CN104805073A - 一种用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病毒基因组核酸提取试剂盒及其使用方法。该发明的特征在于试剂盒包括蛋白酶K、硅基修饰磁珠、提取缓冲液、漂洗液I、漂洗液II及无RNA酶水等，并配套含有磁力架。本发明病毒基因组核酸提取试剂盒使用方法的特征在于采用在提取缓冲液中加入蛋白酶K和硅基修饰磁珠一次性消化液裂解细胞并吸附裂解释放出来的病毒核酸，同时提取缓冲液中含有硫氰酸胍在pH值为5.5时使得硅基修饰磁珠更大量吸附核酸，每1克硅基修饰磁珠吸附核酸达到10mg以上；同时还含有十六烷基三甲基溴化铵去除蛋白、多糖、酚类等杂质，聚乙烯吡咯烷酮K25去除溶液中色素；磁力架上吸附硅基修饰磁珠进一步纯化获得高浓度基因组核酸。本发明试剂盒提取病毒基因组核酸时，不用事先对来源标本进行单独消化裂解、洗涤和再萃取的过程，为临床检测节约时间，也大大减少了成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种从临床标本中提取病毒基因组核酸试剂盒及其利用本发明试剂盒从临床标本中提取病毒基因组核酸的方法。本发明试剂盒可用于血浆、血清、淋巴液、脱落细胞、唾液、尿液、粪便和培养细胞上清液等，高效率提取获得病毒基因组核酸，可用于PCR扩增、筛查突变、基因分型、基因测序和样本储存等科研或临床诊断分析。
背景技术
完整的病毒颗粒包括外壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA，每种病毒颗粒中只含有一种核酸，或为DNA或为RNA。病毒必须借助宿主细胞，利用宿主的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒而繁殖。
研究发现大多数逆转录病毒有一特殊的致癌基因，可使细胞发生恶性转化。如大约70％的宫颈癌病例与HPV-16和HPV-18这两种病毒有关；Epstein-Barr(EB)病毒与鼻咽癌、幽门螺杆菌与胃癌、乙型和丙肝肝炎病毒与肝癌、人类嗜T淋巴细胞病毒1型与白血病以及艾滋病病毒与卡波西肉瘤等均有着十分密切的关系。病毒基因组核酸编码了所有的病毒生命信息，从基因水平分析可以早发现、早诊断病毒的发生，为临床早治疗提供保证，防止癌症的发生。因而，获取病毒基因组核酸是科研和临床检测的关键，高效率提取病毒基因组核酸就尤为重要了。
目前临床常用的病毒基因组核酸提取方法有酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性；玻璃颗粒吸附法对DNA提取效果较好，但对RNA吸附能力一般，无法满足提RNA病毒的要求。
目前市场常用的病毒基因组核酸提取试剂盒产品分别是针对DNA和RNA提取的，很少将DNA和RNA同时提取进行下一步科研或临床检测需要。病毒基因组核酸采用磁珠或硅基磁珠法利用特异性吸附DNA和RNA能力，通过漂洗取出蛋白质和其他杂质，后用低盐溶液洗脱得到基因组DNA，操作中未用到酚、氯仿等有机溶剂以及强碱，但用磁珠或硅基磁珠对DNA和RNA吸附能力不足，获取的DNA和RNA浓度不高。
本发明利用能快速提取病毒基因组核酸的硅基磁珠法，不使用有机溶剂或强碱的同时，还能快速获取高浓度的DNA和RNA，以备下一步科研或临床检测足够使用。
发明内容
本发明提供一种从临床标本高效地提取病毒基因组核酸的试剂盒及其从提取病毒基因组核酸的方法，血浆、血清、淋巴液、脱落细胞、唾液、尿液、粪便和培养细胞上清液等，提取得到高浓度的病毒基因组核酸可用于科研或临床检测之用。
本发明是发明人多年来对上万例临床标本的提取病毒基因组核酸工作经验和技术改进，发现在含有硫氰酸胍在pH值为5.5时使得硅基修饰磁珠发挥更大吸附核酸能力，每1克硅基修饰磁珠吸附核酸达到10mg以上，包括DNA和RNA；另外还发现十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide，CTAB)是一种阳离子去污剂，具在高离子强度的溶液中(＞0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，可以去除标本中绝大数的蛋白、多糖、酚类等杂质；以及加入聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)K25能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少核酸中酚的污染，去除溶液中色素，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
本发明在一个提取缓冲液1中一次性完成对标本的细胞裂解和DNA释放；蛋白、糖类和酚类等杂质的去除；硅基修饰磁珠吸附核酸等一系列过程。同时本发明采用磁力架配合硅基修饰磁珠使用，在临床检测中可以建立一个核酸提取平台，只需在磁力架上吸附磁珠并用乙醇洗涤以及无RNA酶水洗脱，即可获得高浓度病毒基因组核酸。因而，建立起的这一平台，将方便快捷的获取临床标本中核酸，以便进一步PCR扩增或基因检测。
本发明所提供的一种用于提取病毒基因组核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由蛋白酶K、硅基修饰磁珠、提取缓冲液、漂洗液I、漂洗液II及无RNA酶水组成，并配套含有磁力架；其中，优选，所述提取缓冲液由硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮K25、Tris-HCl、EDTA以及NaCl组成；优选，所述提取病毒基因组核酸，经超微量分光光度计检测，其A260/A280比值大于1.8；A260/A230的比值大于2.0；超微量分光光度计检测50μl脱落细胞液提取的核酸效率达到50μg/ml以上。
本发明所提供的一种病毒基因组核酸提取试剂盒，优选各组成分别为：
1)蛋白酶K：为10-100mg/ml蛋白酶K，1ml/支；
2)硅基修饰微球G：1-100mg/ml，1μm硅基修饰微球，1ml/支；
3)提取缓冲液1(1-20M硫氰酸胍，1-5％％十六烷基三甲基溴化铵(质量体积比)，0.5-5％聚乙烯吡咯烷酮K25(质量体积比)，100mM Tris-HCl(pH5.5)，25mM EDTA(pH5.5)，2.0M NaCl)，20ml/瓶；
