CN100445385C - 从悬铃木组织中抽提总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于悬铃木分子生物学技术领域，具体涉及林木组织RNA制备技术领域。本发明公开了一种从悬铃木组织中提取总RNA的方法。针对悬铃木组织中酚类和次生代谢物质含量较高影响提取高质量RNA样品的障碍，提出了从粗提到纯化悬铃木总RNA的关键步骤，制备了含有聚乙烯吡咯烷酮40和β-巯基乙醇的新型裂解液，用于抑制悬铃木组织中多酚类物质的氧化；利用氯仿/异戊醇和氯仿分别抽提以除去部分多糖，多酚和蛋白质；将粗提物用DEPC-H2O溶解后再用正丁醇-CTAB和水饱和CTAB以进行纯化，显著提高了悬铃木组织中RNA的提取效率。本发明经济、稳定，抽提的总RNA样品质量较高，为悬铃木植物的分子生物学的进一步操作提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及悬铃木分子生物学技术领域。具体涉及从悬铃木组织中抽提与纯化用于分子生物学的RNA的方法。
背景技术
RNA的抽提是进行分子生物学研究的基础。高质量RNA的获得对于功能基因组学以及遗传学研究具有重要意义。有关植物RNA的抽提方法较多，现有的方法主要有Trizol Kit法(Trizol reagent.Product descriptionTRIZOL reagent.Manufacturer protocol(1995)Life Technologies，Gaithersberg，MD.)；异硫氰酸胍法(Chomczynski P and Sacchi N(1987)Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem 162：156-159.)；SDS/酚法(Gehrig HH，Winter K，Cushman J，Borland A，and Taybi T(2000)An improved RNA isolation method for succulent plant species richin polyphenols and polysacaccharides.Plant Mol Biol Rep 18：369-376.)和CTAB-LiCl法(Langridge J，Langridge P，and Bergquist PL(1980)Extraction of nucleic acids from agarose gels.Anal Biochem 103：264-271.)等几种，其中CTAB-LiCl法在多种动、植物中抽提RNA上具有广泛的应用，是一种有效、经济的RNA抽提方法。悬铃木被誉为“行道树之王”(陈有民，园林树木学，北京：中国林业出版社，1990)，是一种乔木类木本园林植物，其组织和器官中富含多酚和次生代谢物质，按照传统方法抽提DNA、RNA和蛋白质等抽提方法在悬铃木上应用比较困难。
近年来有关悬铃木生物大分子(例如DNA、RNA和蛋白质等)的分离纯化受到分子生物学技术领域科技人员的重视，有关DNA的抽提方法的改良促进了悬铃木分子生物学在DNA水平的发展。但近年来国内外有关从悬铃木组织和器官中抽提RNA的方法却未见报道。
从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是进行Northern杂交、RT-PCR、cDNA文库构建和差别显示分析等分子生物研究的关键。现在虽然有一些较为成熟的总RNA的分离方法能成功地从不同植物或不同组织中提取出RNA，但是从不同的材料或相同材料不同部位提取RNA时难度不同，因此需针对生物材料的具体特点选择适宜的RNA提取方法。在悬铃木植物组织中，不仅酚类化合物及次生代谢产物的含量较高，而且RNase的活性较高，这些因素导致RNA提取难度增大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种新的从悬铃木组织中抽提高质量总RNA的方法，该方法采用改进的CTAB-LiCl法抽提，样品沉淀并溶解后再纯化，以获取悬铃木组织高质量的总RNA样品。本发明的方法快速、经济，适用于悬铃木分子生物学操作。
本发明人经过大量的研究和对比实验，研究出满足本发明目的的一种从悬铃木组织中抽提总RNA的方法。它包括下述步骤：
1.悬铃木总RNA的粗提：
(1)采样：将悬铃木新鲜的或低温保存的组织(花序、叶片或无菌苗)置于液氮中，得到样品1；
(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；
(3)取1-2g步骤(1)中样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴5min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；
(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下离心10min，回收上清液；
(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下离心10min，回收上清液；
(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后于-20℃静置8-16h，于4℃条件下离心20min，得到RNA沉淀；
(7)将步骤(6)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA的粗提物。
2.悬铃木总RNA的纯化：
