CN109576264B - 基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总dna的试剂盒及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒及其提取方法。所述的试剂盒包括裂解液、结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液和磁珠悬浮液；采用本发明的DNA提取试剂盒提取柑橘叶片总基因组DNA，所提取的DNA浓度和纯度整体水平优于市售的生工Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒和天根植物DNA提取试剂盒。本发明是针对柑橘黄龙病检测的DNA抽提磁珠法试剂盒及其提取方法，该试剂盒和提取方法适用于所有柑橘品种，具有广谱性。
Description
技术领域
本发明涉及分析生物学技术领域，具体涉及一种基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术
柑橘黄龙病是柑橘毁灭性病害，给世界柑橘产业造成了巨大的损失。到目前为止，国内外防治柑橘黄龙病主要依靠消除传播虫媒、强化检疫、培育无病苗木、挖除病树等主要措施，但黄龙病疫区的隔离、无毒苗圃的建立、挖除病株等防控手段需要借助于柑橘黄龙病精准诊断技术，而利用PCR检测黄龙病病原菌“Candidatus Liberibacter spp.”是目前柑橘黄龙病诊断的可靠方法，具有快速、特异、高效灵敏等优点。
目前柑橘黄龙病的PCR检测技术已逐步得到完善，但是黄龙病病原菌的DNA分离和纯化技术相对滞后。因为柑橘叶片中分离黄龙病病原菌DNA是整个分子诊断技术的关键环节，影响着PCR检测的灵敏性和准确性。
由于柑橘黄龙病病原菌位于柑橘维管束韧皮部，因此获取柑橘黄龙病病原菌的DNA只需要实现病原菌的DNA分离和纯化，也就是指将病原菌DNA与植物中的其他物质分离。柑橘叶片中脉作为病原菌所在部位，富含多糖、酚类、单宁、色素等物质，它们的存在严重影响了柑橘黄龙病PCR检测结果。所以有必要针对柑橘叶片中脉设计并筛选出一种能得到高纯度、结构完整的黄龙病病原菌DNA，且操作简便的提取方法。
磁珠法DNA抽提技术是适用于自动提取仪，实现自动化操作、样品的快速、高效制备，是未来DNA纯化方法发展的一个重要方向。目前市场所销售主要是植物或动物通用的磁珠法DNA抽提试剂盒，专门针对柑橘黄龙病的磁珠法DNA抽提试剂盒没有开发出来。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒及其提取方法。本发明是基于柑橘黄龙病病原菌在柑橘分布特点，筛选并优化柑橘黄龙病病原菌磁珠法DNA抽提试剂盒的试剂组分和方法条件。该试剂盒和抽提方法可以提取得到柑橘黄龙病病原菌高纯度DNA，与市售试剂盒相比，本发明专利技术裂解充分、提取纯度高、提取量大，所用试剂安全稳定，适用于高通量自动化生产，提升抽提效率，误差减少，更为精确。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液和磁珠悬浮液；
所述的裂解液组成为：80～120mmol/L pH＝7.5～8.5Tris-HCl、15～30mmolEDTA、0.1～0.2mol/L NaCl、2～4％m/v CTAB、0.5～1％m/v硫酸氢钾、0.5～1.5％m/v抗坏血酸、1.0～3.0％m/v PVP-40T、0.1～0.2％v/vβ-巯基乙醇，溶剂为ddH2O；其中，硫酸氢钾、PVP-40T、β-巯基乙醇在使用前添加。
所述的结合液组成为：600～800mmol/L NaCl、40～60mmol/L pH＝6.0～7.0MOPS、0.15％v/v Triton X-100、10～20％v/v异丙醇，溶剂为ddH2O；其中，异丙醇在使用前添加。
所述的洗涤液1组成为：4～6mol/L盐酸胍、10～30mmol/L pH＝6.0～7.0Tris-HCl、30～40％v/v乙醇，溶剂为ddH2O；其中，乙醇在使用前添加。
所述的洗涤液2组成为：80～120mmol/L NaCl、5～15mmol/L pH＝6.0～8.0Tris-HCl、75～85％v/v乙醇，溶剂为ddH2O；其中，乙醇在使用前添加。
所述的洗脱液组成为：80～100mmol/L Tris-HCl、8～10mmol/L EDTA，pH＝6.0～8.0，溶剂为ddH2O；
所述的磁珠悬浮液由磁珠和含有10～20mmol/L氯化钠、0.01～0.05％m/v NaN3的水溶液按1:30～50的重量比组成。
上述的m/v均指g/mL，如2～4％m/v CTAB是指每100mL溶液含有2～4g CTAB；0.5～1％m/v硫酸氢钾是指每100mL溶液含有0.5～1g硫酸氢钾，如此类推，其它成分含单位％m/v表示同上。