4)漂洗液I：70％乙醇，30ml/瓶；
5)漂洗液II：96％乙醇，60ml/瓶；
6)RNase-Free去离子H2O：电阻率大于18MΩ*cm，10ml/瓶。
上述病毒基因组核酸提取试剂盒并配置1个磁力架，可用于样本的50次病毒基因组核酸提取，并可组成100次、200次和500次等病毒基因组核酸提取试剂盒，含使用说明书一份，试剂盒保存在4℃冰箱，有限期为1年。
所述病毒基因组核酸提取试剂盒中提取缓冲液1，优选地为含有1-20M硫氰酸胍，更优选地含有4M硫氰酸胍。
所述病毒基因组核酸提取试剂盒中提取缓冲液1，优选地为含有2％十六烷基三甲基溴化铵和2％聚乙烯吡咯烷酮K25。
本发明所提供的病毒提取基因组核酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取1个1.5ml无核酸酶的离心管，加入20μl蛋白酶K和15μl磁珠悬浮液G，再加入300μl提取缓冲液1。
2)加入200μl血浆/血清/淋巴液/脱落细胞上清，用移液器吹吸或涡旋振荡混匀；56℃孵育10min，期间每3min用移液器吹吸或上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。
3)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液I，涡旋混匀1min。
4)将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液II，涡旋混匀1min。将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
5)重复步骤3、4，液体尽量去除干净；离心管于磁力架上，室温晾干5-10min。将离心管从磁力架上取下，加入50μl RNase-free ddH2O，涡旋混匀；
6)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于-20℃保存备用。
本发明提供的用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法不限于人类标本，还可以用于哺乳动物、禽类、两栖类动物等；需要的标本量非常低，均可提取得到高浓度的基因组核酸。优选地，本发明提供的用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法还可以用于脱落细胞，包括鼻咽部、口腔、食管、胃粘膜、阴道、胸膜腔、腹膜腔、心包腔积液和脑脊髓膜腔积液等脱落细胞。
通过本发明所述的试剂盒及其方法得到的高浓度基因组核酸，其特征在于经过超微量分光光度计检测A260/A280比值大于1.8，表明无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值大于2.0，表明无碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染；超微量分光光度计检测50ul口腔脱落细胞液提取的核酸效率可达到50μg/ml以上；满足所有基因研究和临床检测的样品要求。
与其它方法相比，本发明的技术优势主要表现在：
1.不用对临床标本进行预处理，直接使用标本加入到提取缓冲液1中进行基因组核酸提取，特别是使用来源于机体的脱落细胞，完成可以直接处理。
2.利用提取缓冲液1中硫氰酸胍在pH值为5.5时可使得硅基修饰磁珠发挥更大吸附核酸能力，尽可能更多地吸附标本中释放出来的核酸，获得高浓度的核酸溶液。
3.利用提取缓冲液1中CTAB在高离子强度的溶液中去除标本中绝大数的蛋白、多糖、酚类等杂质；以及PVP K25去除溶液中色素以及多糖，最大限度减少杂质的污染。
4.本发明磁力架配合硅基修饰磁珠使用，可在临床检测建立一个核酸提取平台，能方便快捷的提取临床标本中DNA和RNA。
本发明提供的病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法用于科研或临床诊断用的PCR扩增、筛查突变、基因分型、基因测序和样本储存等分析。
附图说明
图1表示本发明所述的试剂盒及其方法提取实施例二中HBV基因组核酸琼脂糖凝胶电泳检测图。
图2表示本发明所述的试剂盒及其方法提取实施例三中HPV基因组核酸琼脂糖凝胶电泳检测图。
图3表示显示本发明所述的试剂盒及其方法提取的HPV病毒基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明通过发明人多年科研经验研发的提取缓冲液1，其中100mMTris-HCl和25mM EDTA构成pH值5.5条件下1-20M硫氰酸胍，使得硅基修饰磁珠发挥更大吸附核酸能力，每1克硅基修饰磁珠吸附核酸达到10mg以上，包括DNA和RNA；2mol/L NaCl构成的高离子强度的溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，可以去除标本中绝大数的蛋白、多糖、酚类等杂质；以及加入PVP K25能效去除多酚和色素，同时它也能有效去除多糖。
本发明采用不需要通过有机溶剂进行抽提，在磁力架上吸附磁珠，应用乙醇的洗涤液进行洗涤和无RNase去离子水的洗脱液进行洗脱，将获得高浓度的基因组核酸。因而，在此基础上研发可高效从病毒提取高浓度的基因组核酸的试剂盒及其方法。
本发明所提供的一种病毒基因组核酸提取试剂盒，其特征在于各组成分别为：
1)蛋白酶K：为10-100mg/ml蛋白酶K，1ml/支；
2)硅基修饰微球G：1-100mg/ml，1μm硅基修饰微球，1ml/支；
3)提取缓冲液1(1-20M硫氰酸胍，2％十六烷基三甲基溴化铵(质量体积比)，2％聚乙烯吡咯烷酮K25(质量体积比)，100mM Tris-HCl(pH5.5)，25mMEDTA(pH5.5)，2.0M NaCl)，20ml/瓶；
4)漂洗液I：70％乙醇，30ml/瓶；
5)漂洗液II：96％乙醇，60ml/瓶；
6)RNase-Free去离子H2O：电阻率大于18MΩ*cm，10ml/瓶。
本发明所提供的病毒基因组核酸提取试剂盒的各组成制备方法如下：
