CN107267498A - 一种通用型从微量植物材料中提取dna的试剂盒及方法 - Google Patents

一种通用型从微量植物材料中提取dna的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，主要涉及一种通用型从微量植物材料中提取DNA的试剂盒及方法。此试剂盒及方法一次提取的DNA产量完全可以满足直接进行全基因组测序的要求。本试剂盒及方法主要由一种薄型的并可最大限度吸附基因组DNA的硅基质吸附柱及与之配套的独特的可最大限度浸提出各种植物组织并且植物不同部位中的DNA提取缓冲液体系所组成。具有快速、方便、无需酚、氯仿抽提，避免有机溶剂污染等诸多优点，并且因为是薄型吸附柱而能够简便地最大限度的去除DNA提取过程中存在的色素油脂等杂质。对于非常珍贵的植物样本来说，不仅节省了珍贵样本，而且大大节约了全基因组测序前处理的步骤和时间。

Description

一种通用型从微量植物材料中提取DNA的试剂盒及方法
技术领域
本发明专利涉及一种通用型从微量植物材料中提取DNA的试剂盒及方法，此方法可以从常见的植物材料特别是微量的植物材料中提取出大量的基因组DNA以满足珍贵小样本全基因组测序的要求。
背景技术
基因组就是一个物种中所有基因的整体组成，它携带有此物种的遗传物质和遗传信息。要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。全基因组测序，即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列，能检测个体基因组中的全部遗传信息。通过对基因组进行全基因组测序，首先可以获得该物种的基因组序列图谱，可以从基因组水平上对物种的生长、发育、进化、起源等重大问题进行研究，加深我们对物种的认识。其次，在新基因的发现、物种改良等方面发挥巨大作用。在已知基因组的情况下，对物种内的不同个体或某个个体的不同组织进行基因组重测序，可以在全基因组水平上发现不同个体或组织细胞之间的差异。通过这种方法，可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点(SNP)，插入缺失位点(In Del，Insertion Deletion)，结构变异位点(SV，StructureVariation)，拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。这对在群体水平上研究物种的进化历史、环境适应性、自然选择等方面具有重大意义。最后，我们还可以通过全基因组重测序帮助我们快速发现与生物重要性状相关的遗传变异，缩短分子育种的实验周期等。全基因组测序技术已经是现代农业育种有力的研究工具，为新品种选育和品质改良带来了新的科研方法和解决方案，加快了新品种的育种进程，包括对农作物和栽培品种进行全基因组从头测序和深度重测序、遗传差异分析、分子标记开发、遗传连锁分析及表观遗传分析等，具有广阔的测序前端样品处理的应用。但是此技术对DNA样品的要求很高，其要求样品总量和DNA浓度要高，大片段文库的DNA总量大于30μg，浓度大于150ng/μL；其次要求DNA纯度高及很高的完整性。因此，DNA提取的产量和质量就成为全基因组测序技术中至关重要的第一步，基因组DNA的提取方法有很多，传统的方法主要有CTAB法(Doyle andDoyle，1987)和SDS法(蔡朝辉等，2000)。传统的CTAB法和SDS法都是在裂解生物细胞的基础上，多次利用有机溶剂进行抽提，使蛋白质等沉淀于有机试剂中，而核酸保留在水相，从而达到分离核酸的目的。国内外生物公司开发了多种商品化的核酸DNA提取试剂盒，不同的核酸DNA提取试剂盒分离DNA的原理也不同。有的利用核酸的分子量差异分离DNA，有的利用特异性基质与DNA结合从而达到分离DNA的目的，如离子交换柱、磁珠等(孙璐宏等，2010)。但是市场上已有的基因组DNA提取试剂盒不仅需要针对不同的植物种类从而选择不同的提取方法，并且因为提取不同种类的植物的不同基因组DNA的提取量也会有很大分别，同时也缺乏针对珍贵小样本的植物基因组提取方法。通常100mg植物样本DNA提取总量为10～15μg，DNA产出率为0.01～0.15％，往往需要多于一个提取反应才能满足全基因组测序的需求，费时费力。尤其是对于珍贵少量样本而言，因为样本的起始量很低，如果在DNA产出率低的情况下，全基因组提取更是一个亟待解决的难题。因此迫切需要一种简便、高效、经济且通用性较好的适用于全基因组测序的植物基因组DNA提取方法。
发明内容