优选，所述的裂解液组成为：100mmol/L pH＝8.0Tris-HCl、25mmol EDTA、0.14mol/L NaCl、3％m/v CTAB、1％m/v硫酸氢钾、1％m/v抗坏血酸、2％m/v PVP-40T、0.1％v/vβ-巯基乙醇，溶剂为ddH2O；其中，硫酸氢钾、PVP-40T、β-巯基乙醇在使用前添加。
优选，所述的结合液组成为：750mmol/L NaCl、50mmol/L pH＝7.0MOPS、0.15％v/vTriton X-100、15％v/v异丙醇，溶剂为ddH2O；其中，异丙醇在使用前添加。
优选，所述的洗涤液1组成为：5mol/L盐酸胍、20mmol/L pH＝6.6Tris-HCl、38％v/v乙醇，溶剂为ddH2O；其中，乙醇在使用前添加。
优选，所述的洗涤液2组成为：100mmol/L NaCl、10mmol/L pH＝7.5Tris-HCl、80％v/v乙醇，溶剂为ddH2O；其中，乙醇在使用前添加。
优选，所述的洗脱液组成为：100mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA，pH＝8.0，溶剂为ddH2O；
优选，所述的磁珠悬浮液由磁珠和含有15mmol/L氯化钠、0.04％m/v NaN3的水溶液按1:40的重量比组成。
本发明还提供一种利用上述的试剂盒从柑橘叶片中脉提取总DNA的方法，该方法包括以下步骤：
(1)裂解：切取新鲜柑橘叶片中脉，置于液氮中冷冻，使用均质仪将冷冻后的柑橘叶片中脉破碎，加入裂解液和RNase A，进行水浴将柑橘叶片中脉的病原菌释放，离心取上清液用于进一步纯化，病原菌DNA存在于上清液中；
(2)结合：将上清液与结合液、磁珠悬浮液混匀，室温结合，在磁场的作用留存纳米磁珠结合体；
(3)清洗：依次用洗涤液1和洗涤液2清洗纳米磁珠结合体，将结合体系残液及纳米磁珠上结合的色素，多糖、多酚等有机小分子清洗掉；
(4)洗脱：将清洗后的纳米磁珠结合体用洗脱液洗脱，分离纳米磁珠，保留溶液，获得柑橘叶片总DNA，用于后续检测。
具体的，利用上述的试剂盒从柑橘叶片中脉提取总DNA的方法，包括以下步骤：
(1)裂解：取新鲜柑橘叶片3片，保留叶片中脉，切碎后放入储存管中于液氮下冷冻，使用均质仪将冷冻后的柑橘叶片中脉破碎，加入600μL裂解液和2μL RNase A，于65℃水浴30min，每隔10min颠倒混匀，将柑橘叶片中脉的病原菌释放，12000g离心2min取上清液；
(2)结合：取400～450μL上清液、600μL结合液、30μL磁珠悬浮液混匀，室温结合，在磁场的作用留存纳米磁珠结合体；
(3)清洗：室温下依次用洗涤液1清洗纳米磁珠结合体2次，每次600μL，用600μL无水乙醇清洗后，用600μL洗涤液2清洗；
(4)洗脱：将清洗后的纳米磁珠结合体在45℃下用80μL洗脱液洗脱，分离纳米磁珠，保留溶液，获得柑橘叶片总DNA；纳米磁珠用600μL洗涤液1清洗后回收利用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明是在磁珠法基础上改良的DNA提取技术，可以实现专门针对柑橘类植物黄龙病PCR诊断配套的抽提技术，一方面集成了磁珠法全自动化优点；另一方面，优化提取技术后获得高质量的DNA。
(2)本发明优于一般普通植物抽提总DNA方法，其总DNA获得率、浓度和纯度较高，适用于后续PCR的诊断，检测灵敏度高，成本低。
(3)使用本发明试剂盒和市面上已有的商品广谱试剂盒提取柑橘叶片总基因组DNA，包括如生工Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒、天根植物DNA提取试剂盒。通过电泳检测结果发现：本提取试剂盒与其它2种常规商品试剂盒的提取结果均可以获得高质量、无降解的总DNA。另外，利用微量分光光度计测定提取DNA的浓度和纯度，以其它2种常规商品试剂盒的提取结果作为对照，检测结果显示本发明的DNA提取试剂盒所提取的DNA浓度和纯度整体水平优于其他两种试剂盒。
(4)本发明是针对柑橘黄龙病检测的DNA抽提磁珠法试剂盒及其提取方法，该试剂盒和提取方法适用于所有柑橘品种，具有广谱性。
附图说明
图1为柑橘黄龙病病原菌DNA抽提流程图。
图2为柑橘叶片基因组总DNA电泳效果图；其中，A为M:DL2000marker；泳道1-8：本发明试剂盒的提取样品Sample A1-A8；B为M:DL2000marker；泳道1-4：生工Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒提取样品Sample B1-B4；泳道5-8：天根植物DNA提取试剂盒提取样品Sample C5-C8。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中的m/v均指g/mL，如3％m/v CTAB是指每100mL溶液含有3g CTAB；1％m/v硫酸氢钾是指每100mL溶液含有1g硫酸氢钾；如此类推，其它成分含单位％m/v表示同上。