1)蛋白酶K，取100mg蛋白酶K干粉，加入1-10ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，制备成10-100mg/ml浓度，分装到1ml无菌塑料管中，每管1ml，存放于-20℃冰箱中备用；
2)硅基修饰微球G，取100mg/ml硅基修饰微球G原液1ml，加入1×PBS(pH＝7.4)稀释，颠倒混匀，制备成1-100mg/ml浓度，分装到1ml无菌塑料管中，每管1ml，存放于4℃冰箱中备用；
3)提取缓冲液1：60.55g Tris碱溶于400ml ddH2O中，用HCl调pH值5.5(浓HCl约加3.5ml)，用ddH2O定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成1mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；
186.10g EDTA-Na盐磁力搅拌溶于400ml ddH2O中，用NaOH调pH值5.5(NaOH颗粒约加入15g)，用ddH2O定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成1mol/L EDTA(pH值8.0)；
292.2g NaCl溶于400ml ddH2O中，定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成10mol/L NaCl；
分别取1mol/L Tris-HCl(pH值5.5)5ml、1mol/L EDTA(pH值5.5)12.5ml、0.2mol/L NaCl 100ml、59g-1180g硫氰酸胍、10g十六烷基三甲基溴化铵和10g聚乙烯吡咯烷酮K25，用灭菌的ddH2O定容至500ml，配制成提取缓冲液1；分装到20ml无菌塑料瓶中，每瓶20ml，
4)漂洗液I：取700ml分析纯无水乙醇至1000ml无菌玻璃瓶中，加300ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，配制成70％乙醇漂洗液I，分装至50ml无菌塑料瓶中，每瓶30ml；
5)漂洗液II：取960ml分析纯无水乙醇至1000ml无菌玻璃瓶中，加40ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，配制成96％乙醇漂洗液II，分装至100ml无菌塑料瓶中，每瓶60ml；
6)去离子超纯水(ddH2O)，电阻率大于18MΩ*cm，每600mL水中加入600uL焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate，DEPC)，配成DEPC水，摇床过夜。次日，用经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟处理；分装至10ml无菌塑料瓶中，每瓶10ml；
上述病毒基因组核酸提取试剂盒并配置1个磁力架，可用于样本的50次病毒基因组核酸提取，并可组成100次、200次和500次等病毒基因组核酸提取试剂盒，含使用说明书一份，试剂盒保存在4℃冰箱，有限期1年。
所述病毒基因组核酸提取试剂盒中提取缓冲液1，优选地为含有1-20M硫氰酸胍，更优选地含有4M硫氰酸胍。
所述病毒基因组核酸提取试剂盒中提取缓冲液1，优选地为含有2％十六烷基三甲基溴化铵和2％聚乙烯吡咯烷酮K25。
本发明所提供的病毒提取基因组核酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取1个1.5ml无核酸酶的离心管，加入20μl蛋白酶K和15μl磁珠悬浮液G(使用前用移液器吹吸或涡旋振荡混匀磁珠)，再加入300μl提取缓冲液1。
2)加入200μl血浆/血清/淋巴液/脱落细胞上清(样品需平衡至室温)，用移液器吹吸或涡旋振荡混匀；56℃孵育10min，期间每3min用移液器吹吸或上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。
3)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液I，涡旋混匀1min。
4)将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液II，涡旋混匀1min。将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
5)重复步骤3、4，液体尽量去除干净；离心管于磁力架上，室温晾干5-10min。将离心管从磁力架上取下，加入50μl RNase-free ddH2O，涡旋混匀；
6)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于-20℃保存备用。
本发明提供的用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法不限于人类标本，还可以用于哺乳动物、禽类、两栖类动物等；需要的标本量非常低，均可提取得到高浓度的基因组核酸。优选地，本发明提供的用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法还可以用于脱落细胞，包括鼻咽部、口腔、食管、胃粘膜、阴道、胸膜腔、腹膜腔、心包腔积液和脑脊髓膜腔积液等脱落细胞。
通过本发明所述的试剂盒及其方法得到的高浓度gDNA，其特征在于通过如下质量控制：
提取的基因组核酸提取效果用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，染料为溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)替代物，在制胶的时候加入凝胶中。分别取3μl核酸提取样品，加入2μl上样缓冲液混合点样，并点样5μl DNA分子标准品(marker)，电泳条件为120V电压，电泳20min，电泳结果用凝胶成像系统(蓝盾-621)观察拍照，经过琼脂糖凝胶电泳检测为RNA单一条带和DNA两条带(超螺旋和线性结构)。