本发明专利目的之一是提供一种适用于多种植物基因组DNA的提取试剂盒及方法；
本发明专利目的之二是提供一种适用于微量珍贵植物样本的基因组DNA提取方法，DNA的产出比为1.39～4％(DNA产量/材料起始重量)；
本发明专利目的之三是提供一种适用于多种植物不同部位的基因组DNA的提取方法；
本发明专利的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
针对现有的植物基因组DNA提取所存在的各种缺陷，本发明人进行了深入研究，并经过长期，反复多次试验，首先提供了独特的并可最大限度浸提出植物组织中DNA的提取缓冲液体系(即AP1)。我们在现有的植物基因组DNA提取缓冲液(Doyle and Doyle，1987)即2％CTAB，100mMTris-C1(pH8.0)，5mMEDTA-Na2，0.25MNaCl的基础上，首先增加盐离子的浓度，高盐离子浓度会降低多糖类物质的溶解度，这样通过离心就可以去除多糖物质，并且高盐溶液可以增加DNA的析出以及和DNA吸附柱的结合。其次，增加了去除植物中多糖、多酚、色素的复合DNA助溶剂，抗坏血酸及PVP。抗坏血酸属于高效抗氧化剂，在DNA提取过程中可以和单宁类多酚物质结合并去除，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚及多糖物质形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚多糖，减少DNA中糖和酚的污染。三者在其构成及在提取缓冲液(AP1)中的终浓度是1.4M NaCl，2～5％PVP，1～3％抗坏血酸。调整后的植物组织中DNA的提取缓冲液体系(即AP1)能够在去除植物多酚多糖等杂质的基础上最大限度的将植物组织中的基因组DNA浸提出来。
进一步，本发明专利产品提供了一种薄型的并可最大限度吸附基因组DNA的硅基质吸附柱。我们制作的DNA硅基质吸附柱是采用新型的硅基质材料制成薄型DNA吸附柱，在高盐、低pH缓冲系统下可以高效、专一地吸附DNA；在低盐、高pH值缓冲液体系中释放DNA，在几分钟之内即可回收DNA。具有快速、方便、无需酚、氯仿抽提，避免有机溶剂的污染等诸多优点，并且因为是薄型吸附柱而能够简便地最大限度的去除DNA提取过程中存在的色素油脂等杂质。
除此之外，本发明专利产品提供了一种新型的并可最大限度促进基因组DNA与硅基质吸附柱结合的独特缓冲液体系(AP2和AP3)。DNA的硅基质吸附柱需要特殊的与之配套的缓冲液体系，一般的DNA提取缓冲液无法促进硅基质吸附柱与DNA的结合。2010年11月15日农业部发布的1485号《转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化》文件中发表了DNA吸附柱缓冲液体系是至今为止唯一公开的DNA吸附柱缓冲液体系，缓冲液体系配方为：在约600mL水中加入590.8g异硫氰酸胍，充分溶解后，加入50mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，20mL乙二铵四乙酸二钠溶液，1mL曲拉通100，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.4，加水定容至1000mL。经过长期，反复多次试验，我们研制出与之完全不同的独特的高效硅基质柱DNA结合液AP2及AP3。使用较低浓度的盐酸胍代替异硫氰酸胍，盐酸胍的价格是异硫氰酸胍价格的五分之一，并且使用高浓度的醋酸钠促进DNA的聚集以及与硅基质柱的结合，在明显增加DNA结合量的同时大大降低了生产成本。
综上，基于以上技术方案研制出的植物全基因组测序的DNA提取试剂盒，对于起始材料重量一致的叶片等组织提取的基因组总量平均≥20μg，OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.5，较市场上已有的植物基因组DNA提取试剂盒100mg起始样本提取DNA总量为10-15μg的产量高出至少1倍，一次提取完全可以满足直接进行全基因组测序的要求。对于非常珍贵的植物样本来说，所需材料起始量为0.001克(1毫克)也可提取到质量好，产量高的基因组DNA，不仅节省了珍贵样本，而且大大节约了全基因组测序前处理的步骤和时间。
参考文献：
Doyle JJ，Doyle JL(1987).A rapid DNA isolation procrdure for small quantities offresh leaf issue.Phytochem Bull 19，11-15.