实施例1
一种基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液和磁珠悬浮液；
所述的裂解液组成为：100mmol/L pH＝8.0Tris-HCl、25mmol EDTA、0.14mol/LNaCl、3％m/v CTAB、1％m/v硫酸氢钾、1％m/v抗坏血酸、2％m/v PVP-40T、0.1％v/vβ-巯基乙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，硫酸氢钾、PVP-40T、β-巯基乙醇在使用前添加。
所述的裂解液的配制为：将上述的Tris-HCl、EDTA、NaCl、CTAB、硫酸氢钾、抗坏血酸、PVP-40T、β-巯基乙醇混合，溶于ddH2O，制成100mL，即得，其中硫酸氢钾、PVP-40T、β-巯基乙醇在使用前添加。
所述的结合液组成为：750mmol/L NaCl、50mmol/L pH＝7.0MOPS、0.15％v/vTriton X-100、15％v/v异丙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，异丙醇在使用前添加。
所述的结合液的配制为：将上述的NaCl、MOPS、Triton X-100、异丙醇混合，溶于ddH2O，制成100mL，即得，其中异丙醇在使用前添加。
所述的洗涤液1组成为：5mol/L盐酸胍、20mmol/L pH＝6.6Tris-HCl、38％v/v乙醇，溶剂为ddH2O，制成62mL；其中，乙醇在使用前添加。
所述的洗涤液1的配制为：将上述的盐酸胍、Tris-HCl、乙醇混合，溶于ddH2O，制成62mL，即得，其中乙醇在使用前添加。
所述的洗涤液2组成为：100mmol/L NaCl、10mmol/L pH＝7.5Tris-HCl、80％v/v乙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，乙醇在使用前添加。
所述的洗涤液2的配制为：将上述的NaCl、Tris-HCl、乙醇混合，溶于ddH2O，制成100mL，即得，其中乙醇在使用前添加。
所述的洗脱液组成为：100mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA，pH＝8.0，溶剂为ddH2O，制成100mL；
所述的洗脱液的配制为：将上述的Tris-HCl、EDTA混合，溶于ddH2O，制成100mL，即得。
所述的磁珠悬浮液由磁珠和含有15mmol/L氯化钠、0.04％m/v NaN3的水溶液按1:40的重量比组成。
所述的磁珠悬浮液的配制为：将氯化钠、NaN3溶于ddH2O，制成含有15mmol/L氯化钠、0.04％m/v NaN3的水溶液，然后按磁珠：水溶液＝1:40的重量比加入磁珠，混合，即得。
实施例2
一种基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液和磁珠悬浮液；
所述的裂解液组成为：80mmol/L pH＝7.5Tris-HCl、15mmol EDTA、0.1mol/LNaCl、2％m/v CTAB、0.5％m/v硫酸氢钾、1.5％m/v抗坏血酸、3.0％m/v PVP-40T、0.2％v/vβ-巯基乙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，硫酸氢钾、PVP-40T、β-巯基乙醇在使用前添加。裂解液的制备参考实施例1。
所述的结合液组成为：600mmol/L NaCl、60mmol/L pH＝6.0MOPS、0.15％v/vTritonX-100、10％v/v异丙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，异丙醇在使用前添加。结合液的制备参考实施例1。
所述的洗涤液1组成为：6mol/L盐酸胍、10mmol/L pH＝7.0Tris-HCl、30％v/v乙醇，溶剂为ddH2O，制成62mL；其中，乙醇在使用前添加。洗涤液1的制备参考实施例1。
所述的洗涤液2组成为：80mmol/L NaCl、15mmol/L pH＝8.0Tris-HCl、75％v/v乙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，乙醇在使用前添加。洗涤液2的制备参考实施例1。
所述的洗脱液组成为：100mmol/LTris-HCl、8mmol/L EDTA，pH＝8.0，溶剂为ddH2O，制成100mL。洗脱液的制备参考实施例1。
所述的磁珠悬浮液由磁珠和含有10mmol/L氯化钠、0.05％m/v NaN3的水溶液按1:30的重量比组成。磁珠悬浮液的制备参考实施例1。