取2μl基因组核酸提取样品，以无菌去离子水为空白，用超微量分光光度计(Spectrophotometer：NanoDrop 2000)测定波长为230nm、260nm和280nm的吸光度值，即A230、A260和A280。
利用纯基因组核酸的A260/A280和A260/A230比值，评估提取DNA的纯度。本发明的试剂盒及其方法提取得到的基因组核酸经超微量分光光度计检测，A260/A280比值均大于1.8，表明无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值均大于2.0，表明无碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染；
按照基因组核酸的换算公式：核酸含量(μg/mL全血)＝A260×50μg/ml×10(稀释倍数)×50(50μl核酸溶液)/200(用于核酸提取的标本量为200μl)，计算提取的DNA含量，超微量分光光度计检测200μl标本量提取的核酸效率可达到50μg/ml以上；满足所有基因研究和检测的样品要求。
质检合格的基因组核酸将浓度调整到50ng/ml，-20℃储存备用。
本发明提供的病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法用于科研或临床诊断，提取得到的高浓度和数量基因组核酸可完全解链和高效地进行PCR扩增，满足PCR扩增、筛查突变、基因分型、基因测序和样本储存等科研或临床诊断分析。
以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
实施例一病毒基因组核酸提取试剂盒
试剂盒各组份如下：
1)蛋白酶K，取100mg蛋白酶K干粉，加入5ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，制备成20mg/ml浓度，分装到1ml无菌塑料管中，每管1ml，存放于-20℃冰箱中备用；
2)硅基修饰微球G，取100mg/ml硅基修饰微球G原液1ml，加入9ml 1×PBS(pH＝7.4)稀释，颠倒混匀，制备成10mg/ml浓度，分装到1ml无菌塑料管中，每管1ml，存放于4℃冰箱中备用；
3)提取缓冲液1：60.55g Tris碱溶于400ml ddH2O中，用HCl调pH值5.5(浓HCl约加3.5ml)，用ddH2O定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成1mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；
186.10g EDTA-Na盐磁力搅拌溶于400ml ddH2O中，用NaOH调pH值5.5(NaOH颗粒约加入15g)，用ddH2O定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成1mol/L EDTA(pH值8.0)；
292.2g NaCl溶于400ml ddH2O中，定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成10mol/L NaCl；
分别取1mol/L Tris-HCl(pH值5.5)5ml、1mol/L EDTA(pH值5.5)12.5ml、0.2mol/L NaCl 100ml、236g硫氰酸胍、10g十六烷基三甲基溴化铵和10g聚乙烯吡咯烷酮K25，用灭菌的ddH2O定容至500ml，配制成提取缓冲液1；分装到20ml无菌塑料瓶中，每瓶20ml，
4)漂洗液I：取700ml分析纯无水乙醇至1000ml无菌玻璃瓶中，加300ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，配制成70％乙醇漂洗液I，分装至50ml无菌塑料瓶中，每瓶30ml；
5)漂洗液II：取960ml分析纯无水乙醇至1000ml无菌玻璃瓶中，加40ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，配制成96％乙醇漂洗液II，分装至100ml无菌塑料瓶中，每瓶60ml；
6)去离子超纯水(ddH2O)，电阻率大于18MΩ*cm，每600mL水中加入600uL焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate，DEPC)，配成DEPC水，摇床过夜。次日，用经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟处理；分装至10ml无菌塑料瓶中，每瓶10ml；
上述病毒基因组核酸提取试剂盒并配置1个磁力架，可用于样本的50次病毒基因组核酸提取，并可组成100次、200次和500次等病毒基因组核酸提取试剂盒，含使用说明书一份，试剂盒保存在4℃冰箱，有限期为1年。
实施例二使用本发明试剂盒提取血浆中乙肝病毒基因组核酸
采集10位临床乙肝病毒携带者和5位正常人5ml EDTA抗凝血(与合作单位科研合作项目，经医院伦理委员会同意，并与志愿者签署知情同意书)。
1)先取1个1.5ml无核酸酶的离心管，加入20μl蛋白酶K和15μl磁珠悬浮液G(使用前用移液器吹吸或涡旋振荡混匀磁珠)，再加入300μl提取缓冲液1。
2)将从冰箱取出的200μl血浆样品，室温平衡30min，加入到上述1.5ml离心管中，用移液器吹吸或涡旋振荡混匀；56℃孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。
3)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液I，涡旋混匀1min。
4)将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液II，涡旋混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
5)重复步骤3、4，液体尽量去除干净；离心管于磁力架上，放置在超净台中室温晾干10min；然后将离心管从磁力架上取下，加入50μl RNase-freeddH2O，涡旋混匀；
6)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于-20℃保存备用。
