ES2588227T3 - Composiciones, métodos y kits para aislar ácidos nucleicos de fluidos corporales usando medios de intercambio aniónico - Google Patents

Composiciones, métodos y kits para aislar ácidos nucleicos de fluidos corporales usando medios de intercambio aniónico Download PDF

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Hovsep Melkonyan
Samuil Umansky
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Abstract

Un método para aislar ácidos nucleicos de una muestra de orina que comprende: separación de la muestra de orina en una fracción exenta de células, que contiene ácidos nucleicos en el intervalo de 10 a 100 pares de bases, por eliminación de las células y los residuos insolubles mediante filtración o centrifugación; aplicación de la fracción exenta de células que contiene los ácidos nucleicos o sus complejos proteínicos a un material de intercambio aniónico que comprende grupos amonio cuaternarios, y quedando dichos ácidos nucleicos o sus complejos adsorbidos sobre dicho material; elución de los ácidos nucleicos unidos haciendo pasar por dicho material de intercambio aniónico una solución acuosa fuertemente salina que eluye los ácidos nucleicos diana o los complejos proteínicos de los mismos adsorbidos sobre el material de intercambio aniónico; y purificación mediante gel de sílice de los ácidos nucleicos eluidos con la solución fuertemente salina para proporcionar ácidos nucleicos exentos de células en el intervalo de 10 a 100 pares de bases.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones, metodos y kits para aislar acidos nucleicos de fluidos corporales usando medios de intercambio anionico
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere de manera general a la separacion rapida, aislamiento, y purificacion de acidos nucleicos exentos de celulas, ADN y/o ARN, de muestras biologicas. El metodo puede referirse especialmente a una purificacion simple y rapida de acidos nucleicos de fluidos corporales para diagnostico clmico, y seguimiento de enfermedades y tratamientos.
Antecedentes de la invencion
La biolog^a molecular moderna requiere el aislamiento de acidos nucleicos de una variedad de fuentes, que comprenden mezclas complejas de acidos nucleicos con otros compuestos tales como protemas, lfpidos y otros componentes celulares. Los ejemplos especialmente importantes de este tipo de mezclas incluyen nucleoprotemas solubles, que consisten en moleculas de acido nucleico de longitud variable, complejadas con protemas, por ejemplo, histonas. Estos complejos se pueden liberar en el torrente sangumeo como resultado de la apoptosis normal u otras formas de muerte celular. Se ha demostrado que pueden eventualmente cruzar la barrera renal (ADR/ARN tr) y se pueden detectar en la orina (Umansky, S.R., et al. 1982, Biochim. Biophys. Acta 655:9-17; Lichstenstein, A.V., et al. 2001, Ann NY Acad Sci, 945:239-249; Umansky, S & Tomei, D. 2O06 Expert Rev. Mol. Diagn. 6:153-163). Como son solubles, y se liberan de las celulas por todo el cuerpo, pueden ser utiles como indicadores para la deteccion y seguimiento de enfermedades y estados anomalos que pueden estar presentes en zonas del cuerpo diferentes al punto de obtencion del fluido (Al-Yatama et al. 2001, Prenat Diagn, 21:399-402, Utting, M., et al. (2002), Clin Cancer Res, 8:35-40). La mayona de tecnologfas actuales existentes se pueden disenar para el aislamiento de ADN y ARN celular de alto peso molecular. Estos metodos requieren varias etapas. En primer lugar, las celulas se deben lisar. En segundo lugar, se debe inhibir la actividad nucleasa para evitar la degradacion de los acidos nucleicos liberados. En tercer lugar, los acidos nucleicos deberan separarse de las protemas. Esta etapa de desproteinizacion puede incluir la extraccion con una variedad de disolventes organicos, incluidos fenol y/o cloroformo, ido de precipitacion con etanol, (Maniatis et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Otro metodo para la extraccion de acidos nucleicos puede estar basado en su adsorcion en gel de sflice a partir de soluciones muy concentradas de agentes caotropicos con posterior elucion a fuerza ionica baja. Estos metodos convencionales tienen las desventajas de requerir tiempo y ser laboriosos, y tambien pueden implicar el uso de reactivos qmmicos que son peligrosos y/o toxicos para el trabajador y/o el medio ambiente.
Es posible que la purificacion del ADN y/o ARN de complejos de nucleoprotemas exentas de celulas no requiera la etapa de lisis celular. Sin embargo, existe amplia evidencia que demuestra que los acidos nucleicos en circulacion libres en los fluidos corporales pueden estar presentes a concentraciones muy bajas y estan fragmentados a un tamano promedio de 150-300 pb, lo que introduce requisitos adicionales en un procedimiento de purificacion. En primer lugar, para un volumen de muestra grande, puede ser tecnicamente diffcii realizar la desproteinizacion con fenol, la automatizacion del proceso es casi imposible, y el uso del fenol, extremadamente toxico, en un escenario de laboratorio clmico no resulta practico. Los metodos basados en gel de sflice pueden ser mucho mas adecuados para el aislamiento de los acidos nucleicos de soluciones diluidas. Sin embargo, en primer lugar, puede ser necesaria una dilucion adicional significativa de la solucion original de acido nucleico para conseguir una concentracion suficiente de un agente caotropico, y el aislamiento de ADN de volumenes grandes supone un problema. En segundo lugar, la union de fragmentos cortos de acido nucleico monocatenario (menos de 200 pb) al gel de sflice no es muy eficaz, y se pueden perder durante la purificacion.
Se han utilizado medios de intercambio anionico para el fraccionamiento y aislamiento de acidos nucleicos, aunque la muestra biologica que los contiene normalmente se procesan en primer lugar para liberar los acidos nucleicos de otros componentes celulares (Yamakawa et al., Analytical Biochemistry, 24:242-250 (1996)).
El documento EP 0270017 describe un metodo para aislar y purificar acidos nucleicos a partir de una muestra biologica. El documento US 6492144 describe metodos para detectar secuencias de acidos nucleicos en orina. El documento WO 00/70041 describe una fase solida de lecho mixto y su uso en el aislamiento de acidos nucleicos. El documento US 5990301 describe un proceso para separar y purificar acidos nucleicos de fuentes biologicas. El documento US 6872527 describe un proceso para unir fuertemente acido nucleico a una fase solida, y los correspondientes procesos. El documento EP 0268946 describe un metodo para separar acidos nucleicos de cadena larga. El documento WO 2005/026331 describe un metodo de preparacion de ADN plasmido de calidad farmaceutica. El documento WO 93/11221 describe un proceso para aislar y purificar acidos nucleicos. El documento US 2001/047966 describe un proceso y un dispositivo para aislar componentes celulares tales como acidos nucleicos procedentes de fuentes naturales. El documento EP 1245674 describe un proceso para purificar ADN plasmido a partir de una muestra que contiene acido nucleico que comprende ADN plasmido y contaminantes. El documento WO 96/36706 describe un metodo para la purificacion de plasmidos a gran escala. El documento EP
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0507591 describe la separacion mediante intercambio anionico de acidos nucleicos. El documento EP 1394269 describe un metodo para aislar macromoleculas biologicas y un equipo para llevar a cabo dicho metodo. El documento WO 99/29832 describe un metodo para purificar ADN y ADN plasmido practicamente exento de ADN genomico.
Existe una necesidad no satisfecha en la tecnica de un metodo novedoso para aislar y conservar acidos nucleicos exentos de celulas procedentes de fluidos corporales donde dicho metodo evite procedimientos multiples para liberar los acidos nucleicos del material celular, que proporcione secuencias de acidos nucleicos de diferentes longitudes, conserve la integridad de los acidos nucleicos y se pueda adaptar con facilidad al analisis de alto rendimiento de muestras para analisis diagnostico.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere en parte a un metodo novedosos para la separacion rapida, aislamiento, y purificacion de ADN o ARN de bajo peso molecular exento de celulas procedente de muestras biologicas. El presente metodo es especialmente ventajoso para resolver ADN o ARN de bajo peso molecular exento de celulas (<40 pares de bases e incluso hasta 10 pares de bases) encontrados en muestras de orina o de plasma sangumeo.
En algunas realizaciones, la invencion se refiere al metodo de aislar sustancialmente acidos nucleicos de una muestra de orina o plasma sangumeo, que comprende:
a) seleccionar un material de intercambio anionico que comprende grupos amonio cuaternarios que adsorben eficazmente dichos acidos nucleicos diana o complejos de los mismos con protemas.
Los metodos de la presente invencion pueden utilizar, por tanto, materiales de intercambio anionico fuerte comercialmente disponibles. Los intercambiadores anionicos de base fuerte tienen grupos de amonio cuaternario (es decir, no protonables y siempre cargados positivamente) como sitios de intercambio, y se pueden seleccionar con respecto a sus fuerzas ionicas de absorcion y elucion relativas y/o el pH del ADN o aRn a separar. La purificacion mediante cromatograffa de intercambio anionico se describe en el documento EP 0 268 946 B1.
El material que esta comercialmente disponible bajo la designacion Q-Sepharose™ (GE Healthcare) es especialmente adecuado para los metodos de la presente invencion.
Q-Sepharose™, puede ser un intercambiador de aniones fuerte basado en una perla fuertemente reticulada formada por una matriz de agarosa al 6 %, con un tamano de partmulas promedio de 90 pm. La Q-Sepharose™ puede ser estable en todos los tampones acuosos habitualmente utilizados, con un pH recomendado de 2-12 y un caudal de trabajo recomendado de 300-500 cm/h. En otras realizaciones preferidas, el medio de intercambio anionico se puede seleccionar entre medios de intercambio anionico de amonio cuaternario basados en sefarosa, tales como los filtros Q o las resinas Q.
El material de soporte cromatografico para la carga de aniones utilizada en los presentes metodos puede ser un material inorganico poroso modificado. Como materiales de soporte inorganicos, se pueden utilizar materiales tales como gel de sflice, tierra de diatomeas, vidrio, oxidos de aluminio, oxidos de titanio, oxidos de circonio, hidroxiapatito, y, como materiales de soporte organico, tales como dextrano, agarosa, amida acnlica, resinas de poliestireno, o copolfmeros de los bloques de construccion monomericos de los polfmeros mencionados.
