CN101363045B - 一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法 - Google Patents

Abstract

一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，超微磁颗粒结合到生物靶物质大分子上，在外加磁场的作用下，依次经过洗涤、洗脱，分离纯化得到生物靶物质。本发明采用具有较小粒径的超微磁颗粒与生物靶物质结合，一个生物靶物质大分子结合多个超微磁颗粒，相对于现有技术的一个磁颗粒结合多个生物靶物质分子，其结合能力更强，从而在后续的结合液的选择、洗涤液的选择、洗脱液的选择中有更宽松的选择。

Description

一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法

技术领域

本发明涉及生物样品中特定物质的分离纯化，特别是指一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法。

背景技术

现有技术中，已经有许多方法用磁颗粒分离纯化纯化生物大分子(核酸、蛋白等)，这些方法都是用磁颗粒吸附生物大分子，这些磁颗粒包括：硅磁颗粒、玻璃磁颗粒等，从而达到分离和纯化的目的。在美国专利6027945中描述了一种利用硅磁颗粒进行生物靶物质分离纯化的方法，该方法的主要特点是利用硅磁颗粒在特定条件下(高浓度胍盐)吸附核酸等物质，然后外加磁场分离纯化结合有核酸的磁颗粒，经过含乙醇的洗液洗涤，最后用水将核酸从磁珠上洗脱。另外，在美国专利6562568中利用一种玻璃磁颗粒进行生物靶分子分离纯化的方法，其操作步骤与专利6027945中描述基本一致，只是使用的磁颗粒不同，这个专利使用的是玻璃磁颗粒，同样要用高浓度胍盐促进核酸结合到磁颗粒，然后再用含乙醇的洗液洗涤，最后用水将核酸从磁珠上洗脱，两个专利的主要区别是二者使用的磁颗粒不同，而同样是三个主要步骤，即“结合”、“洗涤”、“洗脱”。

详观上述方法，不难发现其存在下列问题：

这些方法都是利用直径在0.5-15微米较大的磁颗粒吸附核酸等大分子，然后再磁分离纯化、洗涤、洗脱核酸。这些方法的特点是粒径较大的磁颗粒吸附核酸，一个磁颗粒吸附若干个生物分子，而这种磁颗粒吸附核酸的能力较小，所以必须在高浓度强离液盐(如胍盐)的条件下，同时必须使用氧化硅或玻璃等成分包裹在氧化铁磁颗粒表面而增加吸附能力，才能结合核酸。另外必须在洗涤磁颗粒和核酸的复合物时使用含有醇的试剂。而高浓度强离液盐毒性较大，对实验人员和环境有较大影响，而用含有醇的溶液洗涤，对核酸的后续操作有较大影响。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点，提供一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质特别是核酸的方法。

本发明采用如下技术方案：一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，包括如下步骤：

1)将超微磁颗粒加入到含有生物靶物质的样品溶液中，超微磁颗粒结合到生物靶物质上，其结合方式为一个生物靶物质分子结合若干个超微磁颗粒，形成生物靶物质和超微磁颗粒的复合物，在外加磁场的作用下，将生物靶物质和超微磁颗粒的复合物从样品中分离出来；

2)在洗脱液中将超微磁颗粒从生物靶物质上洗脱下来，并在外加磁场的作用下，将超微磁颗粒分离，从而获得含生物靶物质的溶液。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述的生物靶物质和磁颗粒的结合方式与现有技术不同，现有技术采用粒径较大的磁颗粒，其和生物靶物质结合方式是“一个磁颗粒吸附多个生物靶物质分子”，而本发明采用粒径较小的磁颗粒，其和生物靶物质结合方式是“一个生物靶物质分子吸附多个磁颗粒”。这种结合方式的改变，使得本发明中生物靶物质和磁颗粒的结合更“容易”，从而在后续的结合液的选择、洗涤液的选择、洗脱液的选择中有更宽松的选择。因此整个生物靶物质分离纯化实验更简单、安全，具有明显的优越性。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述超微磁颗粒的平均粒径为10-200nm，优选的平均粒径为50-150nm，比现有技术的磁颗粒直径平均小100倍，体积小100万倍左右。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述超微磁颗粒为具有超顺磁性的超微磁颗粒，可以是含有铁的氧化物的磁颗粒、氧化硅包裹的复合磁颗粒、氧化硅和氧化硼包裹的复合磁颗粒。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述超微磁颗粒为氧化铁磁颗粒。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述生物靶物质为核酸、蛋白质等生物大分子。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述生物靶物质和磁颗粒结合时，可以使用结合液促进生物靶物质和磁颗粒的结合，结合液由普通的盐溶液、醇溶液或二者的组合组成，而不采用有毒的高浓度强离液盐(如胍盐)。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，在生物靶物质和磁颗粒结合形成复合物后，可以用洗涤液洗涤分离出来的这个复合物，并在外加磁场的作用下将洗涤后的生物靶物质和超微磁颗粒的复合物从洗涤液中分离出来。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述结合液为无毒的盐溶液、醇溶液、或二者的组合，如可以是氯化钠溶液、异丙醇溶液或二者的组合。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述洗涤液为盐溶液、醇溶液、或二者的组合。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述洗涤液为盐溶液，如可以是低浓度的氯化钠溶液，而不使用醇。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述洗脱液为水或pH值约等于8的低离子浓度的缓冲液。

前述一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，所述洗脱液为Tris-HCl溶液。

本发明中，结合液的选择至关重要，不同的盐浓度和盐种类对核酸与超微磁颗粒的结合的影响有很大不同。核酸和超微磁颗粒均与水结合，而加入盐，盐在溶液中要结合大量的游离水，从而使得核酸、超微磁颗粒与水分离，并且核酸与超微磁颗粒结合成复合物。反应体系中盐离子浓度越高，其去水化能力就越强，越能促进核酸与超微磁颗粒的结合。但是，如果样品中含有蛋白质，而分离样品的目的只是想得到核酸，则有些种类的盐可能会使蛋白质变性而污染核酸。高浓度的异硫氰酸胍、高氯酸钠、碘化钠等盐溶液是促进核酸与磁颗粒结合的首选，但是这几种盐均有很大的毒性，对实验人员和环境均有较大的不良影响。本发明中，由于采用了体积小100万倍的超微磁颗粒，其结合方式是一个核酸分子结合多个磁颗粒，其与核酸结合的能力更强，因此可以选用无毒的盐溶液作为结合液，比如可以选用高浓度的氯化钠溶液来促进核酸与超微磁颗粒的结合。

另外，由于醇类可以降低水的介电常数，本发明中，结合液可以通过加入一定的醇类而促进核酸与超微磁颗粒的结合，如可以加入乙醇、异丙醇等。但是，由于醇类可能抑制核酸后续的酶反应，所以本发明在洗涤时不倾向于使用醇类。

由上述对本发明的描述可知，和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明生物靶物质和磁颗粒的结合方式与现有技术不同，现有技术采用粒径较大的磁颗粒，其和生物靶物质结合方式是“一个磁颗粒吸附多个生物靶物质分子”，而本发明采用粒径较小磁颗粒，其和生物靶物质结合方式是“一个生物靶物质分子吸附多个磁颗粒”。这种结合方式的改变，使得本技术中生物靶物质和磁颗粒的结合更“容易”，从而在后续的结合液的选择、洗涤液的选择、洗脱液的选择中有更宽松的选择。因此整个核酸纯化实验更简单、安全，具有明显的优越性。

2)正是由于本发明的超微磁颗粒与生物靶物质具有较强的结合能力，本发明的结合液可以不选用有毒的高浓度盐溶液，而选用无毒的盐溶液促进生物靶物质与超微磁颗粒的结合。

3)也正是由于本发明的超微磁颗粒与生物靶物质具有较强的结合能力，本发明克服了现有技术中必须使用含醇的洗涤液进行洗涤，而可以采用不含醇的洗涤液进行洗涤，从而不会对生物靶物质的后续操作有不利的影响。

4)由于本发明的超微磁颗粒粒径较小，其在与生物靶物质大分子结合时可以穿插黏附于生物大分子上，故本发明的超微磁颗粒外层可以是不包裹硅的磁颗粒，也可以达到同样的对生物靶物质分离纯化的效果。

具体实施方式

实施例1：用超微磁颗粒结合样品中核酸

材料：

分别使用3种超微磁颗粒，即氧化铁超微磁颗粒、硅包裹超微磁颗粒、硅硼包裹超微磁颗粒，粒径平均范围50-100nm，浓度40mg/mL。

结合液1：20％氯化钠、30％异丙醇；

结合液2：20％氯化钠；

结合液3：30％异丙醇；

结合液4：60％异硫氰酸胍；

1μg/μL鱼精DNA；

操作步骤：

将20μL的1μg/μL鱼精DNA分别加入到100μL结合液中，混匀，分别加入三种各100μL的超微磁颗粒(浓度40mg/mL)，混匀，保持磁颗粒悬浮，放置10分钟，用磁力架分离磁颗粒，剩余的液体用琼脂糖电泳，SYBR GreenI染色。