提取的基因组核酸提取效果用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，染料为溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)替代物，在制胶的时候加入凝胶中。分别取3μl核酸提取样品，加入2μl上样缓冲液混合点样，并点样5μl DNA分子标准品(marker)，电泳条件为120V电压，电泳20min，电泳结果用凝胶成像系统(蓝盾-621)观察拍照，图1显示琼脂糖凝胶电泳检测提取的HBV基因组DNA，电泳图显示为单一条带。
实施例三使用本发明试剂盒提取HPV患者阴道脱落细胞中病毒基因组
核酸
用无菌棉拭子取10位HPV临床患者阴道脱落细胞(经医院伦理委员会同意，并与志愿者签署知情同意书)，4℃冰箱放置保存。提取HPV基因组核酸步骤按照实施例二中步骤1-6完成，提取的基因组核酸经0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，图2显示琼脂糖凝胶电泳检测提取的HPV基因组DNA，DNA电泳图均为单一条带，无拖尾和杂带。
实施例四提取的病毒基因组核酸定量和纯度检测
取实施例二和三中提取的病毒基因组核酸2μl样品，以无菌去离子水为空白，用超微量分光光度计(Spectrophotometer：NanoDrop 2000)测定波长为230nm、260nm和280nm的吸光度值，即A230、A260和A280，按照NanoDrop2000仪器使用说明书进行测定。利用纯核酸的A260/A280和A260/A230比值，评估提取核酸的浓度，以及按照核酸的换算公式：DNA含量(μg/mL标本)＝A260×50μg/ml×10(稀释倍数)×50(50μl DNA溶液)/200(用于核酸提取的标本量为200μl)，计算提取的核酸含量，本发明的试剂盒及其方法提取得到的核酸纯度和含量测定见表一。
表一：
| 样本 | 标本体积 | 260/280 | 260/230 | gDNA总量(ug) |
| HBV患者1 | 200μl | 3.24 | 2.26 | 62.7 |
| HBV患者2 | 200μl | 3.01 | 2.01 | 51.7 |
| HBV患者3 | 200μl | 3.48 | 2.06 | 58.9 |
| HBV患者4 | 200μl | 2.74 | 2.72 | 62.7 |
| HBV患者5 | 200μl | 3.18 | 2.77 | 53.2 |
| HBV患者6 | 200μl | 3.19 | 2.83 | 58.3 |
| HBV患者7 | 200μl | 2.27 | 2.72 | 91.2 |
| HBV患者8 | 200μl | 3.21 | 3.25 | 59.7 |
| HBV患者9 | 200μl | 2.98 | 3.01 | 66.1 |
| HBV患者10 | 200μl | 3.10 | 3.28 | 100.4 |
| 正常1 | 200μl | 3.10 | 3.34 | 84.3 |
| 正常2 | 200μl | 3.07 | 3.23 | 76.7 |
| 正常3 | 200μl | 2.41 | 2.22 | 112.3 |
| 正常4 | 200μl | 2.90 | 2.12 | 99.2 |
| 正常5 | 200μl | 3.31 | 2.21 | 58.6 |
| HPV患者1 | 200μl | 2.64 | 2.23 | 69.4 |
| HPV患者2 | 200μl | 2.66 | 2.45 | 79.5 |
| HPV患者3 | 200μl | 3.22 | 2.35 | 89.4 |
| HPV患者4 | 200μl | 2.64 | 2.19 | 79.5 |
| HPV患者5 | 200μl | 3.21 | 2.35 | 90.3 |
| HPV患者6 | 200μl | 2.45 | 2.53 | 77.5 |
| HPV患者7 | 200μl | 2.76 | 2.44 | 69.9 |
| HPV患者8 | 200μl | 3.21 | 3.09 | 104.3 |
| HPV患者9 | 200μl | 3.38 | 2.36 | 142.4 |
| HPV患者10 | 200μl | 2.68 | 2.63 | 74.3 |
表一结果说明本发明的试剂盒及其方法提取得到的核酸经超微量分光光度计检测，A260/A280比值均大于1.8，表明无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值均大于2.0，表明无碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染；超微量分光光度计检测200μl标本量提取的核酸效率可达到50μg/ml以上；满足所有基因研究和临床检测的样品要求。
实施例五提取的HPV病毒基因组DNA PCR扩增验证
提取的HPV病毒基因组DNA进行PCR反应扩增，体系总体积25μl，其中10×缓冲液2.5μl；5U/μl Taq DNA Polymerase 0.25μl；2.5mM dNTPs 0.2μl；DEPC ddH2O；通用正、反引物均为0.5μmol/L；基因组DNA 10ng。PCR反应采用两步法45个循环扩增，预变性95℃3min；95℃5s，56℃15s；最后进行72℃4min延伸。
PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，染料为EB替代物，在制胶的时候加入凝胶中；分别取3μl核酸提取样品，加入2μl上样缓冲液混合点样，并点样5μl DNA分子标准品(marker)，电泳条件为120V电压，电泳20min，电泳结果用凝胶成像系统(蓝盾-621)观察拍照，图3显示琼脂糖凝胶电泳检测HPV病毒PCR产物电泳图显示为条带，表明提取的HPV基因组DNA PCR验证确实存在目的条带，说明本发明提供的病毒基因组核酸提取试剂盒获得核酸经PCR扩增验证后，能获得目的基因片段，可以用于病毒的基因检测或临床诊断需要。
Claims (10)
