CN108220281A

CN108220281A - 一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液的制备和运用

Info

Publication number: CN108220281A
Application number: CN201710871901.1A
Authority: CN
Inventors: 王亮; 李燕; 薛纬莹; 王磊; 郑春阳
Original assignee: TIANJIN QIANGWEITE BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: TIANJIN QIANGWEITE BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，本发明涉及一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液及其制备与应用，包括如下组分和含量：Tris‑HCl为10–200mmol/L，SDS 0.2‑1%（w/v），EDTA 300‑800mmol/L，氯化钠500‑750mmol/L，蛋白酶K 50to500μg/mL，1‑5×10⁸颗/mL结合DNA的磁珠，pH范围在6‑10之间。本发明的唾液保存液用于保存在生物样品时,如唾液和尿液,能够在室温条件下运输，或者长期保存生物样本中核酸，适用于生物样本在各采集地之间运输过程和长期的样本保存，便于基因检测及相关科学临床研究。

Description

一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液的制备和运用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及到一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液的制备和运用。

背景技术

归功于技术的进步，尤其是2006 年第二代测序仪诞生，通量的急剧提升，成本价格更是以超摩尔定律下降：个人基因组测序费用从2001年的1亿美元下降至2014年的1000美元以下。现如今基因测序技术正进入普通人的生活中，通过一口唾液，就能知道你的性格、血型、各种疾病的可能性或者祖宗从哪来的,现在基因测序离我们可谓越来越近。

基因测序中，样本的获得正获得越来越多的重视。生物样本，包括但不仅限于唾液，尿液，含有脱落细胞或者游离的DNA片段，比起提取血液中的DNA有以下优点：a，简便易行，无穿刺； b，不需要医用无菌设备，如配备注射器、消毒用具等等，也不用培训专业的抽血人员。

唾液或者尿液中还含有多种微生物和脱落的细胞，它们在破解后会释放出多种酶，降解唾液或者尿液中的DNA样本，因此，在运输和保存过程中，保持原有基因组DNA完整和抑制微生物的生长，对保存DNA原始信息和下游应用至关重要。

DNA提取方法繁多，包括传统的酚-氯仿法、滤膜离心柱法、盐析法等。磁珠法不需离心，操作简单，是已成为目前新兴的DNA提取技术。在磁场作用下，DNA被吸附到磁性颗粒的特殊处理表面，而蛋白等分子不被吸附而留在溶液中。除去含有杂质的溶液后，磁珠上吸附的高纯度的DNA并用可相应的洗脱液洗脱。

吸附DNA的磁珠以往都用于核酸的纯化，普遍认为需要盐酸胍高盐。有研究表明，当胍盐裂解液稀释度降低到60%以下时，样品DNA回收效率明显降低。而且胍盐成分不稳定，尤其易受室温、季节温度影响，不利于运输。本发明将磁珠用于生物保存液，譬如唾液和尿液的保存液中，不需要胍盐成分，就可以吸附DNA，有效地把保存液和核酸提取连接在一起，减少了样品损失，且避免了操作过程中交叉污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液的制备和运用。生物样品可以是，但不仅限于，唾液和尿液。在保存液中加入结合核酸的磁珠，磁珠是核酸提取的重要组分，有机地把核酸的保存和提取结合在一起。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为:

一种含有结合核酸的磁珠的保存液，包括如下组分和含量：Tris HCl为50 mmol/L，SDS0.5%（w/v）， EDTA 600 mmol /L，氯化钠500mmol/L，蛋白酶 K 250 μg/mL， 3 ×10⁸/mL结合DNA的磁珠，pH范围在8。

在本发明技术方案中，发明人创造性地使用特定量的SDS 0.5%和蛋白酶 K进行核酸提取。不仅可以充分裂解细胞，消化蛋白后使核酸充分释放，而且磁珠可以有效吸附核酸，使蛋白和其他杂质留在液相中实施有效地分离。

所述磁珠可以为微米磁珠或者纳米磁珠。磁珠和裂解液可以按照一定比例范围相混合。作为优选，磁珠的浓度3 ×10⁸/mL。

作为优选，所述结合核酸的磁珠的保存液，其方法为:将混合有磁珠的2毫升裂解液和蛋白酶 K干粉，将2ml生物样品，如唾液或者尿液，加入到保存管中，混匀，静置，即可运输或者保存。提取DNA 时，直接进行磁力架磁吸后除去上清即含各种杂质的混合液，将得到的磁珠用70%乙醇洗涤一次，即可用纯水或者TE洗脱而得到高纯度的核酸。

本发明的结合核酸的磁珠的保存液应用。所述生物样品，可以为唾液或者尿液,也可用于提取细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水中的核酸。