李丹，凌定厚(2000).五种提取马尾松基因组DNA方法的比较.植物学通报17，168-173.
蔡朝辉，李萍，董婷霞，詹华强(2000).贝母额分子生物学鉴定方法的研究.药学学报35，309-312.
孙璐宏，鲁周民，张丽(2010).植物基因组DNA提取与纯化研究进展.西北林学院学报25，102-106.
附图说明
图1、使用本公司研发的植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取不同重量大豆叶片的基因组DNA后的琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道1：M代表DNA分子量标准，条带对应的分子量标准分别为15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；
泳道2：0.0001克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道3：0.0005克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道4：0.001克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道5：0.005克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道6：0.01克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道7：0.05克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道8：0.1克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道9：0.5克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道10：1克大豆叶片提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
图2、使用本公司研发的植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取的不同种类植物的基因组DNA产出比图
图3、使用本公司研发的植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取的不同种类植物的基因组DNA后的琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道1：M代表DNA分子量标准，条带对应的分子量标准分别为15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；
泳道2：大麦基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道3：玉米基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道4：水稻(日本腈)基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道5：高粱基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道6：大豆基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道7：番茄基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道8：蒲公英基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道9：野菊花基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道10：绿萝基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道11：唐菖蒲基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道12：松针基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
图4、本公司植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取植物不同组织部位的基因组DNA后的琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道1：M代表DNA分子量标准，条带对应的分子量标准分别为15000bp，8000bp，5000bp，3000bp，2000bp；
泳道2：水稻根部基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道3：水稻茎基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道4：蒲公英花基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道5：番茄果实基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
泳道6：水稻种子基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明专利发明，本发明专利发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本本发明专利发明构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本本发明专利发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均属于本发明专利发明的保护范围内。
1、实验材料：大麦叶片、玉米叶片、水稻叶片(日本腈)、高粱叶片、大豆叶片、番茄叶片、蒲公英叶片、野菊花叶片、绿萝叶片、唐菖蒲叶片、松针、水稻根、水稻茎、蒲公英花、番茄果实、水稻种子
2、实验试剂
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)：美国MP Biomedicals公司
抗坏血酸：美国Amresco公司
PVPP(吡咯烷酮)：美国Amresco公司
DNA分子量标准：宝生物工程(大连)有限公司
西班牙琼脂糖biowest Agarose：北京欣经科生物技术有限责任公司
冰醋酸：国药集团化学试剂北京有限公司