1.一种用于提取病毒基因组核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由蛋白酶K、硅基修饰磁珠、提取缓冲液、漂洗液I、漂洗液II及无RNA酶水组成；所述试剂盒配套含有磁力架；
其中，所述提取缓冲液由硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮K25、Tris-HCl、EDTA以及NaCl组成；
所述提取的病毒基因组核酸，经超微量分光光度计检测，其A260/A280比值大于1.8；A260/A230的比值大于2.0；超微量分光光度计检测50μl脱落细胞液提取的核酸效率达到50μg/ml以上。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，各组成分别为：
1)蛋白酶K：为10-100mg/ml蛋白酶K，1ml/支；
2)硅基修饰微球G：1-100mg/ml，1μm硅基修饰微球，1ml/支；
3)提取缓冲液：1-20M硫氰酸胍；1-5％(wt)十六烷基三甲基溴化铵；0.5-5％(wt)聚乙烯吡咯烷酮K25；pH为5.5的100mM Tris-HCl；pH为5.5的25mM EDTA；2.0M NaCl；20ml/瓶；
4)漂洗液I：70％乙醇，30ml/瓶；
5)漂洗液II：96％乙醇，60ml/瓶；
6)RNase-Free去离子H2O：10ml/瓶；
所述试剂盒并配置1个磁力架，可用于样本的50次病毒基因组核酸提取，并可组成100次、200次和500次病毒基因组核酸提取试剂盒；其含使用说明书一份，试剂盒保存在4℃冰箱。
3.根据权利要求1-2任一项所述试剂盒，其特征在于，提取缓冲液优选含有4M硫氰酸胍。
4.根据权利要求1-2任一项所述试剂盒，其特征在于，提取缓冲液优选含有2％十六烷基三甲基溴化铵和2％聚乙烯吡咯烷酮K25。
5.一种用于提取病毒基因组核酸的试剂盒，其特征在于，其制备方法如下：
1)蛋白酶K，取100mg蛋白酶K干粉，加入1-10ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，制备成10-100mg/ml浓度，分装到1ml无菌塑料管中，每管1ml，存放于-20℃冰箱中备用；
2)硅基修饰微球G，取100mg/ml硅基修饰微球G原液1ml，加入1×PBS稀释，颠倒混匀，制备成1-100mg/ml浓度，分装到1ml无菌塑料管中，每管1ml，存放于4℃冰箱中备用；
3)提取缓冲液1：60.55g Tris碱溶于400ml ddH2O中，用HCl调pH值5.5，用ddH2O定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成1mol/LTris-HCl；
186.10g EDTA-Na盐磁力搅拌溶于400ml ddH2O中，用NaOH调pH值5.5，用ddH2O定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成1mol/LEDTA；
292.2g NaCl溶于400ml ddH2O中，定容至500ml，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟配制成10mol/L NaCl；
分别取1mol/L Tris-HCl 5ml、1mol/L EDTA 12.5ml、0.2mol/L NaCl100ml、59g-1180g硫氰酸胍、10g十六烷基三甲基溴化铵和10g聚乙烯吡咯烷酮K25，用灭菌的ddH2O定容至500ml，配制成提取缓冲液；分装到20ml无菌塑料瓶中，每瓶20ml；
4)漂洗液I：取700ml分析纯无水乙醇至1000ml无菌玻璃瓶中，加300ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，配制成70％乙醇漂洗液I，分装至50ml无菌塑料瓶中，每瓶30ml；
5)漂洗液II：取960ml分析纯无水乙醇至1000ml无菌玻璃瓶中，加40ml灭菌的ddH2O，颠倒混匀，配制成96％乙醇漂洗液II，分装至100ml无菌塑料瓶中，每瓶60ml；
6)去离子超纯水(ddH2O)，电阻率大于18MΩ*cm，每600mL水中加入600uL焦碳酸二乙酯DEPC，配成DEPC水，摇床过夜；次日，经121℃，100千帕压强下灭菌20分钟处理；分装至10ml无菌塑料瓶中，每瓶10ml；
所述试剂盒配置1个磁力架，用于样本的50次病毒基因组核酸提取，并可组成100次、200次和500次病毒基因组核酸提取试剂盒，其含使用说明书一份，试剂盒保存在4℃冰箱，有限期1年。
6.权利要求1-5任一项所述试剂盒的制备方法。
7.一种使用权利要求1-6任一项所述试剂盒提取病毒基因组核酸的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)取1个1.5ml无核酸酶的离心管，加入20μl蛋白酶K和15μl磁珠悬浮液G，再加入300μl提取缓冲液；
2)加入200μl血浆/血清/淋巴液/脱落细胞上清，用移液器吹吸或涡旋振荡混匀；56℃孵育10min，期间每3min用移液器吹吸或上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合；
3)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液I，涡旋混匀1min；
4)将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液II，涡旋混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时去除液体；
5)重复步骤3、4，将液体去除干净；离心管于磁力架上，室温晾干5-10min；将离心管从磁力架上取下，加入50μl RNase-free ddH2O，涡旋混匀；