Los acidos nucleicos tambien se pueden purificar con materiales de intercambio anionico basados en poliestireno/DVB, tales como Poros 20 para cromatograffa de media presion, Poros.RTM. 50 HQ, de la marca BioPerseptive, Cambridge, EE.UU., o con DEAE sepharose.RTM., Q sepharose.RTM., DEAE Sephadex.RTM. de la marca Pharmacia, Suecia; DEAE Spherodex.RTM. Ls, DEAE Spherosil.RTM., de la marca Biosepra, Francia.
b) aplicando una fraccion exenta de celulas obtenida a partir de orina o plasma sangumeo por eliminacion de las celulas y residuos insolubles que contienen acidos nucleicos en el intervalo de 10 a 100 pares de base al material de intercambio anionico seleccionado, y quedando dichos acidos nucleicos o sus complejos adsorbidos sobre dicho material de columna.
El contacto y la posterior adsorcion sobre la resina puede tener lugar por simple mezclado del medio de intercambio anionico con el fluido corporal, con la adicion opcional de un disolvente, tampon u otro diluyente, en un recipiente adecuado para la muestra tal como un tubo de vidrio o plastico, o recipiente habitualmente utilizado para manipular muestras biologicas. Este mezclado simple denominado procesamiento en lotes, se puede dejar actuar durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la union de la nucleoprotema al medio, preferentemente de 10 a 40 min. El medio/complejo se puede separar a continuacion del resto de la muestra/lfquido por decantacion, centrifugacion, filtracion y otro medio mecanico.
c) opcionalmente, por lavado de dicho material de intercambio anionico con una solucion acuosa de una sal a la que los acidos nucleicos quedan unidos en dicho material de intercambio anionico, teniendo dicho lavado suficiente volumen y fuerza ionica para lavar los componentes no unidos o unidos debilmente a traves de dicho
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material de intercambio anionico. En algunas realizaciones, la resina se puede lavar con 2xSSC (NaCI 300 mM/citrato de sodio 30 mM (pH 7,0)). Los intervalos preferidos de las soluciones salinas son NaCl 300- 600/citrato de sodio 30 mM (pH 7,0). En otras realizaciones preferidas, la resina se puede lavar con LiCl 300 mM/NaOAc 10 mM (pH 5,2). Los intervalos preferidos de las soluciones salinas son LiCl 300-600/NaOAc 10 mM (pH 5,2)
d) eluyendo los acidos nucleicos unidos haciendo pasar por dicho material de intercambio anionico una solucion acuosa de fuerza ionica creciente para eliminar sucesivamente las protemas que no estan unidas o estan debilmente unidas al material de intercambio anionico y dichos acidos nucleicos de peso molecular creciente de la columna. En algunas realizaciones preferidas, ambas protemas y los acidos nucleicos de peso molecular alto y bajo (incluso de 10 pares de bases) se pueden eluir selectivamente de la resina por pasos con la solucion salina de concentraciones de NaCl entre 300 mM y 2,0 M y finalmente con isotiocianato de guanidina 2,0 M. En otras realizaciones preferidas, en la elucion por pasos se utilizan soluciones de LiCl en el intervalo de concentraciones de 300 mM a 2,0 M de LiCl.
e) analizar la fraccion eluida de acido nucleico.
Los acidos nucleicos eluidos segun los metodos de la presente invencion estan comprendidos en un intervalo de tamanos de 10-100 pares de bases, y lo mas preferentemente en un intervalo de tamanos inferior a 40 partes de bases. El intervalo de tamano mas pequeno del fragmento eluido segun los metodos de la presente invencion estan tiene 10 pares de bases. Los cebadores para amplificar los acidos nucleicos se obtienen preferentemente de los genes que se deben analizar, es decir, de los oncogenes, genes supresores de tumor y/o microsatelites, por ejemplo, o pueden ser adecuados para amplificar secuencias de acido nucleico vmco o bacteriano. Las enzimas y endonucleasas de restriccion adecuadas para amplificar acidos nucleicos son conocidos y estan comercialmente disponibles.
En algunas realizaciones, los acidos nucleicos aislados segun los metodos de la presente invencion pueden estar en forma monocatenaria o bicatenaria.
En algunas realizaciones diferentes, el fluido corporal que contiene el acido nucleico exento de celulas es plasma sangumeo.
En algunas realizaciones, el fluido corporal es orina y se puede prefiltrar a traves de una membrana y complementarse con EDTA 10 mM (pH 8,0) y Tris- HCl 10 mM (pH 8,0) antes de su adsorcion sobre el medio de intercambio anionico. Las fuentes comerciales de dispositivos de filtracion incluyen Pall-Filtron (Northborough, Mass.), Millipore (Bedford, Mass.), y Amicon (Danvers, Mass.). Los siguientes dispositivos de filtracion se pueden utilizar con los metodos de la presente invencion tales como un dispositivo de placa plana, cartucho enrollado en espiral, fibra hueca, dispositivo tubular o de una sola hoja, dispositivo de canal abierto, etc.
El area superficial de la membrana de filtracion utilizada puede depender de la cantidad de acido nucleico a purificar. La membrana puede ser un material de baja union para minimizar las perdidas adsortivas y es preferentemente duradero, limpiable, y qmmicamente compatible con los tampones a utilizar. Numerosas membranas adecuadas estan comercialmente disponibles, incluyendo, por ejemplo, acetato de celulosa, polisulfona, polietersulfona, y poli(difluoruro de polivilideno). Preferentemente, el material de la membrana es polietersulfona o polietersulfona.
En otras realizaciones, el fluido corporal es plasma sangumeo y puede estar suplementado con EDTA y tampon Tris- HCl (pH 8,0) y digerido con Proteinasa K antes su adsorcion sobre el medio de intercambio anionico.
En otras realizaciones adicionales, el medio de intercambio anionico se puede inmovilizar sobre un portador individualizado donde dicho portador es una columna, cartucho o sistema de filtracion portatil que se puede utilizar para el transporte o el almacenamiento del complejo unido al medio/nucleoprotema. En algunas realizaciones, el intercambio acido nucleico/anion se mantiene en almacenamiento durante 3 semanas.
Se divulga en el presente documento un kit con un portador solido capaz de adsorber los acidos nucleicos contenidos en una muestra de orina o de plasma sangumeo. El kit puede tambien contener componentes necesarios para realizar el proceso de acuerdo con la invencion. Estos incluyen, en particular, reactivos, tambien en forma concentrada para el mezclado final por el usuario, materiales cromatograficos para la separacion de los acidos nucleicos, soluciones acuosas (tampones, opcionalmente tambien en forma concentrada para ajuste final por el usuario) o materiales cromatograficos para desalar acidos nucleicos que se han eluido con cloruro de sodio.
Preferentemente, el kit de reactivo contiene medios adicionales para purificar acidos nucleicos que comprenden, por ejemplo, portadores organicos y/o inorganicos y soluciones, excipientes y/o accesorios opcionales. Dichos agentes son conocidos de la tecnica anterior (por ejemplo, el documento WO 95/01359) y estan comercialmente disponibles. Los componentes inorganicos de los portadores pueden ser, por ejemplo, oxidos metalicos porosos o no porosos o mezcla de oxidos metalicos, por ejemplo, oxido de aluminio, dioxido de titanio, oxido de hierro u oxido de circonio, geles de sflice, materiales de tipo vidrio, por ejemplo, partmulas de vidrio o vidrio molido modificado o sin modificar, cuarzo, zeolita o mezclas de uno o mas de las sustancias anteriormente mencionadas. Por otra parte, el portador puede incluir tambien ingredientes organicos que se pueden seleccionar, por ejemplo, a partir de partmulas de latex
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opcionalmente modificadas con grupos funcionales, poKmeros sinteticos tales como polietileno, polipropileno, poli(fluoruro de vinilideno), especialmente polietileno o HD-polietileno de peso molecular ultra elevado, o mezclas de una o mas de las sustancias anteriormente mencionadas.
Ademas, el kit reactivo puede tambien incluir excipientes tales como, por ejemplo, una proteasa tal como la proteinasa K, o enzimas y otros agentes para manipular acidos nucleicos, por ejemplo, al menos un cebador de amplificacion, y enzimas adecuadas para amplificar los acidos nucleicos, por ejemplo, un acido nucleico polimerasa y/o al menos una endonucleasa de restriccion.
Los cebadores para amplificar los acidos nucleicos se obtienen preferentemente de los genes que se deben analizar, es decir, de los oncogenes, genes supresores de tumor y/o microsatelites, por ejemplo, o pueden ser adecuados para amplificar secuencias de acido nucleico vffico o bacteriano. Las enzimas y endonucleasas de restriccion adecuadas para amplificar acidos nucleicos son conocidos y estan comercialmente disponibles.
Otras caracteffsticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion y reivindicaciones detalladas.
Descripcion de las figuras
La Figura 1 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida que demuestra la separacion y caracterizacion de ADN y ARN aislado de orina mediante cromatograffa de intercambio ionico en Q-Sepharose™.
La Figura 2 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida que muestra acidos nucleicos aislados de orina usando adsorbentes de membrana Q.
La Figura 3 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida que muestra la purificacion de acidos nucleicos con Q- Sepharose usando orina completa o filtrada.
Las Figuras 4A y 4B son fotograffas de una ilustracion grafica de un perfil de elucion de ADN desde una resina de intercambio anionico. Se sometieron a ensayo los siguientes medios de intercambio anionico: DEAE, Q, XL, y ANX.
La Figura 5 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida que muestra el perfil de elucion de acido nucleico y protema de Q-Sepharose™.
La Figura 6 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida que muestra la estabilidad de acidos nucleicos adsorbidos sobre resina Q.