(1)将上述步骤制备的总RNA粗提物用400μlD DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下离心6min，回收上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，4℃条件下离心10min，收集下层水相；
(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3MNaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃条件下离心30min，得到RNA沉淀；
(4)将步骤(3)得到的沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的总RNA。
在上述步骤中所用到的药品配方如下：
RNA抽提缓冲液CTAB buffer包含0.1M Tris-Hcl，25mM EDTA，2％CTAB，2％PVP(soluble PVP 40，Sigma，USA)，2M NaCl；
bu/CTAB(正丁醇-CTAB)和aq/CTAB(水饱和CTAB)：在DEPC灭过菌的分液漏斗中各加75mL正丁醇和双蒸水，让两相静置分离(上层相为正丁醇)4小时；然后加1.84g CTAB至50mL水饱和的正丁醇，再加50mL正丁醇饱和的水，用分液漏斗摇匀，静置过夜至两相分层(上层相为bu/CTAB，下层相为aq/CTAB)，分别保存备用；
离心转速为9000rpm/min-12000rpm/min；
氯仿/异戊醇溶液为氯仿和异戊醇按体积比24∶1混合而成；
75％的乙醇是由3份体积的无水乙醇和1份体积的水混合而成；
水为用0.1％的DEPC处理并经高压灭菌的超纯水；
玻璃器皿于140℃灭活RNase；
优选地，所用的悬铃木组织材料是新鲜的。
上述本发明的方法能有效抑制酚类物质对总RNA提取的影响，能够从花序和叶片中获得质量高、完整性好的总RNA，28SrRNA亮度约18SrRNA的2倍，完全适于进行RT-PCR等研究，为利用同源序列法克隆基因、构建文库和Northern杂交提供了前提。
本发明的有益效果是：
本发明对现有技术的贡献主要体现在以下方面：
本发明在RNA抽提缓冲液中增加了聚乙烯吡咯烷酮40，并可根据悬铃木样品中多酚的含量适当调整其用量，并且还利用了β-巯基乙醇有效防止了多酚的氧化。
在利用氯仿/异戊醇和氯仿溶液对样品混合液进行了两次抽提后利用LiCl进行了一次总RNA粗抽物的沉淀，一方面有效减少了后续操作中溶液的体积，同时通过氯仿的抽提减少了溶液中次生代谢物质的含量。
与报道的CTAB-LiCl不同，本发明创新之处在于先用氯仿/异戊醇抽提，再用纯氯仿进行抽提，然后用LiCl沉淀得到总RNA粗提物后，再利用bu/CTAB和aq/CTAB来纯化，最后用乙醇沉淀还有效减少了多糖的共沉淀，提高了RNA的质量。
本发明对于悬铃木的不同组织都适用。已经利用本发明从悬铃木的花序、叶片、无菌苗等不同组织中成功抽提出高质量的总RNA。
本发明对长期保存的、不同时期的悬铃木的混合花序组织(如本年度2月、7月，上一年8月、10月、12月取样并保存的花序)也能成功抽提出高质量的RNA。
本发明经济，高效。本发明所使用的药品大都为普通的生化试剂，价格低廉，没有利用试剂盒或昂贵的药品，也没有用到苯酚、硫氰酸胍等有毒物质。从处理时间上来看，没有过夜沉淀，一般上午提取，晚上即可纯化，完成全部实验有利于制备效率的提高。
附图说明
图1：本发明与对照方法对悬铃木花序和叶片总RNA的提取效果比较，图中泳道1、2分别为悬铃木的花序和叶(采用异硫氰酸胍法制备)；3、4分别为悬铃木的花序和叶片(采用Trizol Kit法制备)；5，6分别为悬铃木花序和叶片(采用SDS/酚法制备)；7，8分别为悬铃木的花序和叶片(采用报道CTAB-LiCl法制备，但未经过纯化步骤)。
图2：本发明纯化和未纯化步骤对悬铃木花序及叶片总RNA提取影响，图中泳道1、3分别为悬铃木叶片；2、4分别为悬铃木的花序，其中泳道3、4是经过本发明所述的纯化步骤，点样孔未见蛋白质污染。
图3：悬铃木花序均一化的cDNA的电泳图，图中泳道1为总cDNA M为分子量标准(DL2000，北京天为公司)
图4；不同时期取样(本年度2月、7月，上一年8月、10月、12月)并保存的悬铃木混合花序样品总RNA提取效果电泳图，图中泳道1、2为悬铃木的花序混合样品总RNA
图5：应用RT-PCR扩增LFY基因片段、PCR及酶切检验电泳图，图中M为DNA分子量标记；1-3为以质粒DNA为模板M13引物PCR扩增验证；4为质粒DNA；5-6为以cDNA为模板PCR扩增；7：以质粒DNA为模板PCR扩增验证；8：质粒DNA用EcoR I and HindIII酶切检测
图6：应用RT-PCR克隆到悬铃木LEAFY基因片段与加州悬铃木LEAFY基因片段序列对比，经检测同源性高达98％(LEAFY基因的克隆引物设计参考加州悬铃木，ACCESSION number：AF106842，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝8574518)
图7：应用3’RACE扩增AG基因片段，图中M为DNA分子量标记；1-6为以cDNA为模板PCR扩增
具体实施方式
实施例1：从悬铃木花序抽提总RNA样品
a.悬铃木花序总RNA的粗提：
(1)采样：采集新鲜的悬铃木花序，将其置于液氮中，得到样品1；
(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；
(3)取2g步骤(1)中样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴5min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；