6)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时将核酸溶液转移至新的离心管中，并于-20℃保存备用。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，提取得到的病毒基因组核酸，经超微量分光光度计检测，其A260/A280比值大于1.8，无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值大于2.0，无碳水化合物、盐类或有机溶剂污染；超微量分光光度计检测50μl脱落细胞液提取的核酸效率达到50μg/ml以上；满足所有基因研究和检测的样品要求。
9.权利要求1-8任一项所述的病毒基因组核酸的用途。
10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒的应用。
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|---|---|
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107663521A (zh) * | 2016-07-28 | 2018-02-06 | 深圳华大基因股份有限公司 | 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 |
| CN108676791A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-10-19 | 浙江迪恩生物科技股份有限公司 | 一种磁珠法提取dna的试剂盒及提取方法 |
| CN109306349A (zh) * | 2017-07-26 | 2019-02-05 | 天津迦美惠众科技有限公司 | 一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法 |
| CN109439655A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-03-08 | 北京优迅医学检验实验室有限公司 | 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 |
| CN109722431A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-05-07 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒 |
| CN111484991A (zh) * | 2019-01-29 | 2020-08-04 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法 |
| CN112029764A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-04 | 安康学院 | 一种潜隐病毒基因组的提取方法 |
| CN112280838A (zh) * | 2019-07-22 | 2021-01-29 | 苏州态和生物科技有限公司 | 利用磁珠-核酸酶过滤层析柱去除pcr污染的方法 |
| CN112501158A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-16 | 麦凯(上海)生物科技有限公司 | 一种人液体样本全核酸抽提试剂盒及其应用 |
| CN112646803A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-13 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用 |
| CN115786326A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-14 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101851617A (zh) * | 2010-04-28 | 2010-10-06 | 长春市博坤生物科技有限公司 | 可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法 |
| CN102071186A (zh) * | 2009-11-19 | 2011-05-25 | 北京金麦格生物技术有限公司 | 一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法 |
| CN102229925A (zh) * | 2011-05-13 | 2011-11-02 | 薛昱 | 一种增强的磁珠法核酸提取方法 |
| CN102533724A (zh) * | 2010-12-30 | 2012-07-04 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂 |
| CN103215253A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-07-24 | 福州泰普生物科学有限公司 | 一种采用磁珠法提取病毒dna或rna的试剂盒及其使用方法 |
| CN103614371A (zh) * | 2013-11-21 | 2014-03-05 | 安徽华卫集团禽业有限公司 | 一种同时提取血清、双拭子中动物dna病毒和rna病毒核酸的方法 |
-
2015
- 2015-04-21 CN CN201510189015.1A patent/CN104805073A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102071186A (zh) * | 2009-11-19 | 2011-05-25 | 北京金麦格生物技术有限公司 | 一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法 |
| CN101851617A (zh) * | 2010-04-28 | 2010-10-06 | 长春市博坤生物科技有限公司 | 可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法 |
