CN113293195A - 一种低泡沫兼容磁珠法提取的核酸保存液 - Google Patents

Abstract

本发涉及一种低泡沫、兼容磁珠法核酸提取的灭活型病毒核酸保存液，主要包含以下主要成分：核酸酶抑制剂0.1‑2％(w/v)，蛋白变性剂0.1‑0.5％(w/v)，缓冲稳定剂1‑5％(w/v)，除泡剂0.1‑1％(w/v)。本保存液可以直接灭活病毒，保存病毒核酸片段，抑制核酸酶活性，保护医务人员，减少感染风险。可采集咽拭子，鼻拭子或特定部位组织样本，可储存和运输样本用于后续的核酸提取。在强烈震荡后，保存液中产生的泡沫将在静置20秒后迅速消失，不影响后续取样操作。

Description

一种低泡沫兼容磁珠法提取的核酸保存液

技术领域

本发明涉及生物医药技术邻域，具体涉及一种低泡沫兼容磁珠法提取的核算保存液。

背景技术

目前对于SARS-CoV-2感染，最主要的检测方法是核酸检测。临床大多采用实时荧光RT-PCR技术或反转录-聚合酶链式反应，采用的样本为感染者的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液及粪便等，这些都含有SARS-CoV-2特异性的RNA序列。

在医学检验中在提取疑似病例样本中的核酸(DNA或RNA)，首先需要对样本进行病毒灭活，保证临检医护人员的安全。目前市场上病毒保存液基本可以满足以上需求，比如Hanks液、PBS缓冲液，采用56℃水浴灭活或者60℃干浴灭活。但是也存在一些缺陷，病毒的核酸是比较容易降解的，尤其是RNA病毒，非常容易被环境中以及内源性的RNA酶降解。而RNA酶性质稳定，即使高温高压处理也无法使其失活。另外Hanks液中含有的营养物质，容易使其生菌导致PH值下降，导致病毒稳定性下降，常常需要低温运输及时送检。基于以上灭活型保存液，可以及时灭活病毒，又能短时间避免核酸的降解。其大多数灭活保存液中都需要加入了离子表面活性剂或非离子表面活性剂使病毒蛋白质变性及抑制核酸酶活性等。在医学检验中提取疑似样本中的核酸来检测是否存在致病病毒。而在采集样本的过程中，受到时间或距离的限制，一般需要将待测样本送至特定的地点才能进行检测。其中保存液中所含有的离子或非离子表面活性剂在长距离运输过程中，以及科研人员后期实际操作中 (使用旋涡振荡器、离心机离心等)，容易使保存液产生大量的泡沫，容易出现渗漏，影响后期科研人员的检验。

目前传统的核酸提取和纯化方法技术操作繁琐，费时费力，不适合大批量样品的核酸提取和纯化，目前市面上已开发了多种基于磁珠提取核酸的仪器，一次性可以进行96样本的核酸提取，减少了时间成本。磁珠法病毒核酸提取都是通过蛋白酶K加裂解液，硅基磁性粒子在高浓度离子化剂条件下，通过氢键和静电吸附核酸，从而去除蛋白质和其它杂质。最后用低盐缓冲液(如Buffer TE)或水洗脱出磁珠上的核酸。常规的病毒保存采用Hank's液或PBS，里面的主要成分为氯化钠，加大样本量会稀析裂解液的盐浓度，导致核酸得率下降。申请号:CN202010571607.0及CN202010128653.3公开了以硫氰酸+胍和盐酸胍为基础的样本保存液，可灭活病毒。但这类含胍的样本保存液必须加入表面活性剂，否则会大大影响病毒灭活效果。加入表面活性剂会导致保存液极易产生泡沫，出现渗漏，影响科研人员的操作，甚至危害其安全。

因此，急需开发一种可即可灭活病毒，保护科研人员免受被感染的风险。同时减少保存液泡沫对后续临床检验的影响，优化病毒采集。

发明内容

由此可见，本发明提供一种低泡沫兼容磁珠法提取的核酸保存液，其保存液可常温运输无需低温，采集样本后样本进入保存液后即刻灭活，RNA在常温数天内不会被降解。并进一步的做出技术改进，低泡沫保存液不影响后续科研人员操作。