Las Figuras 7 es una fotograffa de una ilustracion grafica de la estabilidad del ADN aislado adsorbido en la resina.
La Figura 8 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida que compara diferentes tasas de carga, tales como en lotes, columna y vado, en el aislamiento de acidos nucleicos desde orina.
La Figura 9 es un diagrama de flujo que resume el procedimiento general de purificacion y concentracion.
La Figura 10 es un diagrama de flujo que resume el procedimiento general de purificacion y concentracion usando un cartucho que posteriormente se utiliza para almacenamiento, estabilizacion y transporte de la muestra.
La Figura 11 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida que muestra acidos nucleicos totales, de alto peso molecular y de bajo peso molecular, fraccionados en una microcolumna de gel de sflice.
La Figura 12 es un grafico de PCR en tiempo real que muestra la presencia de microARN 16 (mir-16) en acidos nucleicos eluidos en TRYzol procedentes del plasma sangumeo.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se basa en parte en el descubrimiento de que los acidos nucleicos exentos de celulas se pueden detectar en los fluidos corporales de un sujeto. Esta invencion proporciona metodos para aislamiento, estabilizacion y purificacion de los acidos nucleicos exentos de celulas. Existen varias ventajas importantes del metodo propuesto. En primer lugar, se puede logar la concentracion y purificacion parcial de los acidos nucleicos exentos de celulas de una forma simultanea. Esto es especialmente ventajoso cuando el volumen de muestra de fluido corporal es grande, pero la concentracion de acido nucleico en la muestra es baja. En segundo lugar, el comportamiento de absorcion no depende del peso molecular de los acidos nucleicos, permitiendo el aislamiento de fragmentos cortos de peso molecular bajo (<40 pares de base e incluso de 10 pares de bases) presentes en las nucleoprotemas exentas de celulas. Ademas, el medio de intercambio anionico, es decir, resinas o filtros, que contienen material de acido nucleico exento de celulas se puede utilizar para transportar y almacenar las muestras. La adsorcion en medios de intercambio anionico separan sustancialmente los acidos nucleicos de las nucleasas normalmente presentes en los fluidos corporales. Una vez adsorbidos, los acidos nucleicos pueden estar estables durante al menos 10 dfas a temperatura ambiente.
Los metodos de la presente invencion son adecuados para detectar un acido nucleico exento de celulas de interes, incluyendo fragmentos de bajo peso molecular, en un fluido corporal, tal como sangre, fluido amniotico, fluido cefalorraqrndeo, plasma, leche materna, semen, fluido linfatico, suero, esputo, licor, saliva y orina.
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La invencion se refiere al metodo de aislar sustancialmente acidos nucleicos exentos de celulas de una muestra de orina o plasma sangumeo, que comprende la etapa de seleccionar un material de intercambio anionico que comprende grupos amonio cuaternarios que adsorben eficazmente dichos acidos nucleicos diana o complejos de los mismos con protemas.
Los metodos de la presente invencion pueden utilizar, por tanto, materiales de intercambio anionico fuerte comercialmente disponibles. Los intercambiadores anionicos de base fuerte tienen grupos de amonio cuaternario (es decir, no protonables y siempre cargados positivamente) como sitios de intercambio, y se pueden seleccionar con respecto a sus fuerzas ionicas de absorcion y elucion relativas y/o el pH del ADN o ARN a separar.
El material que esta comercialmente disponible bajo la designacion Q-Sepharose™ (GE Healthcare) es especialmente adecuado para los metodos de la presente invencion.
Q-Sepharose™, puede ser un intercambiador de aniones fuerte basado en una perla fuertemente reticulada formada por una matriz de agarosa al 6 %, con un tamano de partmulas promedio de 90 pm. La Q-Sepharose™ puede ser estable en todos los tampones acuosos habitualmente utilizados, con un pH recomendado de 2-12 y un caudal de trabajo recomendado de 300-500 cm/h. En otra realizacion preferida, el medio de intercambio anionico se puede seleccionar entre medios de intercambio anionico de amonio cuaternario basados en sefarosa, tales como los filtros Q o las resinas Q.
Los acidos nucleicos tambien se pueden purificar con materiales de intercambio anionico basados en poliestireno/DVB, tales como Poros 20 para cromatograffa de media presion, Poros.RTM. 50 HQ, de la marca BioPerseptive, Cambridge, EE.UU., o con DEAE sepharose.RTM., Q sepharose.RTM., DEAE Sephadex.RTM. de la marca Pharmacia, Suecia; DEAE Spherodex.RTM. LS, DEAE Spherosil.RTM., de la marca Biosepra, Francia. Otros ejemplos de resinas de tipo sefarosa, funcionalizadas con grupos amonio cationicos que se pueden utilizar incluyen Sepharose™ Fast Flow, DEAE-Sepharose™ Q-Sepharose-XL™ DEAE Sepharose Fast Flow (GE Healthcare).
El presente metodo incluye aplicar una fraccion exenta de celulas obtenida a partir de orina o plasma sangumeo que contiene acidos nucleicos en el intervalo de 10 a 100 pares de bases al material de intercambio anionico seleccionado, y quedando dichos acidos nucleicos o sus complejos adsorbidos sobre dicho material de columna.
El contacto y la posterior adsorcion sobre la resina pueden tener lugar por simple mezclado del medio de intercambio anionico con el fluido corporal, con la adicion opcional de un disolvente, tampon u otro diluyente, en un recipiente adecuado para la muestra tal como un tubo de vidrio o plastico, o recipiente habitualmente utilizado para manipular muestras biologicas. Este mezclado simple denominado procesamiento en lotes, se puede dejar actuar durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la union de la nucleoprotema al medio, preferentemente de 10 a 40 min. El medio/complejo se puede separar a continuacion del resto de la muestra/lfquido por decantacion, centrifugacion, filtracion y otro medio mecanico.
Los metodos de la presente invencion tambien incluyen opcionalmente, por lavado de dicho material de intercambio anionico con una solucion acuosa de una sal a la que los acidos nucleicos quedan unidos en dicho material de intercambio anionico, teniendo dicho lavado suficiente volumen y fuerza ionica para lavar los componentes no unidos o unidos debilmente a traves de dicho material de intercambio anionico. En algunas realizaciones, la resina se puede lavar con 2xSSC (NaCl 300 mM/citrato de sodio 30 mM (pH 7,0)). Los intervalos preferidos de las soluciones salinas son NaCl 300-600/citrato de sodio 30 mM (pH 7,0). En otras realizaciones preferidas, la resina se puede lavar con LiCl 300 mM/NaOAc 10 mM (pH 5,2). Los intervalos preferidos de las soluciones salinas son LiCl 300-600/NaOAc 10 mM (pH 5,2).
La elucion de los acidos nucleicos unidos haciendo pasar por dicho material de intercambio anionico una solucion acuosa de fuerza ionica creciente para eliminar sucesivamente las protemas que no estan unidas o estan debilmente unidas al material de intercambio anionico y dichos acidos nucleicos de peso molecular creciente de la columna. Mediante el uso de una solucion de fuerza ionica conocida para la union inicial de los acidos nucleicos a la resina de intercambio anionico, la mayona de los componentes solubles en agua, incluyendo otras moleculas electronegativas tales como protemas (contaminantes unidos debilmente) se puede eliminar por lavado de la columna. Para la elucion, la fuerza ionica necesaria se puede conseguir usando concentraciones conocidas de una sal tal como NaCl, que se puede mezclar con un tampon para controlar el pH, correspondiendo idealmente a la fuerza ionica mas baja a la que los acidos nucleicos se pueden eluir por completo. Las sustancias contaminantes unidas a la resina de intercambio anionico con mayor rigurosidad que los acidos nucleicos pueden quedar, de esta forma, unidas a la resina, es decir, los contaminantes unidos con mas fuerza se pueden separar de los acidos nucleicos.
En algunas realizaciones preferidas, ambas protemas y los acidos nucleicos de peso molecular alto y bajo (incluso de 10 pares de bases) se pueden eluir selectivamente de la resina por pasos con la solucion salina de concentraciones de NaCl entre 300 mM y 2,0 M y finalmente con isotiocianato de guanidina 2,0 M. En otras realizaciones preferidas, las soluciones de LiCl se utilizan para la elucion por etapas.
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Los metodos de la presente invencion tambien implican analizar la fraccion de acido nucleico eluida. El acido nucleico eluido esta comprendido en un intervalo de tamanos de 10-100 pares de bases, y lo mas preferentemente en un intervalo de tamanos inferior a 40 partes de bases. El intervalo de tamano mas pequeno del fragmento eluido segun los metodos de la presente invencion estan tiene 10 pares de bases. Los cebadores para amplificar los acidos nucleicos se obtienen preferentemente de los genes que se deben analizar, es decir, de los oncogenes, genes supresores de tumor y/o microsatelites, por ejemplo, o pueden ser adecuados para amplificar secuencias de acido nucleico vmco o bacteriano. Las enzimas y endonucleasas de restriccion adecuadas para amplificar acidos nucleicos son conocidos y estan comercialmente disponibles.
En algunas realizaciones, los acidos nucleicos aislados segun los metodos de la presente invencion pueden estar en forma monocatenaria o bicatenaria.
En algunas realizaciones diferentes, el fluido corporal que contiene el acido nucleico exento de celulas es plasma sangumeo.
En algunas realizaciones, el fluido corporal es orina y se puede prefiltrar a traves de una membrana y complementarse con EDTA 10 mM (pH 8,0) y Tris- HCl l0 mM (pH 8,0) antes de su adsorcion sobre el medio de intercambio anionico. La etapa de filtracion elimina los posibles residuos insolubles que pueden estar presentes. Dichos residuos o material insoluble, por ejemplo, pueden aparecer si la muestra biologica se ha almacenado (archivado) en estado congelado durante un periodo de tiempo prolongado. Las fuentes comerciales de dispositivos de filtracion incluyen Pall-Filtron (Northborough, Mass.), Millipore (Bedford, Mass.), y Amicon (Danvers, Mass.). Los siguientes dispositivos de filtracion se pueden utilizar con los metodos de la presente invencion tales como un dispositivo de placa plana, cartucho enrollado en espiral, fibra hueca, dispositivo tubular o de una sola hoja, dispositivo de canal abierto, etc.