实施例3
一种基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒，包括裂解液、结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液和磁珠悬浮液；
所述的裂解液组成为：120mmol/L pH＝8.5Tris-HCl、30mmol EDTA、0.2mol/LNaCl、4％m/v CTAB、1％m/v硫酸氢钾、0.5％m/v抗坏血酸、1.0％m/v PVP-40T、0.1％v/vβ-巯基乙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，硫酸氢钾、PVP-40T、β-巯基乙醇在使用前添加。裂解液的制备参考实施例1。
所述的结合液组成为：800mmol/LNaCl、40mmol/L pH＝7.0MOPS、0.15％v/vTritonX-100、20％v/v异丙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，异丙醇在使用前添加。结合液的制备参考实施例1。
所述的洗涤液1组成为：4mol/L盐酸胍、30mmol/L pH＝6.0Tris-HCl、40％v/v乙醇，溶剂为ddH2O，制成62mL；其中，乙醇在使用前添加。洗涤液1的制备参考实施例1。
所述的洗涤液2组成为：120mmol/L NaCl、5mmol/L pH＝6.0Tris-HCl、85％v/v乙醇，溶剂为ddH2O，制成100mL；其中，乙醇在使用前添加。洗涤液2的制备参考实施例1。
所述的洗脱液组成为：80mmol/LTris-HCl、10mmol/L EDTA，pH＝6.0，溶剂为ddH2O，制成100mL。洗脱液的制备参考实施例1。
所述的磁珠悬浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化钠、0.01％m/v NaN3的水溶液按1:50的重量比组成。磁珠悬浮液的制备参考实施例1。
实施例4
比较本发明试剂盒和市面上已有的商品广谱试剂盒提取柑橘叶片总基因组DNA效果，包括如生工Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒、天根植物DNA提取试剂盒。
其中，采用本发明试剂盒(实施例1)从柑橘叶片中脉提取总DNA，流程见图1，具体步骤为：
(1)取新鲜柑橘叶片3片，保留叶片中脉，切碎后放入储存管中，加入钢珠(直径3.0mm)3颗于液氮下冷冻，使用均质仪将冷冻后的柑橘叶片中脉破碎，加入600μL裂解液和2μL RNase A，于65℃水浴30min，每隔10min颠倒混匀，将柑橘叶片中脉的病原菌释放，12000g离心2min取上清液；
(2)取400～450μL上清液至全自动核酸提取仪(杭州奥盛Auto-Pure32A)，根据表1的孔位布局加入相应的试剂和表2的反应程序进行结合、清洗、洗脱，获得柑橘叶片总DNA，用于后续检测。
表1核酸提取仪孔位布局
表2核酸提取仪运行程序
| 步骤 | 孔位 | 名称 | 等待时间 | 混合时间 | 吸磁 | 体积 | 温度 |
| 1 | 1 | 结合 | 0 | 300s | 60s | 700μL | 关 |
| 2 | 2 | 洗涤1 | 0 | 60s | 60s | 600μL | 关 |
| 3 | 3 | 洗涤1 | 0 | 60s | 60s | 600μL | 关 |
| 4 | 4 | 洗涤2 | 0 | 60s | 60s | 600μL | 关 |
| 5 | 5 | 洗涤2 | 0 | 60s | 60s | 600μL | 关 |
| 6 | 6 | 洗脱 | 1min | 150s | 90s | 80μL | 45℃ |
| 7 | 3 | 磁珠回收 | 0 | 60s | 0 | 600μL | 关 |
通过电泳检测结果发现本发明提取试剂盒与其它2种常规商品试剂盒的提取结果均可以获得高质量、无降解的总DNA(见图2)。另外，利用微量分光光度计测定提取DNA的浓度和纯度，以其它2种常规商品试剂盒的提取结果作为对照，测定提取结果(见表3)，结果显示本发明的DNA提取试剂盒所提取的DNA浓度和纯度整体水平优于其他两种试剂盒。
表3基因组总DNA的浓度和纯度
| Num | 260nm | 280nm | 260/280 | C:ng/uL |
| Sample A-1 | 5.379 | 2.627 | 2.05 | 268.958 |
| Sample A-2 | 4.868 | 2.413 | 2.02 | 243.449 |
| Sample A-3 | 4.849 | 2.454 | 1.98 | 242.466 |
| Sample A-4 | 5.497 | 2.79 | 1.97 | 274.857 |