通过结果观测可见，结合液1、结合液3、结合液4溶液中基本没有剩余核酸，结合液2中有剩余核酸，与原液对比，结合效率大致有80％左右。

实施例2：各种洗涤液对比

材料：

洗涤液1：50mmol/L Tris-HCl，100mmol/LNaCl，50％乙醇；

洗涤液2：50mmol/L Tris-HCl，20％NaCl；

洗涤液3：50mmol/L Tris-HCl，50％乙醇；

操作步骤：

将20μL的1μg/μL鱼精DNA分别加入到100μL结合液中，混匀，分别加入100μL的超微磁颗粒(浓度40mg/mL)，混匀，保持磁颗粒悬浮，放置10分钟，用磁力架分离磁颗粒，去除液体，加入各种洗涤液400μL，混匀，磁力架分离磁颗粒，去除液体，重复用洗涤液洗3遍，最后1遍时尽量去除液体，晾干10分钟，加入洗脱液100μL，旋涡振荡10分钟，磁力架分离磁颗粒，将液体取出，即为纯化的DNA。用琼脂糖电泳，SYBR Green I染色观测。

通过结果观测可见，洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3都具有很好的洗涤效果，各洗涤液都有较好的提取效果，证实核酸和磁颗粒结合后，在洗涤液中二者不会分离。

实施例3：提取人血液中基因组DNA

材料：

分别使用3种超微磁颗粒，即氧化铁超微磁颗粒、硅包裹超微磁颗粒、硅硼包裹超微磁颗粒，粒径平均范围50-100nm，浓度40mg/mL。

结合液1：20％氯化钠、30％异丙醇；

洗涤液：50mmol/L Tris-HCl，20％氯化钠NaCl；

洗脱液：10mmol/L Tris-HCl；

蛋白酶K：10mg/ml；

操作步骤：

100μL血液用蛋白酶K消化后，加入300μL结合液1，混匀，分别加入三种各100μL的超微磁颗粒(浓度40mg/mL)，混匀，保持磁颗粒悬浮，放置10分钟，用磁力架分离磁颗粒，去处液体，再加入300μL结合液1，用磁力架分离磁颗粒，去处液体。加入洗涤液400μL，混匀，磁力架分离磁颗粒，去处液体，重复用洗涤液洗3遍，最后1遍时尽量去除液体，晾干10分钟，加入洗脱液100μL，旋涡振荡10分钟，磁力架分离磁颗粒，将液体取出，即为纯化的DNA。用琼脂糖电泳，SYBR GreenI染色观测。

结果可见各磁颗粒都可以提取核酸，三者差别不大。

上述仅为本发明的几个具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (5)

1.一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将粒径为50-100nm的氧化铁超微磁颗粒、氧化硅包裹的复合超微磁颗粒或氧化硅和氧化硼包裹的复合超微磁颗粒加入到含有生物靶物质的样品溶液中，超微磁颗粒结合到生物靶物质上，其结合方式为一个生物靶物质分子结合多个超微磁颗粒，形成生物靶物质和超微磁颗粒的复合物，在外加磁场的作用下，将生物靶物质和超微磁颗粒的复合物从样品中分离出来；

2)在洗脱液中将超微磁颗粒从生物靶物质上洗脱下来，并在外加磁场的作用下，将超微磁颗粒分离，从而获得含生物靶物质的溶液。

2.如权利要求1所述的一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，其特征在于：所述生物靶物质为核酸、蛋白质等生物大分子。

3.如权利要求1所述的一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，其特征在于：所述步骤1)中超微磁颗粒结合到生物靶物质上时采用结合液促进结合，该结合液为氯化钠溶液、异丙醇溶液或二者的结合。

4.如权利要求1所述的一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，其特征在于：所述步骤1)中形成生物靶物质和超微磁颗粒的复合物后，采用洗涤液洗涤分离出来的该复合物，该洗涤液为盐溶液，并在外加磁场的作用下将洗涤后的生物靶物质和超微磁颗粒的复合物从洗涤液中分离出来。

5.如权利要求1所述的一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法，其特征在于：所述洗脱液为水或pH值约等于8的缓冲液。