El area superficial de la membrana de filtracion utilizada dependera de la cantidad de acido nucleico a purificar. La membrana puede ser un material de baja union para minimizar las perdidas adsortivas y es preferentemente duradero, limpiable, y qmmicamente compatible con los tampones a utilizar. Numerosas membranas adecuadas estan comercialmente disponibles, incluyendo, por ejemplo, acetato de celulosa, polisulfona, polietersulfona, y poli(difluoruro de polivilideno). Preferentemente, el material de la membrana es polietersulfona o polietersulfona.
En otras realizaciones, el fluido corporal es plasma sangumeo y puede estar suplementado con EDTA y tampon Tris- HCl (pH 8,0) y digerido con Proteinasa K antes su adsorcion sobre el medio de intercambio anionico.
En otras realizaciones adicionales, el medio de intercambio anionico se puede inmovilizar sobre un portador individualizado donde dicho portador es una columna, cartucho o sistema de filtracion portatil que se puede utilizar para el transporte o el almacenamiento del complejo unido al medio/nucleoprotema. En algunas realizaciones, el intercambio acido nucleico/anion se mantiene en almacenamiento durante 3 semanas.
El complejo de nucleoprotema/intercambio anionico, ya este preparado de forma discontinua o en una forma inmovilizada, se puede tratar con un eluyente para eliminar por lavado el posible material remanente no unido, tales como protemas con menos carga neta negativa y sales inorganicas. Tambien se puede utilizar como medio para almacenar la nucleoprotema/acidos nucleicos. El complejo tambien se puede tratar opcionalmente con un disolvente miscible con agua para secar la resina, que se puede almacenar a continuacion durante periodos de tiempo prolongados hasta desorcion y analisis final.
El complejo de acido nucleico/intercambio anionico tambien puede servir como recipiente de almacenamiento de la muestra. Por ejemplo, el fluido corporal obtenido de un paciente se puede enviar al laboratorio para su analisis normalmente congelado para evitar la degradacion, pero la muestra tambien se puede aplicar al medio inmovilizado de intercambio anionico en o cerca del sitio donde se ha realizado la toma de muestra. El complejo de nucleoprotema/intercambio anionico, por ejemplo, el cartucho, tubo o columna que contiene la muestra de nucleoprotema se puede preparar en el sitio de extraccion y enviarse directamente al laboratorio para su analisis.
Para la deteccion de un acido nucleico de interes, se puede utilizar una etapa de amplificacion de ADN o ARN (tal como PCR o RT-PCR). En una realizacion, la reaccion comprende la amplificacion con seguimiento en tiempo real. En otra realizacion, la deteccion y/o cuantificacion del acido nucleico se realiza con un sistema de lectura de punto final. Dichos sistemas pueden incluir una deteccion colorimetrica, un ensayo enzimatico, y/o una tira reactiva.
Se divulga en el presente documento un kit de piezas para detectar, identificar y/o cuantificar un acido nucleico de interes en una muestra, que comprende: un portador solido capaz de absorber al menos en parte los complejos de nucleoprotema exentos de celulas de una muestra; y un conjunto de soluciones para el posterior lavado de la resina y elucion del acido nucleico. En alguna realizacion, el kit puede incluir el propio portador que puede absorber el fluido corporal, unido a un trozo de papel o superficie sobre la que se puede escribir o imprimir informacion, por ejemplo, informacion acerca del paciente, la fecha de la toma de muestra, o fechas adicionales de toma de muestra, regimen de tratamiento, codigos de barras, numeros de ID, etc. Dicha superficie para este tipo de informacion esta ineqmvocamente vinculada al portador con una muestra, haciendo de esta forma que la trazabilidad de la muestra
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sea mas comoda y fiable. Normalmente, este tipo de superficie puede incluir mas informacion de la que puede contener un tubo. En otra realizacion, el portador puede ser una resina Q que contiene un cartucho con un conector luer convencional. Una muestra de fluido corporal se puede pasar por el cartucho y posteriormente, tras lavado con NaCl, el cartucho se puede enviar a un laboratorio clmico donde los acidos nucleicos se eluiran y analizaran.
En alguna realizacion, el kit comprende ademas medios para amplificacion del acido nucleico. Este medio puede comprender componentes para una amplificacion con seguimiento en tiempo real, y/o componentes para amplificacion con deteccion/cuantificacion de punto final. Un kit de piezas puede ser de utilidad en pafses de pocos recursos con pocos hospitales. Dichos hospitales pueden distribuir los portadores solidos, tales como papeles de filtro, entre los habitantes de zonas remotas. Tras la recogida de las muestras, se pueden almacenar a temperatura ambiente y transportarse a los hospitales. Si el hospital tiene el equipo adecuado, las muestras se pueden investigar usando el kit suplementado con las soluciones de aislamiento de acidos nucleicos y los componentes para el analisis. Por supuesto, tambien los hospitales de pafses desarrollados pueden utilizar un kit de piezas para recoger y someter a ensayo una muestra.
Un kit de piezas para la deteccion, identificacion y/o cuantificacion puede incluir una recogida de materiales necesarios para extraer con seguridad el fluido corporal del paciente. Con fluidos corporales externos, por ejemplo, orina, leche materna o saliva, deben tomarse las precauciones de seguridad adecuadas, asf como cuando los fluidos corporales son muestras tales como sangre, plasma, suero, o fluido linfatico. Para los fluidos corporales internos, se puede componer un kit que contenga un portador solido capaz de absorber al menos en parte la muestra, y una solucion de aislamiento de acido nucleico, junto a un par de guantes de exploracion, un hisopo en alcohol para limpiar la piel, un dispositivo punzante para el dedo o talon[Lambda], una venda, un sobre, por ejemplo, con la direccion del laboratorio de destino, asf como un espacio para un numero de identificacion o codigo de paciente, e interior acolchado para un trasporte postal seguro, y un desecador para mantener la muestra seca y evitar el crecimiento de hongos o bacterias. Otras posibilidades para el dispositivo de recogida pueden comprender dispositivos especialmente disenados de un solo uso, tal como el dispositivo descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5.139.742: Disposable liquid testing device de Livestock Control Holding B.v. en Amersfoort, Pafses Bajos. Cualquier combinacion de estos elementos, o la sustitucion por otro tipo de elementos/dispositivos a utilizar para el almacenamiento y/o transporte de cualquier fluido corporal que contenga acido nucleico es posible.
En la realizacion preferida, el kit puede estar basado en la adsorcion directa de acido nucleico/nucleoprotemas de la orina sobre un intercambiador anionico, preferentemente Q-Sepharose®, seguido de elucion, que puede incluir etapa(s) de fraccionamiento del ADN/ARN.
Para facilitar la comprension de la invencion, se definen a continuacion varios terminos:
El termino acido nucleico "diana" es una secuencia de acido nucleico que se va a evaluar mediante hibridacion, amplificacion o cualquier otro medio para analizar una secuencia de acido nucleico, incluyendo una combinacion de metodos de analisis.
El termino "sonda", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleotido (es decir, una secuencia de nucleotidos), tanto de origen natural como producida sinteticamente, que forma una estructura de duplete u otro tipo de complejo con una secuencia de otro acido nucleico, debido a la complementariedad u otros medios de interaccion atractiva reproducible, de al menos una secuencia de la sonda con una secuencia del otro acido nucleico. Las sondas son utiles en la deteccion, identificacion y aislamiento de secuencias genicas concretas. Se contempla que cualquier sonda utilizada en la presente invencion se pueda marcar con cualquier "molecula indicadora", de tal forma que se pueda detectar en cualquier sistema de deteccion, incluyendo, pero sin limitacion, enzimas (por ejemplo, ELlSA, asf como un analisis histoqmmico de tipo enzimatico), y sistemas fluorescentes, radioactivos y luminiscentes. Se contempla ademas que el oligonucleotido de interes (es decir, a detectar) se marque con una molecula indicadora. Se contempla tambien que tanto la sonda como el oligonucleotido de interes esten marcados. No se pretende que la presente invencion este limitada a cualquier sistema de deteccion o etiqueta concretos.
El termino "etiqueta" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier atomo o molecula que se pueda utilizar para proporcionar una senal detectable (preferentemente cuantificable), y que se puede unir a un acido nucleico o protema. Las etiquetas proporcionan senales que se pueden detectar por numerosos metodos, incluyendo, pero sin limitacion, fluorescencia, radioactividad, colorimetna, gravimetna, difraccion o absorcion de rayos X, magnetismo, y actividad enzimatica.
La expresion "practicamente monocatenario", cuando se utiliza en referencia a un acido nucleico diana, significa que la molecula diana existe principalmente como una cadena simple de acido nucleico a diferencia de una diana bicatenaria que existe en forma de dos hebras de acido nucleico que se mantienen juntas entre sf por interacciones de emparejamiento de bases entre las cadenas.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos "practicamente purificado" y " practicamente aislado" se refieren a secuencias de acidos nucleicos que se han separado de su entorno natural, aisladas o separadas, y estan
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preferentemente exentas en un 60 %, mas preferentemente, exentas en un 75 %, y lo mas preferentemente exentas en un 90 % de otros componentes a los que pueden estar naturalmente asociados. Un "polinudeotido aislado" es, por tanto, un polinudeotido practicamente purificado. Se contempla que, para llevar a la practica los metodos de la presente invencion, los polinucleotidos pueden estar purificados, aunque no necesitan estar practicamente purificados. Se conocen en la tecnica diferentes metodos para detectar secuencias de acidos nucleicos en forma no purificada.