| CN102533724A (zh) * | 2010-12-30 | 2012-07-04 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂 |
| CN102229925A (zh) * | 2011-05-13 | 2011-11-02 | 薛昱 | 一种增强的磁珠法核酸提取方法 |
| CN103215253A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-07-24 | 福州泰普生物科学有限公司 | 一种采用磁珠法提取病毒dna或rna的试剂盒及其使用方法 |
| CN103614371A (zh) * | 2013-11-21 | 2014-03-05 | 安徽华卫集团禽业有限公司 | 一种同时提取血清、双拭子中动物dna病毒和rna病毒核酸的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ELAISSARI ET AL.: "Hydrophilic magnetic latex for nucleic acid extraction,purification and concentration", 《JOURNAL OF MAGNETISM AND MAGNETIC MATERIALS》 * |
| 丁伯良等: "《奶牛乳房炎》", 31 January 2011 * |
| 牛炳韬等: "《遗传学实验教程》", 30 April 2014 * |
| 钟卫鸿: "《基因工程技术实验指导》", 30 June 2007 * |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107663521A (zh) * | 2016-07-28 | 2018-02-06 | 深圳华大基因股份有限公司 | 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 |
| CN109306349A (zh) * | 2017-07-26 | 2019-02-05 | 天津迦美惠众科技有限公司 | 一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法 |
| CN108676791A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-10-19 | 浙江迪恩生物科技股份有限公司 | 一种磁珠法提取dna的试剂盒及提取方法 |
| CN108676791B (zh) * | 2018-04-25 | 2022-03-25 | 浙江迪恩生物科技股份有限公司 | 一种磁珠法提取dna的试剂盒及提取方法 |
| CN109439655A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-03-08 | 北京优迅医学检验实验室有限公司 | 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 |
| CN109722431A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-05-07 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒 |
| CN109722431B (zh) * | 2019-01-21 | 2024-01-23 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒 |
| CN111484991A (zh) * | 2019-01-29 | 2020-08-04 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法 |
| CN111484991B (zh) * | 2019-01-29 | 2024-04-05 | 广州达安基因股份有限公司 | 用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法 |
| CN112280838A (zh) * | 2019-07-22 | 2021-01-29 | 苏州态和生物科技有限公司 | 利用磁珠-核酸酶过滤层析柱去除pcr污染的方法 |
| CN112029764B (zh) * | 2020-09-29 | 2023-09-19 | 安康学院 | 一种潜隐病毒基因组的提取方法 |
| CN112029764A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-04 | 安康学院 | 一种潜隐病毒基因组的提取方法 |
| CN112501158A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-16 | 麦凯(上海)生物科技有限公司 | 一种人液体样本全核酸抽提试剂盒及其应用 |
| CN112646803B (zh) * | 2020-12-28 | 2022-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用 |
| CN112646803A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-13 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用 |
| CN115786326A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-14 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
| CN115786326B (zh) * | 2022-11-04 | 2023-10-03 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
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