本发明保存液包括：核酸酶抑制剂0.1-2％(w/v)，蛋白变性剂0.1-0.5％(w/v)，缓冲稳定剂1-5％(w/v)。

上述技术方案中，进一步阐述：核酸酶抑制剂为EDTA，EGTA， CDTA，焦磷酸二乙脂，氧钒核糖核酸复合物，硅藻土中的其中一种。

上述技术方案中，进一步阐述：蛋白变性剂为SDS,曲拉通X- 100，尿素，三氯乙酸，巯基乙醇，DTT中一种或两种。

上述技术方案中，进一步阐述：缓冲稳定剂为乙酸钠，三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸钠，甘氨酸，甘露糖中一种或两种。

上述技术方案中，进一步阐述：消除泡沫主要采用无水乙醇5- 15％(w/v)，聚醚消泡剂0.01-0.05％(w/v)。

本发明的保存液能够灭活病毒并且可以常温运输，保护医护人员的安全。同时常温下防止核酸降解，保证RNA的完整性，兼容市场主流的核酸提取。本保存液主要技术解决了保存液产生泡沫难以消除的问题，方便了病毒的采集，运输，检测。本保存液具有低成本，高稳定等优点。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例一：

保存液的制备：称取异硫氰酸胍472.64g，柠檬酸二钠7.5g，乙二胺四乙酸二钠0.75g，曲拉通X-100 2mL，乙醇100mL，加入纯化水定容至1L，使得异硫氰酸胍的终浓度为4M/L，柠檬酸二钠的最终浓度为25mM/L，乙二胺四乙酸二钠的最终浓度为2mM/L，曲拉通按重量体积比为0.2％(w/v)，乙醇按重量体积比为10％(w/v)。配制完成后，将溶液通过0.25μm的滤膜除菌。

实施例二：

保存液的制备：称取异硫氰酸胍472.64g，柠檬酸二钠7.5g，乙二胺四乙酸二钠0.75g，曲拉通X-100 2mL，乙醇100mL，聚醚消泡剂0.1mL,加入纯化水定容至1L，使得异硫氰酸胍的终浓度为 4M/L，柠檬酸二钠的最终浓度为25mM/L，乙二胺四乙酸二钠的最终浓度为2mM/L，曲拉通按重量体积比为0.2％(w/v)，乙醇按重量体积比为10％(w/v),聚醚消泡剂按重量体积比为0.01％(w/v)。配制完成后，将溶液通过0.25μm的滤膜除菌。

实施例三：

保存液的制备：称取异硫氰酸胍472.64g，柠檬酸二钠7.5g，乙二胺四乙酸二钠0.75g，曲拉通X-100 2mL，乙醇80mL，聚醚消泡剂0.3mL,加入纯化水定容至1L，使得异硫氰酸胍的终浓度为 4M/L，柠檬酸二钠的最终浓度为25mM/L，乙二胺四乙酸二钠的最终浓度为2mM/L，曲拉通按重量体积比为0.2％(w/v)，乙醇按重量体积比为8％(w/v),聚醚消泡剂按重量体积比为0.03％(w/v)。配制完成后，将溶液通过0.25μm的滤膜除菌。

Claims (5)

1.一种低泡沫、兼容磁珠法核酸提取的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：主要由核酸酶抑制剂0.1-2％(w/v)，蛋白变性剂0.1-0.5％(w/v)，缓冲稳定剂1-5％(w/v)，除泡剂0.1-25％(w/v)。

2.根据权利要求1所述的一种低泡沫、兼容磁珠法核酸提取的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：核酸酶抑制剂为EDTA，EGTA，CDTA，焦磷酸二乙脂，氧钒核糖核酸复合物，硅藻土中的其中一种。

3.根据权利要求1所述的一种低泡沫、兼容磁珠法核酸提取的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：蛋白变性剂为SDS,曲拉通X-100，尿素，三氯乙酸，巯基乙醇，DTT中一种或两种。

4.根据权利要求1所述的一种低泡沫、兼容磁珠法核酸提取的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：缓冲稳定剂为乙酸钠，三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸钠，甘氨酸，甘露糖中一种或两种。

5.根据权利要求1所述的一种低泡沫、兼容磁珠法核酸提取的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：消除泡沫主要采用增加无水乙醇15-25％(w/v)。