"Amplificacion" se define como la produccion de copias adicionales de una secuencia de acido nucleico, y por lo general se lleva a cabo usando la reaccion en cadena de la polimerasa u otras tecnologfas bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. [1995]). Tal como se usa en el presente documento, la expresion "reaccion en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere al metodo de K. B. Mullis (patentes de Estados Unidos numeros 4.683.195 y 4.683.202), que describe un metodo para aumentar la concentracion de un segmento de una secuencia de acido nucleico diana en una mezcla de ADN genomico sin clonacion o purificacion. Este proceso para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un importante exceso de dos cebadores de oligonucleotidos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido por una secuencia precisa de ciclacion termica en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios de sus respectivas hebras de la secuencia diana bicatenaria. Para realizar la amplificacion, la mezcla se desnaturaliza, y los cebadores se hibridan a continuacion con sus secuencias complementarias dentro de la molecula diana. Tras la hibridacion, los cebadores se extienden con una polimerasa de tal manera que se forma una nueva pareja de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalizacion, hibridacion de cebadores y extension con polimerasa se puede repetir varias veces (es decir, la desnaturalizacion, la hibridacion y la extension constituyen un "ciclo"; asf pueden realizarse varios "ciclos") para obtener una concentracion elevada de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del fragmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores entre sf y, por tanto, esta longitud es un parametro controlable. Por el aspecto repetitivo del proceso, el metodo se denomina como "reaccion en cadena de la polimerasa" (a partir de ahora en el presente documento "PCR"). Como los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en terminos de concentracion) de la mezcla, esta se denomina "amplificada mediante PCR".
Abreviaturas y acronimos:
ANX-4
pb
DEAE
dATP
dCTP
dGTP
dNTP
dUTP
EDTA
EtOH
GITC
HPLC
PCR
membrana Q
resina Q
Q-Sepharose™
Q-Sepharose™ XL
DEAE Sephadex™ A- 25
Sepharose®
SSC
SYBR® Gold Taq
[tambien ANX Sepharose™ 4 Fast Flow (high sub)] Marca comercial de GE Healthcare
Systems AB. Resina A basada en perlas de agarosa al 4 % fuertemente reticulada.
pares de bases de nucleotidos
grupo funcional de dietilaminometil eter
5'-trifosfato de 2'-desoxiadenosina
5'-trifosfato de 2'-desoxicitidina
5'-trifosfato de 2'-desoxiguanidina
una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
5'-trifosfato de 2'-desoxiuridina acido etilendiaminotetracetico etanol
isotiocianato de guanidina cromatograffa lfquida de alto rendimiento reaccion en cadena de la polimerasa
Soporte de intercambio anionico con grupos funcionales colgantes de amina cuaternaria en un recubrimiento polimerico reticulado sobre una membrana semipermeable. Los fabricantes incluyen Mustang y Sartorius.
cualquiera de numerosos soportes solidos para intercambio ionico, incluyendo, pero sin limitarse a perlas de polfmero (por ejemplo, poliestireno), partfculas ceramicas, resinas de sefarosa, y resinas de dextrano, que estan funcionalizadas con grupos amonio cuaternario
Un intercambiador anionico fuerte que contiene grupos amonio cuaternario sobre un soporte de Sepharose. Marca comercial de GE Healthcare Systems AB. resina de sefarosa-Q modificada para permitir mayor capacidad de carga. Marca comercial de GE Healthcare Systems AB
un intercambiador anionico debil que contiene el grupo DEAE en un soporte de dextrano. Marca comercial de GE Healthcare Systems aB
una matriz de filtracion en gel basada en agarosa en forma de perlas. Marca comercial registrada de GE Healthcare Bio-Sciences AB
tampon de NaCl 150 mM/citrato de sodio 15 mM, a veces denominado como IxSSC; asf, 2xSSC sena NaCl 300 mM/citrato de sodio 30 mM
colorante sensible a fluorescencia disponible para detectar acidos nucleicos con transiluminadores de ultravioleta convencionales; SYBR es una marca comercial registrada de Molecular Probes, Inc.
(o polimerasa Taq), una polimerasa termoestable utilizada en la reaccion en cadena de
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la polimerasa para comprobar la presencia o ausencia de un gen mediante la amplificacion de un fragmento de ADN.
TE una mezcla de (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)/EDTA 1 mM (pH 8,0)
ADN-Tr ADN transrenal, es decir, ADN que se origina fuera del tracto urinario y que ha
atravesado la barrera renal
Tris (tampon Tris) Tris hidroximetilaminometano
TRlzol® una solucion monofasica de fenol e isotiocianato de guanidina, utilizada para el
aislamiento de ARN; una marca comercial registrada de Molecular Research Center, Inc.
ARN-Tr ARN transrenal, es decir, ARN que se origina fuera del tracto urinario y que ha
atravesado la barrera renal
U unidades de actividad de una enzima, tal como Taq
Wizard® Sistema de purificacion de ADN basado en gel, marca comercial registrada de
Promega Corporation
Salvo que se defina de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente una persona normalmente experta en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica de la presente invencion, se describen a continuacion los metodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y resto de las referencias citadas en el presente documento se han incorporado por referencia en su totalidad expresamente. En caso de conflicto, tendra preferencia la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos, y ejemplos descritos en el presente documento son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion y reivindicaciones detalladas.
Ejemplos
Ejemplo 1
A) Aislamiento de ADN y ARN a partir de orina mediante cromatografia de intercambio ionico con OSepharose™
Preparacion de la orina y union a Q: Para estos experimentos, la orina (15 ml) de voluntarios sanos se filtro a traves de un filtro de jeringa de 5,0 pm Millex-SV (Millipore) y a continuacion se complemento con EDTA 10 mM (pH 8,0) y Tris- HCl 10 mM (pH 8,0). La orina se dejo unir en forma discontinua durante 10 minutos en 400 [mu]l de Q- Sepharose™ (GE Healthcare) sin lavar en un tubo de centnfuga de 50 ml a temperatura ambiente. La resina se recogio mediante centrifugacion a ~1900 g durante 5 min a temperatura ambiente en una centnfuga clmica de sobremesa usando un rotor con canjilones oscilantes. Todo el sobrenadante, salvo ~500 ml, se elimino mediante aspiracion. El aglomerado de resina se resuspendio en el resto del sobrenadante y se transfirio a una columna de cromatograffa Micro Bio-Spin (Bio-Rad). La resina (volumen empaquetado de ~150 pl) se recogio mediante centrifugacion por pulsos en una microfuga durante ~10 s (~10k rpm) y se descarto el lfquido del flujo piston. La resina se lavo tres veces con 500 pl de 2 x SSC (NaCl 300 mM/citrato de sodio 30 mM (pH 7,0)).
Elucion de acidos nucleicos unidos a Q-Sepharose™: Los acidos nucleicos unidos se eluyeron adicionalmente con un volumen de lecho de resina de tres veces bien con una solucion salina muy concentrada [por ejemplo, NaCl 1500 mM/citrato de sodio 150 mM (10xSSC) o LiCl 2 M] o reactivo TRlzol™ (Invitrogen). Cuando se eluyo con TRlzol™ fue necesario tapar la parte inferior de la columna para evitar el flujo por gravedad.
Separacion de las fases de TRlzol™: Los dos eluatos de 200 pl de TRlzol se combinaron y se anadieron 80 pl de CHCl3/alcohol isoairnlico (24:1). La muestra se agito manualmente y, despues de una incubacion de 3 min a temperatura ambiente, la muestra se centrifugo a 12k g durante 15 min t 4 °C. Exactamente 240 pl de la fase sobrenadante acuosa se transfirieron a un tubo nuevo.
Precipitacion de los acidos nucleicos eluidos con TRlzol™: Los acidos nucleicos de la fase acuosa se precipitaron a -20 °C durante 30 min mediante la adicion de 1 pl de glucogeno 20 mg/ml (Roche) y 240 pl de alcohol isopropflico al 100 %. El precipitado se recogio mediante centrifugacion y el aglomerado se lavo dos veces con 200 pl de etanol al 70 %. El aglomerado se dejo secar al aire durante 5 min a temperatura ambiente y a continuacion se volvio a suspender en 30 pl de EDTA 0,1 mM/1x RNA Secure (Ambion). Las muestras se incubaron a 60 °C durante 10 min para inactivar cualquier actividad RNasa residual.
Purificacion basada en silice de los acidos nucleicos eluidos de TRlzol™ (alternativa a la precipitacion): A la fase acuosa superior se anadieron tres volumenes de EtOH al 100%, se mezclo bien y se incubo a temperatura
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ambiente durante 5 min. La mezcla se cargo en una minicolumna de s^lice Axygen Bioscience (numero de catalogo 2227), o equivalente, mediante centrifugacion a 5.000 rpm durante 1 minuto (se puede usar en su lugar una carga bajo vado). La columna de gel de sflice se lava dos veces con 500 jl de LiCl 2 M/EtOH al 80 % seguido por dos lavados adicionales con 500 jl de NaOAc 80 mM a pH 5,2/EtOH al 80 %. Secar la columna de centrifugacion en un tubo Eppendorf nuevo mediante centrifugacion a 10.000 rpm durante 3 minutos. Eluir el ARN con 50-60 jl de H2O doblemente destilada.
Purificacion basada en silice de los acidos nucleicos eluidos con una solucion salina de concentracion elevada: Se anadieron tres volumenes de EtOH al 100 % al eluato fuertemente salino, se sometio a vortizacion y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. La mezcla se cargo en una minicolumna de sflice Axygen Bioscience (numero de catalogo 2227). Como alternativa, se puede utilizar una toma de vado.
La columna de gel de sflice se lava dos veces con 500 jl de LiCl 2 M/NaAc 10 mM (pH 5,2) en EtOH al 70 % seguido por dos lavados adicionales con 500 jl de tampon de lavado (KOAc 75 mM pH 5,0, EtOH al 80 %). Despues del lavado final, la columna de gel de sflice se transfirio a un tubo nuevo y se centrifugo a 10.000 durante 3 minutos. De la columna de gel de sflice, los acidos nucleicos se eluyeron con 50-60 jl de Tris-HCl 1 mM (pH 8,0)/EDTA 0,025 mM (pH 8,0). Para purificar el ARN de la orina de los acidos nucleicos totales aislados, la fraccion eluida se digirio con ADNsa I como se describe en la seccion siguiente (vease digestion con ADNsa I y ARNsa I).