附图说明

DM: DNA Marker; 图1-2为唾液样本室温保存4周、13周后提取得到的DNA浓度和电泳条带。

图1为唾液样品在不同条件下保存四周后提取核酸的浓度。

图2为唾液样品在不同条件下保存13周后提取核酸的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1和泳道2为唾液样品在水中4度保存13周样品，泳道3和泳道4为唾液样品在保存液中4度保存13周样品；泳道6和泳道7为唾液样品在水中24度保存13周样品，泳道8和泳道9为唾液样品在保存液中24度保存13周样品；泳道10和泳道11为唾液样品在水中37度保存13周样品，泳道12和泳道13为唾液样品在保存液中37度保存13周样品，泳道5和泳道14为DNAMarker。

图3. 为唾液样品在不同条件下保存26周后提取核酸的浓度。

具体实施方式

本发明公开了一种含结合核酸的磁珠样品保存液，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1 唾液样本进行分装

取1人份唾液1.8mL和保存Buffer（Tris HCl为50 mmol/L，SDS 0.5%（w/v）， EDTA 600mmol /L，氯化钠500mmol/L， 3 ×10⁸/mL结合DNA的磁珠，pH范围在8），加入干粉蛋白酶 K至 250 μg/mL，于15mL离心管等体积混合，涡旋混匀，置冰上；分装成200μL/支于保存管中，标记好唾液样本名称、保存温度（4℃/室温/37℃）。

实施例2 4周的唾液样本进行DNA提取实验

将不同温度下的保存管置于磁力架上，磁吸作用下磁珠富集在保存管的侧部或者底部，一分钟后后除去上清，将得到的磁珠用70%乙醇洗涤一次，即可用80μL TB buffer洗脱。所提取DNA用紫外吸收法测定DNA浓度，,如表一所示。从表一的数据，可以看出本保存液有效的防止了DNA浓度的降低，如图1所示。

实施例313周的唾液样本进行DNA提取实验

将保存管置于磁力架上，磁吸作用下磁珠富集在保存管的侧部或者底部，一分钟后后除去上清，将得到的磁珠用70%乙醇洗涤一次，即可用80μL TB buffer洗脱。所提取DNA用紫外吸收法测定DNA浓度，并琼脂糖凝胶电泳,如图2所示。

实施例4 26周的唾液样本DNA进行Qubit测定定量

如实施例1所述，样本已保存26周，对含磁珠的样本进行唾液DNA的提取，用80μLTB洗脱。对提取的唾液DNA进行了紫外测定DNA浓度和荧光Qubit测定dsDNA浓度，如图3 所示的Qubit测定的双链DNA浓度，在不同温度下，保存液比水溶液含更高的核酸浓度。

Claims

1.一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液，可以用于运输唾液样品、尿液样品或者其他体液样品，无需冷链运输且可长期保存样品中的DNA。

2.如权利要求1，保存液中包括如下组分和含量：Tris HCl为10 – 200 mmol/L，SDS0.2 - 1%（w/v）， EDTA 300-800 mmol /L，氯化钠300 - 750mmol/L，蛋白酶 K 50 to 500μg/mL， 1-5×10⁸/mL结合DNA的磁珠，pH范围在7.5 - 10之间。

3.如权利要求1，保存液中包括如下组分和含量：Tris HCl为30 – 100 mmol/L，SDS0.3 – 0.8%（w/v）， EDTA 400-700 mmol /L，氯化钠400 - 600mmol/L，蛋白酶 K 100 to300 μg/mL， 2 - 4×10⁸/mL结合DNA的磁珠，pH范围在7.8 - 9之间。

4.如权利要求1，保存液中包括如下组分和含量：Tris HCl为50 mmol/L，SDS 0.5%（w/v）， EDTA 600 mmol /L，氯化钠500mmol/L，蛋白酶 K 250 μg/mL， 3 ×10⁸/mL结合DNA的磁珠，pH范围在8。

5.如权利要求2，保存液中的蛋白酶 K 为干粉状态，当生物样本和保存液混合时，加入混合液中。

6.如权利要求4，所述的保存液，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤： a.溶液：称取权利要求4所述的唾液保存液的各组分(不包括磁珠和蛋白酶K)，加入无菌水溶解并搅拌均匀；或将权利要求4所述的唾液保存液的各组分分别制备成储存液的形式备用，配制时分别量取相应各组分的体积，混合； b. 调节pH步骤：将a所得溶液的pH至8，并用无菌水定容； c. 将步骤b所得溶液通过微孔滤膜过滤除菌。

7.如权利要求2，保存液中结合DNA的磁珠，按照其尺寸划分，可以为微米级或者纳米级的磁珠，并且具备DNA结合能力。