| Sample A-5 | 4.407 | 2.182 | 2.02 | 220.357 |
| Sample A-6 | 4.087 | 2.487 | 1.64 | 204.384 |
| Sample A-7 | 3.912 | 2.158 | 1.81 | 195.638 |
| Sample A-8 | 3.81 | 1.936 | 1.97 | 190.546 |
| Sample B-1 | 3.054 | 1.568 | 1.95 | 152.744 |
| Sample B-2 | 3.013 | 1.66 | 1.82 | 150.653 |
| Sample B-3 | 2.988 | 1.688 | 1.77 | 149.445 |
| Sample B-4 | 3.705 | 2.429 | 1.53 | 185.263 |
| Sample C-5 | 3.131 | 1.775 | 1.76 | 156.594 |
| Sample C-6 | 3.127 | 1.664 | 1.88 | 156.373 |
| Sample C-7 | 3.797 | 2.04 | 1.86 | 189.865 |
| Sample C-8 | 3.084 | 1.751 | 1.76 | 154.202 |
注：Sample A-1至A-8：本发明DNA提取试剂盒的提取样品；Sample B-1至B-4：生工Dzup(植物)基因组DNA快速抽提试剂盒提取样品；Sample C-5至C-8：天根植物DNA提取试剂盒提取样品。
上述结果表明：本发明的DNA提取试剂盒与其他2种常规的商品试剂盒相比，所提取的植物基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.基于磁珠法从柑橘叶片中脉提取总DNA的试剂盒，其特征在于，包括裂解液、结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液和磁珠悬浮液；
所述的裂解液组成为：100mmol/L pH＝8.0Tris-HCl、25mmol EDTA、0.14mol/L NaCl、3％m/v CTAB、1％m/v硫酸氢钾、1％m/v抗坏血酸、2％m/v PVP-40T、0.1％v/vβ-巯基乙醇，溶剂为ddH2O；
所述的结合液组成为：750mmol/L NaCl、50mmol/L pH＝7.0MOPS、0.15％v/v TritonX-100、15％v/v异丙醇，溶剂为ddH2O；
所述的洗涤液1组成为：5mol/L盐酸胍、20mmol/L pH＝6.6Tris-HCl、38％v/v乙醇，溶剂为ddH2O；
所述的洗涤液2组成为：100mmol/L NaCl、10mmol/L pH＝7.5Tris-HCl、80％v/v乙醇，溶剂为ddH2O；
所述的洗脱液组成为：100mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA，pH＝8.0，溶剂为ddH2O；
所述的磁珠悬浮液由磁珠和含有15mmol/L氯化钠、0.04％m/v NaN3的水溶液按1:40的重量比组成。
2.一种利用权利要求1所述的试剂盒从柑橘叶片中脉提取总DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)裂解：切取新鲜柑橘叶片中脉，置于液氮中冷冻，使用均质仪将冷冻后的柑橘叶片中脉破碎，加入裂解液和RNase A，进行水浴将柑橘叶片中脉的病原菌释放，离心取上清液；
(2)结合：将上清液与结合液、磁珠悬浮液混匀，室温结合，得到纳米磁珠结合体；
(3)清洗：依次用洗涤液1和洗涤液2清洗纳米磁珠结合体；
(4)洗脱：将清洗后的纳米磁珠结合体用洗脱液洗脱，分离纳米磁珠，保留溶液，获得柑橘叶片总DNA。
3.根据权利要求2所述的从柑橘叶片中脉提取总基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)裂解：取新鲜柑橘叶片3片，保留叶片中脉，切碎后放入储存管中于液氮下冷冻，使用均质仪将冷冻后的柑橘叶片中脉破碎，加入600μL裂解液和2μL RNase A，于65℃水浴30min，每隔10min颠倒混匀，将柑橘叶片中脉的病原菌释放，12000g离心2min取上清液；
(2)结合：取400～450μL上清液、600μL结合液、30μL磁珠悬浮液混匀，室温结合，得到纳米磁珠结合体；
(3)清洗：室温下依次用洗涤液1清洗纳米磁珠结合体2次，每次600μL，用600μL无水乙醇清洗后，用600μL洗涤液2清洗；
(4)洗脱：将清洗后的纳米磁珠结合体在45℃下用80μL洗脱液洗脱，分离纳米磁珠，保留溶液，获得柑橘叶片总DNA。
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