Digestion con ADNsa I y ARNsa I: Para cada muestra, 50 jl de eluato Q NaCl se diluyeron con un volumen equivalente de TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)/EDTA 1 mM (pH 8,0)) y se precipito a -20 °C durante 30 min mediante la adicion de 1 jl de glucogeno 20 mg/ml (Roche) y 100 jl de alcohol isopropflico al 100 %. El precipitado se recogio mediante centrifugacion, se lavo dos veces con 200 jl de etanol al 70 % y se dejo secar al aire durante 5 min.
Espedficamente, para la digestion con ADNsa I, el aglomerado se resuspendio en 10 jl de 1x tampon de reaccion ADNsa I (NEB) que contema dos unidades de ADNsa I exenta de RNasa (NEB). Espedficamente, para la digestion con ARNsa A, el aglomerado se resuspendio en 10 jl de H2O desionizada que contema 50 ng/ml de ARNsa hervida. Ambas muestras digeridas se incubaron a 37 °C durante 60 min antes de la adicion de colorante de carga y electroforesis. Todas las muestras se sometieron a electroforesis sobre poliacrilamida en geles de 1x TBE de poliacrilamida al 5% y se tineron con SYBR® Gold (Invitrogen) con dilucion 1/10000. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Figura 1, y demuestran claramente que tanto el ADN como el ARN se aislaron de la orina mediante cromatograffa de intercambio anionico en Q-Sepharose™.
B) Aislamiento de acidos nucleicos de la orina usando adsorbentes de Q membrane™.
Para estos experimentos, orina (no filtrada) de voluntarios sanos (100 ml), suplementada con EDTA 5 mM (pH 8,0) y Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) se aplico a una membrana adsorbente MA5 Sartobind Q (Sartorious) prehumedecida con 5 ml de tampon de lavado (EDTA 5 mM (pH 8,0)/Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)) con una toma de vado. La membrana se lavo con 5 ml de tampon de lavado y se eluyo sucesivamente con un gradiente en etapa de 1 ml de 1x SSC hasta 10x SSC (1x SSC: NaCl 150 mM/Nacitrato 15 mM (pH 7,0)). Para cada elucion se recogieron dos fracciones de 500 jl. Los 100 jl de la segunda fraccion de cada etapa se diluyeron dos veces con TE y se precipitaron mediante la adicion de un volumen equivalente de isopropanol al 100% usando glucogeno como transportador. Todas las muestras se sometieron a electroforesis sobre poliacrilamida en geles de 1x TBE de poliacrilamida al 5% y se tineron con SYBR® Gold (Invitrogen) con dilucion 1/10000. Como se muestra en la Figura 2, tanto los fragmentos de ADN como los de ARN, incluyendo fragmentos de bajo peso molecular, se aislaron con adsorbentes de Q- membrane.
C) Purificacion de acidos nucleicos de la orina usando Q-Sepharose™ para orina tanto completa como filtrada.
El acido nucleico de la orina se aislo con Q-Sepharose™ mediante elucion con NaCl como se describe en el Ejemplo 1, Seccion A. Sin embargo, para estos experimentos, la muestra de orina tanto no se filtro (completa) o se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,45 jm Millex-HV (Millipore). Ademas, cada muestra se precipito con isopropanol antes de la electroforesis como se describe en el Ejemplo 1, apartado B, en geles de 1x TBE de poliacrilamida al 5 % y se tineron con SYBR® Gold (Invitrogen) con dilucion 1/10000. Tal como se muestra en la Figura 3, el ADNtr, el ARNtr y el ADN genomico se detectaron en todas las muestras analizadas independientemente de si la orina se habfa filtrado o no antes de la adsorcion en la resina. Es tambien evidente que se produjo una disminucion en la cantidad de ADN genomico presente en la muestra filtrada, en comparacion con la muestra no filtrada. No se produjeron diferencias observables en la cantidad de ARN mas pequeno y ADN mas pequeno aislado en comparacion con la orina sin filtrar.
D) Comparacion entre diferentes resinas de intercambio anionico
Para estos experimentos, la orina no filtrada (20 ml) se unio a aproximadamente 400 jl de cada resina por el metodo discontinuo durante 30 min (como se resume en la Tabla 1). El volumen de resina se midio por adicion de la
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suspension de resina comercial a una probeta o jeringa, y eliminando el Ifquido por decantacion. Las mezclas se centrifugaron durante 5 min a 1900 g y la resina aglomerada se enjuago despues con almuotas de 1 ml de concentraciones de cloruro de sodio crecientes, siendo la concentracion final de NaCl 2 M (1,1) y a continuacion se enjuago con tiocianato de guanidina 2 M. Las fracciones recogidas se precipitaron con glucogeno e isopropanol y se volvieron a suspender en 100 jl de TE (tampon Tris 10 mM y EDTA 1 mM)
Tabla 1
Resina
N.° de cat. GE N.° de lote Grupo funcional Capacidad Capacidad
DEAE - Sepharose™
17-0709-10 307354 Intercambiador anionico debil de dietilaminoetilo 0,11-0,16 mmol (Cl)/ml 110 mg HSA/ml medio
ANX-4 Sepharose™
17-1287-10 303229 Intercambiador anionico debil de dietilaminopropilo 0,13-0,18 mmol (Cl)/ml 5 mg de tiroglobulina/ml
Q-Sepharose™
17-0510-10 310297 Intercambiador anionico fuerte de amonio cuaternario 0,18-0,25 mmol (Cl)/ml 120 mg HSA/ml medio
Q-Sepharose XL™
17-5437-10 303229 Intercambiador anionico fuerte de amonio cuaternario modificado 0,18-0,26 mmol Cl/ml 130 mg BSA/ml medio
Ademas, el contenido de acido nucleico de las fracciones purificadas se determino mediante ensayo para la secuencia de nucleotidos que codifica la p-Actina, usando la PCR en tiempo real. La mayona de la plantilla amplificable se eluyo con NaCl de 650 a 800 mM. Las condiciones del ensayo para una reaccion de 25 jl fueron las siguientes: MgCh 3,0 mM, 0,2 mM d(A, G, C)TP, dUTP 0,4 mM, 0,2 jM de cebadores, 0,1 jM de sonda, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 5 mM, gelatina al 0,001 %, y 0,3 UTaq (Jump Start, Sigma D4184). Despues de 1 minuto a 95 °C, la amplificacion se llevo a cabo en 50 ciclos de 30 segundos a 96 °C y 1 min a 60 °C. Los siguientes cebadores se utilizaron en las reacciones de la PCR:
Cebadores:
p-Actina directo 5' - CCCTGGAGAAGAGCTACGAG - 3' p-Actina inverso 5' - AGGAAGGCTGGAAGAGTGC - 3' p-Actina sonda FAM 5' - TGACGGCCAGGTCATCACCA - 3'
La Figura 4A muestra el comportamiento de adsorcion-elucion de acido nucleico de cada resina. Para estos experimentos, los acidos nucleicos se eluyeron tanto de Q-sepharose como de ANX usando NaCl 0,50 - 0,9 mM para elucion. La elucion de acidos nucleicos se produjo para la resina DEAE con NaCl de 0,3 a 0,5 mM, y para la resina XL con de 0,75 mM a aproximadamente 1,2 mM. La Figura 4B muestra la cantidad total de acidos nucleicos que se recuperaron de cada resina a medida que aumentaba el gradiente de NaCl. Tal como se muestra en las Figuras 4A y 4B, se recupero aproximadamente la misma cantidad de acido nucleico desde ANX y Q-sepharose; menos cantidades de acido nucleico desde DEAE, y una cantidad significativamente inferior para la resina XL.
E) Elucion en gradiente por etapas del complejo nucleoproteina/resina
Para estos experimentos, 20 ml de muestra de orina sin filtrar se adsorbieron en 400 jl de Q-Sepharose™ y se eluyeron por etapas con porciones de 1 ml de solucion de NaCl con concentraciones de 300 mM a 2,0 M, y finalmente con isotiocianato de guanidina 2,0 M. Las fracciones se recogieron, y se sometieron a analisis mediante PCR y se examinaron mediante electroforesis en gel de acrilamida al 6 %. El gel se revelo en primer lugar con SYBR® Gold para visualizar los acidos nucleicos, y despues con el colorante Silver para visualizar las protemas.
Tal como se muestra en la Figura 5, tanto las protemas como los acidos nucleicos se pueden eluir selectivamente de la resina y el contenido se puede controlar mediante la concentracion de NaCl. Por ejemplo, las fracciones 1-4 contienen principalmente protemas y acidos nucleicos de bajo peso molecular, (<40 pb), las fracciones 5-8 contienen principalmente acidos nucleicos de (40-400 pb) y las fracciones 9 y superiores contienen principalmente los acidos nucleicos de peso molecular elevado. Finalmente, la fraccion final, obtenida mediante la elucion con isotiocianato de guanidina 2,0, contema protemas que no se habfan eluido en las fracciones anteriores.
F) Fraccionamiento en columna de gel de sflice de acidos nucleicos de la orina.
Los acidos nucleicos eluidos de la resina Q se separaron en fracciones de alto y bajo peso molecular como se describe a continuacion.
Fraccion de peso molecular elevado (HMW):
A los acidos nucleicos eluidos con alto contenido salino se anadieron volumenes iguales de soluciones de EtOH 100 % y GuSCN (isotiocianato de guanidina) 6 M (hasta concentraciones finales de 33 % y 2 M, respectivamente). La mezcla se incubo a temperatura ambiente durante 5 min y se aplico a una minicolumna de gel de sflice Axigen
5
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45
mediante centrifugacion a 10.000 rpm durante 1 min. La fraccion de flujo piston (FT) se recogio para la posterior purificacion de acidos nucleicos de bajo peso molecular. La columna se lavo una vez con 500 |jl de LiCI 2 M/EtOH al 70 % seguido por dos lavados con KOAc 80 mM pH 5,0, EtOH al 80 %. La columna se transfirio a un nuevo tubo de recogida, se centrifugo durante 1 min a 10.000 rpm durante 3 min para secar la membrana. Los acidos nucleicos se eluyeron con 50 jl de Tris-HCl 1 mM (pH 8,0)/EdTA 25 jM EDTA (pH 8,0) en un nuevo tubo de recogida como fraccion HMW. Estos resultados se resumen en la Figura 11.
Fraccion de peso molecular bajo (LMW):
Al FT (vease anteriormente) se anadio EtOH 100 % hasta una concentracion final de aproximadamente un 75 %, se mezclo, se incubo a temperatura ambiente durante 5 min, y se aplico a una minicolumna de gel de sflice Axigen mediante centrifugacion a 10.000 rpm durante 1 min. Las etapas posteriores fueron identicas a las descritas para la fraccion HMW. En la Figura 11 se resumen los resultados de estos experimentos.
G) Estabilidad de los acidos nucleicos unidos a QSepharose
Se estudio el efecto de varias condiciones sobre la estabilidad de los acidos nucleicos unidos a la columna de Q- Sepharose™, usando p-Actina y Lambda como analitos. Para estos experimentos, orina no filtrada (20 ml) y 300 jl de resina se mezclaron por el metodo discontinuo. La resina recogida se eluyo con 1 ml de TE, 1 ml de NaCl 400 mM en TE. A continuacion se eluyeron cuatro resinas/columnas diferentes bien con NaCl 1 mM en TE, tampon del kit de eliminacion de nucleotido de Qiagen (tampon PN, tampon de solubilizacion), tampon del kit Qiagen Viral (tampon AVL, tampon de solubilizacion) o GuSCN 3,0 M. Cada una de las soluciones eluidas se proceso a continuacion mediante precipitacion simultanea en glucogeno/isopropanol, protocolo de eliminacion de nucleotidos (Qiagen Manual), protocolo de aislamiento de ARN vmco (Qiagen Manual), o protocolo Promega Wizard, respectivamente. Usando 1 ml de equivalentes de orina por reaccion de la polimerasa, se determino la presencia del molde como se describe en el Ejemplo 1, seccion D, usando los cebadores de p-Actina y una sonda TaqMan marcada con Fam. Las mismas muestras tambien se analizaron para determinar su efecto sobre la amplificacion Lambda ADN enriquecido con los cebadores (Lmd f, Lmd r) y la sonda Hex (Lmg Hex). Se utilizaron los siguientes tres cebadores Lambda:
Cebadores Lambda:
Lmd_f 5' - ACTTTATGAAAACCCACGTTGAGC - 3'
Lmd_r 5' - CCAGAAGCCACGCCCATTAG - 3'
Lmg Hex sonda 5' - TGGGTAATGCGCGGGTTGTCCTTT - 3'
Las curvas de calibracion se generaron con patrones humanos y ADN genomico de fago lambda y se resumen en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2
p - Actina Lambda
Orina (A260)
Resina Elucion (1 ml) Tc ng/reac. Tc ng/reac.
16
Q NaCl1 M - -
Tampon PN 25,3 3,04 25,7 1,37
Tampon AVL 24,9 3,84 26,0 1,14
Tampon Wizard 24,9 3,95 25,7 1,38
48
Q NaCl1 M - -
Tampon PN 23,9 7,20 25,1 2,17
Tampon AVL 23,7 8,35 24,5 3,37
Tampon Wizard 24,7 4,38 24,7 2,94
A260 - absorbancia UV de la muestra de orina, Q Q-Sepharose™- resina inicial con la carga del proceso discontinuo, PN - kit de eliminacion de nucleotidos Qiagen, AVL - kit vmco de Qiagen, Wizard - usado GITC 3 M y 100 jl de suspension de gel de sflice, GITC 2 M - siguiente elucion despues de NaCl 1 M.
Tabla 3
ADN patron genomico
p - Actina Lambda
ng/reac. Tc Tc
Control TE (5 pl)
- 25,8
0,02 ng/ pl
0,12 30,5 26,1
0,23 ng/ pl
1,17 26,7 25,8
2,34 ng/pl
11,7 23,2 25,8
0,23 ng/pl (5/12)
1,17 23,8 26,4
Control TE (5 pl)
- 25,1
Comparacion de la estabilidad de los acidos nucleicos almacenados en resina Q humeda:
5 Se llevaron a cabo experimented adicionales que determinan la estabilidad de los acidos nucleicos unidos a Q Sepharose. Para estos experimentos, la orina no filtrada (10 ml) y 150 pl de resina Q-Sepharose™ se mezclaron por el metodo discontinuo. La resina se lavo con 1 ml de TE, 1 ml de NaCl 400 mM en TE y finalmente con 1 ml de TE. La resina bien se dejo secar al aire a temperatura ambiente, o se protegio con mas cantidad de TE. En puntos temporales dados, la resina se rehidrato con 1 ml de TE, y se eluyo con NaCl 1 M en TE. Esta se precipito con 10 glucogeno e isopropanol, de los que 2 ml de equivalentes de orina se cargaron sobre el gel. Tal como se muestra en la Figura 6, la mezcla se acidos nucleicos y protemas permanecio inalterada durante 11 dfas cuando se unio a la resina Q-Sepharose™, tanto seca (hileras 5-7) o en solucion tamponadora (hileras 8-10).
Ademas, se realizaron experimentos para examinar, mediante PCR en tiempo real, la estabilidad de moldes de acido 15 nucleico almacenados como complejos de nucleoprotema/resina Q. De manera similar, la Figura 7 ilustra que los moldes de acido nucleico permanecen estables durante 11 dfas. Los resultados de estos experimentos indican claramente que, tras la adsorcion y almacenamiento en Q-Sepharose™, los acidos nucleicos permanecen estables (Tabla 4).
20 Tabla 4
Resina
Tampon de almacenamiento Dias Tc ng/reac.
Q
T 0 28,1 0,27
TE 0 28,1 0,28
EtOH al 20 % 0 27,5 0,37
EtOH al 40 % 0 28,6 0,21
EtOH al 60 % 0 28,4 0,23
Q
T 2 28,4 0,23
TE 2 27,9 0,30
EtOH al 20 % 2 27,7 0,35
EtOH al 40 % 2 27,9 0,30
EtOH al 60 % 2 28,2 0,25
Q
T 5 28,7 0,19
TE 5 28,9 0,18
EtOH al 20 % 5 28,6 0,20
EtOH al 40 % 5 28,5 0,22
EtOH al 60 % 5 28,5 0,22
Q
T 8 28,5 0,21
TE 8 28,7 0,19
5
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15
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25
Resina
Tampon de almacenamiento Dias Tc ng/reac.
EtOH al 20 % 8 28,7 0,19
EtOH al 40 % 8 29,5 0,12
EtOH al 60 % 8 29,1 0,16
Q
T 11 28,8 0,18
TE 11 28,1 0,27
EtOH al 20 % 11 28,7 0,20
EtOH al 40 % 11 28,6 0,20
EtOH al 60 % 11 28,2 0,25
H) Discontinuo vs. columna vs. vacio
Se realizaron experimentos para demostrar que la velocidad de carga de la muestra de orina en Q-Sepharose™ tiene un efecto mmimo sobre la union de los diferentes componentes. Para estos experimentos, se cargo orina (20 ml) en cuatro resinas diferentes (400 jl) de cuatro formas diferentes:
1. De forma discontinua, como se ha descrito anteriormente, mezclando la resina y la muestra de orina durante 40 minutos.
2. Mediante contacto rapido (un minuto con una minicolumna Q-Sepharose™ empaquetada: (Columnas disponibles de Bio-Rad: 5 cm Bio-Spin 732-6008 o 3 cm Micro BioSpin 732-6204; o de Sigma C2728-200 o una columna equivalente fritada con un tamano de poro de 30 um).
3. Mediante contacto lento (aproximadamente 8 minutos) con minicolumnas Q-Sepharose™ empaquetadas. Las columnas se eluyeron a 2.500 rpm (1303 g) durante 5 minutos usando una centnfuga Sorvall TR-5 (Newtown, CT), RTH-250 con un rotor de cangilones basculantes, mediante jeringa a traves de un cartucho de columna de resina empaquetada (de 3 a 6 minutos), o
4. Mediante el uso de una toma de vacfo en un cartucho de resina Q-Sepharose™ empaquetada con un accesorio luer lock.
Tras la carga, en cada caso, la resina se enjuago con NaCl 400 mM y se eluyo con NaCl 1 M en TE. los acidos nucleicos se precipitaron junto con el transportador, por ejemplo, glucogeno e isopropanol. Cada hilera contiene 4 ml de equivalentes de orina. Como se muestra en la Tabla 5 y en la Figura 8, no hubo diferencias en la adsorcion con Q-Sepharose de los acidos nucleicos independientemente del metodo de carga.
Un analisis mediante PCR muestra una retencion similar del molde para todas las muestras medidas. Los datos se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5
Resina
Metodo de flujo Tiempo Tc
Q-Sepharose™
Discontinuo 40:00 24,4
Lento 8:20 25,1
Rapido 0:45 25,1
Vacfo 6:02 24,8
DEAE-Sepharose
Discontinuo 40:00 26,7
Lento 8:13 25,8
Rapido 0:54 25,9
Vacfo 3:36 25,7
Xl-Sepharose
Discontinuo 40:00 41,2
Lento 8:37 no aplicable
Rapido 0:55 39,0
Vacfo 4:37 27,8
ANX-4-Sepharose
Discontinuo 40:00 24,6
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Resina
Metodo de flujo Tiempo Tc
Lento 8:30 24,8
Rapido 0:54 25,2
El metodo de aislamiento de acidos nucleicos a partir de orina presente se resume graficamente en las Figuras 9 y 10.
Ejemplo 2
Preparacion del plasma:
Para estos experimented, se recogieron muestras de sangre de donantes sanos en tubos para extraccion de sangre venosa BD VACUTAINER que conteman EDTA como anticoagulante EDTA (K3). Las celulas sangumeas se eliminaron mediante centrifugacion durante 10 min a 1.000 rpm.
Aislamiento de los acidos nucleicos contenidos en plasma sanguineo
Protocolo 1 (aislamiento de ADN).
La muestra de plasma se complemento con un volumen equivalente de solucion de NaCl 0,4 M NaCl preparada con TE. Veinte mililitros de plasma diluido se mezclaron con 0,5 ml de suspension de resina Q y se incubaron de 15 a 60 min a temperatura ambiente. A continuacion, la muestra se centrifugo durante 5 min a 1900 x g y la resina aglomerada se transfirio a una minicolumna (Bio-Rad). Antes de la elucion con NaCl 1,0 M, la resina se lavo dos veces con NaCl 0,5 M. Los acidos nucleicos eluidos se precipitaron mediante la adicion de un volumen equivalente de isopropanol al 100 % usando glucogeno como transportador y se volvieron a suspender en 100 pl de TE (tampon Tris 10 mM y EDTA 1 mM).
Protocolo 2 (aislamiento de ADN y de ARN)
Preparacion del plasma para union a Q: 1 ml de una muestra de plasma de un voluntario sano se suplemento con EDTA y tampon Tris-HCl (pH 8,0) hasta concentraciones finales de 50 mM y se digirio con 75 pl de proteinasa K (Qiagen) durante 1 hora a 37 °C. Tras la digestion, el volumen de las mezclas se llevo hasta 5 ml por adicion de 4 ml a una solucion que contema EDTA 50 mM; Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y Tween 20 al 0,01 %. Union a Q: Las muestras de plasma diluido se dejaron unir en forma discontinua durante 10 minutos en 250 pl de Q-Sepharose™ (GE Healthcare) sin lavar en un tubo de centnfuga de 15 ml a temperatura ambiente. La resina se recogio mediante centrifugacion a 2.000 g durante 5 min a temperatura ambiente en una centnfuga clmica de sobremesa usando un rotor con canjilones oscilantes. Todo el sobrenadante, salvo aproximadamente 0,5 ml, se elimino mediante aspiracion. El aglomerado de resina se resuspendio en el resto del sobrenadante y se transfirio a una columna de cromatograffa Micro Bio-Spin (Bio-Rad). La resina se recogio mediante centrifugacion por pulsos en una microfuga durante ~10 s (~10k rpm) y se descarto el lfquido del flujo piston. La columna se lavo tres veces con 500 pl de LiCl 300 mM/NaOAc 10 mM (pH 5,2).
Elucion de acidos nucleicos unidos a Q-Sepharose™: Los acidos nucleicos unidos se recogieron mediante dos eluciones consecutivas de 200 pl bien con LiCl 2 M/NaOAc 10 mM (pH 5,2) Los acidos nucleicos purificados se desalaron mediante adsorcion en gel de sflice como se ha descrito anteriormente.
Protocolo 3 (aislamiento de ARN)
Preparacion del plasma para union a Q: 1 ml de una muestra de plasma de un voluntario sano se suplemento con EDTA y tampon Tris-HCl (pH 8,0) hasta concentraciones finales de 50 mM y 40 pl del inhibidor de ARNsa - RNAsecure (Ambion). La mezcla se calento durante 10 min a 60 °C para inactivar la ribonucleasas presentes en el plasma. Para la digestion de las protemas del plasma, se anadieron 75 pl de proteinasa K (Qiagen) a la mezcla y se incubo durante 1 hora a 37 °C. Tras la digestion, el volumen de las mezclas se llevo a 5 ml por adicion de 4 ml de una solucion que contema EDTA 50 mM; Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y Tween 20 al 0,01 %.
Union a Q: La muestra de plasma diluido se dejaron unir en forma discontinua durante 10 minutos en 250 pl de Q- Sepharose™ (GE Healthcare) sin lavar en un tubo de centnfuga de 15 ml a temperatura ambiente. La resina se recogio mediante centrifugacion a 2.000 g durante 5 min a temperatura ambiente en una centnfuga clmica de sobremesa usando un rotor con canjilones oscilantes. Todo el sobrenadante, salvo aproximadamente 0,5 ml, se elimino mediante aspiracion. Los aglomerados de resina se resuspendieron en el resto de sobrenadantes y se transfirio a una columna de cromatograffa Micro Bio-Spin (Bio-Rad). La resina (volumen empaquetado de ~65 pl) se recogio mediante centrifugacion por pulsos en una microfuga durante ~10 s (~10.000 rpm) y se descarto el lfquido del flujo piston. La columna se lavo tres veces con 500 pl de LiCl 300 mM/NaOAc 10 mM (pH 5,2).
Elucion de acidos nucleicos unidos a Q-Sepharose™: Los acidos nucleicos unidos se recogieron mediante dos eluciones consecutivas de 200 |jl bien con LiCI 2 M/NaOAc 10 mM (pH 5,2) o el reactivo TRIzol™ (Invitrogen).
Separacion de las fases de TRIzol™: Los eluatos de 200 jl de TRlzol de cada columna se combinaron y se 5 complementaron con 80 jl de CHCh/alcohol isoairnlico (24:1). Las muestras se agitaron manualmente y despues de 3 min de incubacion a temperatura ambiente se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. 240 jl de la fase acuosa superior de cada tubo se transfirieron a tubos nuevos.
Precipitacion de los acidos nucleicos eluidos con TRlzol™: Los acidos nucleicos de la fase acuosa se precipitaron a 10 -20 °C durante 30 min mediante la adicion de 1 jl de glucogeno 20 mg/ml (Roche) y 240 jl de alcohol isopropflico al
100%. El precipitado se recogio mediante centrifugacion y se lavo dos veces con 200 jl de etanol al 70%. El aglomerado se seco durante 5 min a temperatura ambiente y a continuacion se volvio a suspender en 30 jl de EDTA 0,1 mM/1x RNA Secure (Ambion). La muestra se incubo a 60 °C durante 10 min para inactivar cualquier actividad ARNasa o ADNsa residual.
15
La purificacion de los acidos nucleicos eluidos con gel de silice se llevo a cabo como se ha descrito anteriormente. Analisis de los acidos nucleicos purificados a partir del plasma: La preparacion de acido nucleico del plasma eluida con TRlzol se sometio a analisis adicional. Los inventores seleccionaron el microARN 16 (mir-16), expresado de forma abundante, como diana. Alfcuotas de 5 jl de cada muestra de acido nucleico del plasma eluida con TRlzol se 20 sometio a una reaccion de la PCR cuantitativa con TaqMan microRNA usando cebadores y sondas suministrados por Applied Biosystem. Las reacciones se llevaron a cabo esencialmente segun las recomendaciones del fabricante. Mir-16 se detecto facilmente en la preparacion de ARN del plasma. En la Figura 12 se resumen los resultados de estos experimentos.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para aislar acidos nucleicos de una muestra de orina que comprende:
    separacion de la muestra de orina en una fraccion exenta de celulas, que contiene acidos nucleicos en el intervalo de 10 a 100 pares de bases, por eliminacion de las celulas y los residuos insolubles mediante filtracion o centrifugacion;
    aplicacion de la fraccion exenta de celulas que contiene los acidos nucleicos o sus complejos protemicos a un material de intercambio anionico que comprende grupos amonio cuaternarios, y quedando dichos acidos nucleicos o sus complejos adsorbidos sobre dicho material;
    elucion de los acidos nucleicos unidos haciendo pasar por dicho material de intercambio anionico una solucion acuosa fuertemente salina que eluye los acidos nucleicos diana o los complejos protemicos de los mismos adsorbidos sobre el material de intercambio anionico;
    y purificacion mediante gel de sflice de los acidos nucleicos eluidos con la solucion fuertemente salina para proporcionar acidos nucleicos exentos de celulas en el intervalo de 10 a 100 pares de bases.
  2. 2. Un metodo para aislar acidos nucleicos de una muestra de plasma sangumeo que comprende:
    separacion de la muestra de sangre en una fraccion de plasma sangumeo exenta de celulas, que contiene acidos nucleicos en el intervalo de 10 a 100 pares de bases, por eliminacion de las celulas y los residuos insolubles mediante filtracion o centrifugacion;
    aplicacion de la muestra de plasma sangumeo exenta de celulas que contiene los acidos nucleicos o sus complejos protemicos a un material de intercambio anionico que comprende grupos amonio cuaternarios, y quedando dichos acidos nucleicos o sus complejos adsorbidos sobre dicho material;
    elucion de los acidos nucleicos unidos haciendo pasar por dicho material de intercambio anionico una solucion acuosa fuertemente salina que eluye los acidos nucleicos diana o los complejos protemicos de los mismos adsorbidos sobre el material de intercambio anionico;
    y purificacion mediante gel de sflice de los acidos nucleicos eluidos con la solucion fuertemente salina para proporcionar acidos nucleicos exentos de celulas en el intervalo de 10 a 100 pares de bases.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que los acidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en ADN bicatenario y monocatenario y ARN.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1 o 2 que comprende la etapa de mantener el complejo de acido nucleico/intercambio anionico en almacenamiento durante hasta 3 semanas.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas lavar dicho material de intercambio anionico con una solucion acuosa de una sal a la que los acidos nucleicos quedan unidos en dicho material de intercambio anionico, teniendo dicho lavado suficiente volumen y fuerza ionica para lavar los componentes no unidos o unidos debilmente a traves de dicho material de intercambio anionico.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas el analisis de los acidos nucleicos aislados exentos de celulas.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, donde dichos acidos nucleicos aislados estan en el intervalo de 10 a 40 pares de bases.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, donde dicha elucion comprende ademas la adicion de isotiocianato de guanidina a dichos acidos nucleicos diana o complejos protemicos eluidos.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, donde dicho isotiocianato de guanidina es isotiocianato de guanidina 2 M.
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