(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/lLiCl，混匀后于-20℃放置8-16h，于4℃条件下12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；
(7)将步骤(6)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA的粗提物。
b.悬铃木花序总RNA的纯化：
(1)将上述步骤制备的花序总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下12000rpm/min，离心6min，回收上清液；
(2)将步骤(1)所得的上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃条件下12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；
(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3MNaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置1h，4℃条件下12000rpm/min，离心30min，得到RNA沉淀；
(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的花序总RNA。
用本实施例，悬铃木花序总RNA的产率为202.20微克/克鲜重。
质量检测：经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.94，可以满足分子生物学实验需要。
实施例2：从悬铃木叶片抽提总RNA样品
a.悬铃木叶片总RNA的粗提：
(1)采样：采集悬铃木新鲜叶片并至于液氮中，得到样品1；
(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；
(3)取1g步骤(1)中样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴2min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；
(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后-20℃放置8-16h，于4℃条件下12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；
(7)将步骤(6)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干。
b.悬铃木叶片总RNA的纯化：
(1)将上述步骤制备的叶片总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下12000rpm/min，离心6min，回收上清液；
(2)将步骤(1)所得的上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃条件下12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；
(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3MNaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃条件下12000rpm/min，离心30min，得到RNA沉淀；
(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的叶片总RNA。
用本实施例，悬铃木叶片总RNA的产率为245.90微克/克鲜重。
质量检测：经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.93，可以满足分子生物学实验需要。
实施例3：从不同时期取样并保存的悬铃木混合花序中抽提总RNA
a.粗提：
(1)采样：分不同时期(样品取自本年度2月、7月、8月及上一年10月、12月)采集悬铃木花序并置于液氮中，于-70℃超低温冰箱备用，得到不同时期的混合样品1；
(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；
(3)取2g步骤(1)中混合样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(1)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴2min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；
(4)将步骤(2)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(5)将步骤(3)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(6)将步骤(4)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后-20℃放置8-16h，于4℃条件下12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；
(7)将步骤(5)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA粗提物。
b.纯化：
(1)将上述步骤制备的花序总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下12000rpm/min，离心6min，回收上清液；