Gelgreen荧光染料：美国Biotium公司
Tris盐：北京欣经科生物技术有限责任公司
盐酸：国药集团化学试剂北京有限公司
氢氧化钠：国药集团化学试剂北京有限公司
盐酸胍：美国Amresco公司
醋酸钠：美国Amresco公司
硅基质膜：杭州莱枫生物科技有限公司
无水乙醇：国药集团化学试剂北京有限公司
EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)：美国MP Biomedicals公司
氯化钠：国药集团化学试剂北京有限公司
3、主要实验仪器：
小型台式高速离心机：美国Sigma公司
NanoQTM微型分光光度计：博奥生物有限公司
凝胶成像系统：美国Biorad公司
水平电泳槽：北京百晶生物技术有限公司
4、主要试剂的配制
AP1缓冲液：2％CTAB，100mMTris-C1(pH8.0)，10～20mMEDTA-Na2，1.4MNaCl，2～5％PVP，1～3％抗坏血酸，调节pH至7.5～8.0，121℃条件下灭菌20分钟。
AP2缓冲液：2.5～4.5M盐酸胍，0.5～1.5M醋酸钠，调节pH至4.5～6.5，121℃条件下灭菌20分钟。
AP3缓冲液：0.5～1.5M醋酸钠，调节pH至4.5～6.5，121℃条件下灭菌20分钟，使用前加无水乙醇至80％的浓度。
AW漂洗液：70～80％无水乙醇。
AE洗脱缓冲液：10mM Tris-C1，5mM EDTA-Na2调节pH至8.5，121℃条件下灭菌20分钟。
实施例1植物全基因组测序的DNA提取试剂盒对不同重量的植物材料的提取结果
1、实验方法
分别取0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1克重量的新鲜的大豆叶片组织，其中0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1克重量的叶片组织加入600μL AP1缓冲液和6μL RNaseA(10mg/mL)，在打磨管中进行机器打磨样品；0.5、1克的叶片样品在研钵中加入液氮充分研磨成细粉并转移细粉到1.5mL离心管中，加入600μL AP1缓冲液和6μL RNaseA(10mg/mL)，65℃放置10分钟，在放置过程中颠倒离心管2～3次，混合样品；
加入200μL AP2缓冲液，充分混匀，13,000rpm离心5分钟，小心将上清吸取至一个新的1.5mL离心管中；
加入上清量1.5倍体积的AP3缓冲液，立即充分吹打混匀，如果此时会出现絮状沉淀，不会影响DNA提取；
将上一步所得混合物(溶液和可能出现的絮状沉淀)都加入一个吸附柱DB(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，吸附柱DB放入收集管中；
向吸附柱DB中加入700μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱DB放入收集管中；
向吸附柱DB中加入500μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱DB放入收集管中；
将吸附柱DB放入收集管中，13,000rpm离心2分钟，倒掉废液，此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；
将吸附住DB转入一个干净的离心管中，打开管盖并于室温放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；
向吸附柱的膜中央部位滴加100μL加热至56℃的AE洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；
DNA提取完成后取1μL使用NanoQTM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定DNA浓度及纯度；
配制0.8％的琼脂糖凝胶，上样量1μL进行电泳，电压100V检测DNA。
2、实验结果
通过实施例1中所述的方法一次性提取了不同重量的大豆叶片材料的全基因组DNA并测定了DNA浓度和纯度以及采用琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的完整性。DNA凝胶电泳检测实验结果显示，DNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图1)。使用NanoQTM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定DNA纯度及浓度结果显示，代表DNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.5，均达到全基因组测序的DNA纯度要求。代表DNA浓度的数据显示结果为，浓度初始量为非常少的0.0001克的叶片材料中也能提取到总量为195ng的DNA(表1)。结果还显示样品重量在0.0001克至0.05克范围内，随着样品材料的增加，一次提取所得到的DNA产量呈递增趋势DNA的提取总量范围在195ng～24μg，可以满足全基因组测序的需求。一次性提取DNA产出比最高的叶片材料使用量为5毫克(表2，图2)。呈现微量样品的提取效率高于大量样品提取效率的现象，因此对于微量珍贵样本来说，本试剂盒更具有提取优势。
表1、本公司植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取不同重量的大豆新鲜叶片DNA后的浓度检测表；
样本种类 重量(g) 230ABS 260ABS 280ABS 260/280 260/230 浓度(ng/μL)
1 大豆叶片 0.0001 0.064 0.0390 0.0267 1.458 0.6098 1.953
2 大豆叶片 0.0005 0.07887 0.12637 0.07044 1.7940 1.60224 6.3185
3 大豆叶片 0.001 0.30318 0.41744 0.22681 1.8405 1.37687 20.871
4 大豆叶片 0.005 1.48697 2.79295 1.45613 1.9180 1.87828 139.64
5 大豆叶片 0.01 2.30188 4.82735 2.47632 1.9494 2.09713 241.36
6 大豆叶片 0.05 1.44131 2.34212 1.17442 1.9942 1.62499 117.10
7 大豆叶片 0.1 1.1685 1.68763 0.91669 1.8410 1.44427 84.381
8 大豆叶片 0.5 2.48034 2.13648 1.2489 1.7106 0.86136 106.82
