107227306B true CN107227306B (zh) 2021-01-26

Family

ID=59935446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710493469.7A Active CN107227306B (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107227306B (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723285A (zh) * 2017-10-18 2018-02-23 中山大学肿瘤防治中心 一种通用于常规生物样本的总dna提取方法及提取试剂盒
US20220333156A1 (en) * 2019-09-18 2022-10-20 Technosuruga Laboratory Co., Ltd. Sample preservation solution, and analysis device and analysis method using the same
CN110760567A (zh) * 2019-11-12 2020-02-07 杭州昱鼎生物科技有限公司 尿液样本rna稳定液及制备方法
CN111041024A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 一种核酸提取试剂盒及提取核酸的方法
CN112522360A (zh) * 2020-02-06 2021-03-19 博尔诚（北京）科技有限公司 一种组合物、采样装置、试剂盒及居家病毒检测方法
CN111088319B (zh) * 2020-03-25 2020-07-21 深圳市上为生物科技有限公司 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法
CN111454941A (zh) * 2020-04-13 2020-07-28 武汉轻工大学 一种采样液以及气溶胶中dna病毒的采样方法
CN112176029B (zh) * 2020-06-12 2021-05-14 中山大学达安基因股份有限公司 一种拭子核酸样本释放剂及其应用
CN111850090B (zh) * 2020-08-05 2021-11-09 珠海市丽拓生物科技股份有限公司 一种有效保存病毒样品的病毒保存液
CN112375844A (zh) * 2020-11-05 2021-02-19 天津金歌联合生物科技有限公司 一种异硫氰酸胍泡腾片及制备方法
CN112779316A (zh) * 2021-01-27 2021-05-11 苏州赛普生物科技有限公司 一种灭活型病毒保存液及其制备方法
CN113736755B (zh) * 2021-08-18 2024-01-19 江苏默乐生物科技股份有限公司 一种可常温保存的灭活型病毒保存液及其制备方法
CN113980954A (zh) * 2021-11-11 2022-01-28 德州学院 一种病毒rna保护剂及其制备方法与应用
CN115363637A (zh) * 2022-08-23 2022-11-22 宁波海尔施基因科技股份有限公司 一种唾液样本采集卡及利用该采集卡采集唾液样本的方法
CN116497085A (zh) * 2022-12-13 2023-07-28 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种病毒裂解保存液

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263721A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 宁波有成生物医药科技有限公司 一种保护痰液中核酸(dna和rna)的痰纸及核酸提取方法
CN105176969A (zh) * 2015-07-13 2015-12-23 杭州优思达生物技术有限公司 一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂
CN105368817A (zh) * 2015-12-08 2016-03-02 苏州国科闻普生物科技有限公司 宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263721A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 宁波有成生物医药科技有限公司 一种保护痰液中核酸(dna和rna)的痰纸及核酸提取方法
CN105176969A (zh) * 2015-07-13 2015-12-23 杭州优思达生物技术有限公司 一种用于生物样本的核酸提取方法及试剂
CN105368817A (zh) * 2015-12-08 2016-03-02 苏州国科闻普生物科技有限公司 宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107227306A (zh) 2017-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107227306B (zh) 一种具有样本保存和灭活功能的拭子洗脱液
CN111363729B (zh) 一种rna病毒灭活保存液及其应用
EP1356302B1 (en) Method and device for collecting and stabilizing a biological sample
US6617170B2 (en) Method and device for collecting and stabilizing a biological sample
WO2020143135A1 (zh) 核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒
CN111718908B (zh) 病毒样本保存液及其制备方法和应用
CN111088319B (zh) 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法
CN111518775B (zh) 一种长时间常温保存病毒样本的保存液及其应用
JP6533468B2 (ja) 目的の核酸の特異的な単離方法
CN112626169B (zh) 用于保存生物样本中核酸的样本保存液及其使用方法
CN109371008B (zh) 一种核酸提取扩增检测试剂盒
CN109679946B (zh) 一种血液病毒rna保护剂及采血管
CN112725406A (zh) 一种免核酸提取的灭活型病毒保存液及其应用
Yu et al. Comparative evaluation of three preprocessing methods for extraction and detection of influenza A virus nucleic acids from sputum
CN110819625A (zh) 一种适用于细菌和/或真菌的基因组dna提取方法
CN113736748A (zh) 一种样本保存液及其应用
CN117305413A (zh) 一种核酸采样裂解保存液及其应用和核酸提取方法
CN116287122A (zh) 一种灭活型病毒保存液及其制备方法
CN115558704A (zh) 一种rna样本保存液及其应用
Bonin et al. RNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
Li et al. Establishment of a multiplex RT-PCR assay for identification of atmospheric virus contamination in pig farms
CN113293195A (zh) 一种低泡沫兼容磁珠法提取的核酸保存液
EP4188082A1 (en) Aqueous solution to preserve nucleic acids
WO2022031992A1 (en) Lysis buffer compositions and methods for preparing a viral biological sample useful for covid-19 testing
CN112592961A (zh) 一种核酸样本保存液及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant