CN105462959A

CN105462959A - 一种核酸分离净化溶液

Info

Publication number: CN105462959A
Application number: CN201510875201.0A
Authority: CN
Inventors: 史镜宇; 史维多利亚; 刘艳红; 言国英; 马小伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2016-04-06

Abstract

本发明公开了一种核酸分离净化溶液，所述溶液主要包括钠盐和/或钾盐、水溶性有机溶剂和水；所述溶液的PH值范围为2.0～5.0；所述钠盐和/或钾盐中的钠离子和/或钾离子的浓度为1.0M～3.0M；所述核酸分离净化溶液与核酸之间进行可逆结合，从而对核酸进行分离沉淀。本发明提供的核酸分离净化溶液不含离液盐，也不添加任何有毒的试剂，成本较低，分离效率高；本发明的核酸分离溶液中也无变性剂，很环保，甚至在野外操作时，废液不需经过任何特殊处理，可直接排放；通过本发明的溶液纯化得到的核酸，纯度高，对下游的实验酶切、PCR和测序等毫无影响；可广泛应用基因治疗、基因疫苗接种、酶反应限制消化、标签、测序等。

Description

一种核酸分离净化溶液

技术领域

本发明涉及生物学应用领域，更具体地说涉及一种核酸分离净化溶液。

背景技术

在现有技术中已知用于分离核酸如DNA和RNA的大量方法，这些方法允许从各种来源的样品材料中分离。这些包括天然来源的样品材料，例如能够从人、动物、植物和环境中得到的复杂样品，以及来自实验室培养的样品材料，如微生物和细胞培养材料。

在经典的方法中，通常首先向样品材料加入含有离液剂的水性缓冲液用于各细胞的裂解、样品的消化，所述缓冲液通常含有胍盐。这之后通常是污染蛋白质的变性和通过与有机提取剂混合来提取核酸，该提取剂通常含有苯酚和／或氯仿。在分离含有核酸的水相与有机相之后，进行例如醇沉淀以从水溶性污染物和苯酚／氯仿组分中纯化核酸。

这些方法有重大的缺点：第一，它用有机物质、化学物来提取核酸，对许多酶而言，这些物质通常是强烈的抑制剂；第二，它需要用有机溶剂多次提取，使核酸从其他生物成分例如蛋白、油脂、细胞的细胞器等中分离；第三，这些使用的有机溶剂是有毒的，例如苯酚、氯仿，并且苯酚是一种强氧化剂，它能氧化核酸从而导致核酸被破坏。另一方面，传统的核酸净化溶液会含有一些高离液盐的试剂，成本比较高，纯化效率比较低。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明目的是提供一种核酸分离净化溶液，该溶液主要是使用含有钠盐和/或钾盐的有机水溶液，对核酸进行可逆结合，再使用磁珠吸附核酸，最后洗脱液洗脱得到核酸。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种核酸分离净化溶液，所述溶液主要包括钠盐和/或钾盐、水溶性有机溶剂和水；所述溶液的PH值范围为2.0～5.0；所述钠盐和/或钾盐中的钠离子和/或钾离子的浓度为1.0M～3.0M；所述核酸分离净化溶液与核酸之间进行可逆结合，从而对核酸进行分离沉淀，磁珠吸附。

进一步地，所述的钠盐为任何形式的钠离子盐，包括醋酸钠、氯化钠、柠檬酸钠及磷酸钠；所述的钾盐为任何形式的钾离子盐，包括醋酸钾、氯化钾、柠檬酸钾及磷酸钾。

进一步地，所述的水溶性有机溶剂为乙醇，所述乙醇的浓度为20%～30%。

进一步地，所述溶液的PH值范围为4.0～4.8；所述钠离子和/或钾离子的浓度为2.0M～2.5M。

进一步地，所述的核酸分离净化溶液可用于结合不同的核酸样本，包括质粒DNA、RNA或混合DNA和RNA分子。

更进一步地，所述核酸样本的来源包括动物或人类的体液、组织、器官、细胞、细胞培养及PCR产品。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的核酸分离净化溶液不含离液盐，也不添加任何有毒的试剂，成本较低，分离效率高；本发明的核酸分离溶液中也无变性剂，很环保，甚至在野外操作时，废液不需经过任何特殊处理，可直接排放；最后通过磁珠吸附，可以得到更多量的核酸。通过本发明的溶液纯化得到的核酸，纯度高，对下游的实验酶切、PCR和测序等毫无影响；可广泛应用基因治疗、基因疫苗接种、酶反应限制消化、标签、测序等。

附图说明

图1为不同浓度的NaAc对核酸绑定的影响结果的电泳图片。

图2为不同PH值的S1溶液对核酸绑定的影响结果的电泳图片。

图3为结合液S1与无水乙醇的混合液对绑定核酸的影响结果的电泳图片。

图4为质粒DNA分离纯化使用缓冲溶液N1和20%-30%（V/V）无水乙醇的电泳结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

一种核酸分离净化溶液，所述溶液主要包括钠盐和/或钾盐、水溶性有机溶剂和水。所述溶液的PH值范围为2.0～5.0；所述钠盐和/或钾盐中的钠离子和/或钾离子的浓度为1.0M～3.0M；所述溶液的PH值范围优选为4.0～4.8；所述钠离子和/或钾离子的浓度优选为2.0M～2.5M。所述核酸分离净化溶液与核酸之间进行可逆结合，从而对核酸进行分离沉淀。

所述的钠盐为任何形式的钠离子盐，包括醋酸钠、氯化钠、柠檬酸钠及磷酸钠；所述的钾盐为任何形式的钾离子盐，包括醋酸钾、氯化钾、柠檬酸钾及磷酸钾。

所述的水溶性有机溶剂优选为乙醇，所述乙醇的浓度为20%～30%。

所述的核酸分离净化溶液可用于结合不同的核酸样本，包括质粒DNA、RNA或混合DNA和RNA分子。所述核酸样本的来源包括动物或人类的体液（全血、血清、尿、粪便、精子、唾液）、组织、器官、细胞、细胞培养及PCR产品。

通过上述溶液纯化得到的核酸，纯度高，对下游的实验酶切、PCR和测序等毫无影响；且可广泛应用基因治疗、基因疫苗接种、酶反应限制消化、标签、测序等。

表1：不同浓度的NaAc对核酸绑定的影响

核酸分离净化溶液S1的组成包括：浓度为2.0M～2.5M的醋酸钠（PH约为4.0～4.8），浓度为20%～30%的乙醇，水。上表1中，PBT具有绑定DNA作用，包含有高离液盐，TE是缓冲溶液，具有稀释溶解DNA的作用。

上述表1试验了不同浓度的NaAc对核酸绑定的影响，用洗脱下来的1μLDNA加1μL的10x上样溶液，8μL的超纯水混合，点样到1%的琼脂糖凝胶中，通过紫外线照射溴化乙锭染色，呈现图片。图1中的泳道1～6对应上表1中的数据。上述试验结果说明NaAc的浓度优选为2.0M～2.5M之间，此时DNA的回收率可达90%左右。

表2：不同PH值的S1溶液对核酸绑定的影响

上述表2试验了不同PH值的S1溶液对核酸绑定的影响，用洗脱下来的1μLDNA加1μL的10x上样溶液，8μL的超纯水混合，点样到1%的琼脂糖凝胶中，通过紫外线照射溴化乙锭染色，呈现图片。图2中的泳道1～6分别对应表2中的数据。上述试验结果说明上述溶液S1的PH值的优选范围为4.8以下，此时DNA的得率在88%～98%之间。

表3：溶液S1与无水乙醇的混合液对核酸绑定的影响

上述表3试验了结合液S1与无水乙醇的混合液对核酸的绑定情况，结合液S1与无水乙醇等体积混合后，显著增加了绑定核酸的能力。用洗脱下来的1μLDNA加1μL的10x上样溶液，8μL的超纯水混合，点样到1%的琼脂糖凝胶中，通过紫外线照射溴化乙锭染色，呈现图片。图3中的泳道1～6分别对应表3中的数据。上述试验结果说明结合液选择用一定量溶液S1或者等体积的溶液S1和无水乙醇混合绑定核酸的效率比用盐酸胍和Qiagen的PBT溶液的都高。

表4：比较结合溶液C1和N1对质粒DNA的分离、纯化效果

编号	结合溶液	OD260测DNA 得率 (μg)	琼脂糖凝胶电泳估算DNA得率 (μg)	注释
					1	溶液C1，PH 1.90	15.2	8.0	RNA 污染
2	溶液 C1，PH 1.90，+200μL 乙醇	23.6	16.0	RNA 污染
					3	溶液 N1 (2.0-3.0 M醋酸钾，PH 4.8)	5.0	5.0
4	溶液 N1 ( 2.0-3.0 M醋酸钾，PH 4.8)+ 200 μL 乙醇	21.5	20
					5	溶液 N1 (2.0-3.0 M醋酸钾，PH 4.3)	1.0	1.0
6	溶液 N1 (2.0-3.0 M醋酸钾，PH 4.3)+ 200μL 乙醇	20.8	21.2

上述表4为使用缓冲溶液N1和20%～30%（V/V）无水乙醇对质粒DNA的分离、纯化结果。用洗脱下来的1μLDNA加1μL的10x上样溶液，8μL的超纯水混合，点样到1%的琼脂糖凝胶中，通过紫外线照射溴化乙锭染色，呈现图片。图4中的泳道1～6分别对应表4中的数据。上述试验结果说明了PH值为4.8的N1溶液与一定量的无水乙醇混合后可以更有效的绑定DNA。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种核酸分离净化溶液，其特征在于：所述溶液主要包括钠盐和/或钾盐、水溶性有机溶剂和水；所述溶液的PH值范围为2.0～5.0；所述钠盐和/或钾盐中的钠离子和/或钾离子的浓度为1.0M～3.0M；所述核酸分离净化溶液与核酸之间进行可逆结合，之后再使用磁珠吸附核酸，最后用洗脱液从磁珠上将核酸洗脱下来，从而对核酸进行分离。

2.根据权利要求1所述的一种核酸分离净化溶液，其特征在于：所述的钠盐为任何形式的钠离子盐，包括醋酸钠、氯化钠、柠檬酸钠及磷酸钠；所述的钾盐为任何形式的钾离子盐，包括醋酸钾、氯化钾、柠檬酸钾及磷酸钾。

3.根据权利要求1所述的一种核酸分离净化溶液，其特征在于：所述的水溶性有机溶剂为乙醇，所述乙醇的浓度为20%～30%。

4.根据权利要求1或2所述的一种核酸分离净化溶液，其特征在于：所述溶液的PH值范围为4.0～4.8；所述钠离子和/或钾离子的浓度为2.0M～2.5M。

5.根据权利要求1所述的一种核酸分离净化溶液，其特征在于：所述的核酸分离净化溶液可用于结合不同的核酸样本，包括质粒DNA、RNA或混合DNA和RNA分子。

6.根据权利要求5所述的一种核酸分离净化溶液，其特征在于：所述核酸样本的来源包括动物或人类的体液、组织、器官、细胞、细胞培养及PCR产品。