9 大豆叶片 1 2.80592 1.10448 0.84082 1.3135 0.39362 55.223
表2、本公司植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取不同重量的大豆叶片DNA的产出比；
样本种类 样品重量(克) Con(ng/μL) 提取总量(ng) 产出比(DNA产量/材料重量)％
1 大豆叶片 0.0001 1.95305 195 0.195
2 大豆叶片 0.0005 6.3185 631 0.1262
3 大豆叶片 0.001 20.8719 2087 1.04
4 大豆叶片 0.005 139.6477 13964 1.3964
5 大豆叶片 0.01 241.3676 24136 1.2068
6 大豆叶片 0.05 117.1058 11310 0.1171
7 大豆叶片 0.1 84.38171 8438 0.008438
8 大豆叶片 0.5 106.8238 10682 0.0021364
9 大豆叶片 1g 55.22395 5522 0.0005522
实施例2植物全基因组测序的DNA提取试剂盒对不同种类的植物材料的提取结果
1、实验方法
取大麦叶片、玉米叶片、水稻叶片(日本腈)、高粱叶片、大豆叶片、番茄叶片、蒲公英叶片、野菊花叶片、绿萝叶片、唐菖蒲叶片、松针各5毫克，加入600μL AP1缓冲液和6μL RNaseA(10mg/mL)后使用打样机破碎样品，65℃放置10分钟，在放置过程中颠倒离心管2～3次混合样品；
加入200μL AP2缓冲液，充分混匀，13,000rpm离心5～10分钟，小心将上清吸取至一个新的1.5mL离心管中；
加入上清量1.5倍体积的AP3缓冲液，立即充分吹打混匀，如果此时会出现絮状沉淀，不会影响DNA提取；
将上一步所得混合物(溶液和可能出现的絮状沉淀)都加入一个吸附柱DB(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，吸附柱DB放入收集管中；
向吸附柱DB中加入700μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱DB放入收集管中；
向吸附柱DB中加入500μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱DB放入收集管中；
将吸附柱DB放入收集管中，13,000rpm离心2分钟，倒掉废液，此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；
将吸附住DB转入一个干净的离心管中，打开管盖并于室温放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；
向吸附柱的膜中央部位滴加100μL加热至56℃的AE洗脱缓冲液，放置2分钟，13,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；
DNA提取完成后取样品1μL使用NanoQTM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定DNA浓度及纯度。
配制0.8％的琼脂糖凝胶，上样量1μL进行电泳，电压100V检测DNA。
2、实验结果
通过实施例2中所述的方法一次性提取了大麦叶片、玉米叶片、水稻叶片(日本腈)、高粱叶片、大豆叶片、番茄叶片、蒲公英叶片、野菊花叶片、绿萝叶片、唐菖蒲叶片、松针的全基因组DNA并采用琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的完整性及测定了DNA浓度和纯度。DNA凝胶电泳检测实验结果显示，所有材料提取的DNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图3)。使用NanoQTM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定所提取到的DNA浓度及纯度，代表DNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.5，均达到全基因组测序的DNA纯度要求。代表DNA浓度的数据显示结果为，5毫克所有材料所提取的DNA总量分布范围在10～45μg(表3)，这个结果表示出本试剂盒适用于多种植物种类的DNA提取，不同种类的植物材料所提取的DNA总量存在差别，但是所提取的DNA产量和质量均可以满足全基因组测序的要求。
表3、本公司植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取不同植物叶片的DNA后浓度检测表；
实施例3植物全基因组测序的DNA提取试剂盒对植物材料的不同部位的提取结果
1、实验方法
取植物的根、茎、花、果实、种子不同部位各5毫克，加入600μL AP1缓冲液和6μL RNaseA(10mg/mL)后使用打样机破碎样品，65℃放置10分钟，在放置过程中颠倒离心管2～3次，混合样品；
加入200μL AP2缓冲液，充分混匀，13,000rpm离心5～10分钟，小心将上清吸取至一个新的1.5mL离心管中；
加入上清量1.5倍体积的AP3缓冲液，立即充分吹打混匀，如果此时会出现絮状沉淀，不会影响DNA提取；
将上一步所得混合物(溶液和可能出现的絮状沉淀)都加入一个吸附柱DB(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，吸附柱DB放入收集管中；
向吸附柱DB中加入700μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱DB放入收集管中；
向吸附柱DB中加入500μL AW漂洗液，12,000rpm离心30秒钟，倒掉废液，将吸附柱DB放入收集管中；
将吸附柱DB放入收集管中，13,000rpm离心2分钟，倒掉废液，此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验；
将吸附住DB转入一个干净的离心管中，打开管盖并于室温放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；
向吸附柱的膜中央部位滴加100μL加热至56℃的AE洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；
DNA提取完成后将样品稀释5倍后使用NanoQTM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定DNA浓度及纯度。
配制0.8％的琼脂糖凝胶，上样量1μL进行电泳，电压100V检测DNA。
2、实验结果
通过实施例3中所述的方法一次性提取了水稻根、水稻茎、蒲公英花、番茄果实、水稻种子的全基因组DNA并采用琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的完整性及测定了DNA浓度和纯度。DNA凝胶电泳检测实验结果显示，所有材料提取的DNA完整性良好，纯度高，无杂质影响(图4)。使用NanoQTM微型分光光度计(博奥生物有限公司)测定所提取到的DNA浓度及纯度，代表DNA纯度的数据显示结果为OD260/OD280＝1.8～2.0，OD260/OD230＞1.5，均达到全基因组测序的DNA纯度要求。代表DNA浓度的数据显示结果为，不同植物的组织材料5毫克所提取的DNA总量分布范围在10～44μg(表4)，这个结果表示出本试剂盒适用于植物材料的不同部位的DNA提取，植物材料不同部位所提取的DNA总量存在差别，但是所提取的DNA产量和质量均可以满足全基因组测序的要求。
表4、本公司植物全基因组测序的DNA提取试剂盒提取植物不同组织部位DNA后的浓度检测表；

Claims (10)

1.一种通用型从微量植物材料中提取DNA的试剂盒及方法。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法适合于从各种普通植物及多糖多酚植物材料的中提取基因组DNA。
3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法适合于从各种珍贵少量植物材料中提取基因组DNA。
4.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的通用型微量植物材料基因组DNA提取试剂盒及方法也适合于各种普通植物的不同组织部位的基因组DNA提取。
5.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法中涉及到的提取试剂盒由提取缓冲液(AP1)，硅基质柱结合液(AP2，AP3)，杂质去除液(APW)，DNA洗脱液(APE)，DNA吸附柱7个部分组成。
6.按照权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法中提取缓冲液(AP1)组成成分及浓度分别为：2％CTAB，100mMTris-Cl(pH8.0)，20mM EDTA-Na2，0.5～1.5M NaCl，2～5％PVP，1～3％抗坏血酸。
7.按照权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法中硅基质柱结合液(AP2)，组成成分及浓度分别为：2.5～4.5M盐酸胍，0.5～1.5M醋酸钠。
8.按照权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法中硅基质柱结合液(AP3)组成成分及浓度分别为：40～60％无水乙醇，0.5～1.5M醋酸钠。
9.按照权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法中杂质去除液(APW)组成成分及浓度分别为：70～80％无水乙醇。
10.按照权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒及方法中DNA洗脱液(APE)组成成分及浓度分别为：10mM Tris-Cl，5mM EDTA-Na2(pH8.5)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136220A (zh) * 2018-10-17 2019-01-04 上海应用技术大学 一种壳斗科植物样品dna提取和纯化方法
CN109576264A (zh) * 2019-01-04 2019-04-05 仲恺农业工程学院 基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总dna的试剂盒及其提取方法
CN114410621A (zh) * 2021-12-31 2022-04-29 吉林大学第一医院 一种简便快速的高通量基因组裸dna提取方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101367874A (zh) * 2003-03-28 2009-02-18 森托科尔公司 抗淀粉状蛋白抗体、组合物、方法和用途
CN103756994A (zh) * 2013-03-21 2014-04-30 四川农业大学 一种适合富含多糖类植物的干燥叶片dna提取方法
WO2015038892A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
CN104630208A (zh) * 2015-02-11 2015-05-20 杭州百迈生物技术有限公司 提取基因组dna的试剂盒和提取方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101367874A (zh) * 2003-03-28 2009-02-18 森托科尔公司 抗淀粉状蛋白抗体、组合物、方法和用途
CN103756994A (zh) * 2013-03-21 2014-04-30 四川农业大学 一种适合富含多糖类植物的干燥叶片dna提取方法
WO2015038892A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
CN104630208A (zh) * 2015-02-11 2015-05-20 杭州百迈生物技术有限公司 提取基因组dna的试剂盒和提取方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136220A (zh) * 2018-10-17 2019-01-04 上海应用技术大学 一种壳斗科植物样品dna提取和纯化方法
CN109576264A (zh) * 2019-01-04 2019-04-05 仲恺农业工程学院 基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总dna的试剂盒及其提取方法
CN109576264B (zh) * 2019-01-04 2021-11-30 仲恺农业工程学院 基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总dna的试剂盒及其提取方法
CN114410621A (zh) * 2021-12-31 2022-04-29 吉林大学第一医院 一种简便快速的高通量基因组裸dna提取方法

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