(2)将步骤(1)所得的上清，加300μl0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃条件下12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；
(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃条件下12000rpm/min，离心30min；
(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的总RNA。
用本实施例，悬铃木混合花序RNA产率为198.58微克/克鲜重。
质量检测：经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.85，可以满足分子生物学实验需要。
实施例4；从悬铃木无菌苗抽提总RNA
(1)无菌苗的培养参见刘国锋和包满珠(Liu G，Bao M，Adventitious shoot regeneration from in vitrocultured leaves of London plane tree(Platanus acerifolia Willd.)Plant Cell Rep，2003，21：640-44)报道的方法。
(2)从悬铃木无菌苗中提取总RNA的粗提与纯化步骤参照本说明书的实施例1。
用本实施例，悬铃木无菌苗总RNA产率为204.6微克/克鲜重。
质量检测：经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.85，可以满足分子生物学实验需要。
实施例5：本发明与对照方法对悬铃木组织中总RNA提取效果的比较
本实施例具体涉及本发明方法与报道的其它三种方法(如前所述的异硫氰酸胍法、Trizol Kit法、SDS/酚法)提取悬铃木组织中总RNA的质量和得率的比较，对照方法的具体操作步骤见说明书《背景技术》文献所述。
从结果可以看出，目前常用的Trizol Kit法并不适合提取悬铃木RNA(见表1、图1)，用该法提取悬铃木花序的RNA很容易降解，而无菌苗的RNA杂质很多，并且完整性不好。尽管整个操作过程需时较短，但Trizol缓冲液有剧毒且试剂盒费用较高，故其并不是提取悬铃木RNA的理想方法。
异硫氰酸胍法能成功提取悬铃木花序及叶片的RNA，但RNA纯度及完整性并不如改进SDS/酚法和改进CTAB-LiCl法，并且异硫氰酸胍较贵、有毒，且异硫氰酸胍母液及提取缓冲液在4℃、暗处分别只能保存三个月和一个月。
改进SDS/酚法也能成功提取悬铃木花序及叶片的RNA，但该方法产量较低，并且苯酚有剧毒。
本发明不仅能成功提取悬铃木花序及叶片的RNA，而且提取的RNA产量较高，多糖、蛋白质等杂质污染可以有效避免，尽管需时较长，但有毒药品比其它方法少，稳定有效、成本低。故成为提取悬铃木花序及叶片较为理想的方法。
表1.本发明与对照方法对悬铃木花序和叶片中总RNA提取效果的比较
注：表中数据为平均值±标准误，同一行中不同英文字母表示数据间存在的显著差异(P＝0.05)(下同)。
本发明提取到的总RNA经纯化之后，28SrRNA亮度约18SrRNA的2倍(图2)，完全适于进行RT-PCR等研究。纯化后的悬铃木总RNA的A260/A230值大于2.0，表明RNA没有多酚、多糖及蛋白质的污染，RNA完整性很好，可以用于进一步的分子生物学研究。而未经纯化的悬铃木花序和叶片的总RNA(图2，泳道1、2)，点样空处有污染，可能是蛋白质未去除干净。从悬铃木花序和无菌苗叶片中提取总RNA产量分别约为202μg/g鲜重和245μg/g鲜重(参见表2)。
表2.纯化和未纯化步骤对悬铃木花序和叶片中总RNA提取效果的比较
实施例6：本发明的应用实施例(应用RT-PCR克隆悬铃木LEAFY基因片段)
(1)悬铃木花序总RNA提取：
具体操作步骤参照实施例1所述的步骤。
(2)cDNA合成：
第一链逆转录cDNA合成采用CLONTECH SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，按田振东等(田振东等，cDNA文库与RACE方法结合克隆一个马铃薯病程相关蛋白基因cDNA，遗传学报，2003，30(11)：996-1002)的方法进行。用该方法合成的单链cDNA 3’端带有接头5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC-3′。
(3)基因克隆：
RT-PCR扩增Leafy基因的第三段外显子(Exon)
根据Michael等(Michael W.Frohlich，David S.Parker，The Mostly Male Theory of Flower EvolutionaryOrigins：from Genesto Fossils Systematic Botany(2000)，25(2)：pp.155-170)在Platanus racemosa中报道的Leafy基因(参见gene bank，accession number：AF106842，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝8574518)序列设计RT-PCR引物：
Forward(5’-TGACGAACCAGGTATTCAGA-3’)，
Reverse(5’-AGGAAGGACCAGTAATGGCT-3’)。
PCR反应体系如下：2μl第一链逆转录cDNA，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs(NH4 +balanced)，5μl 10×Buffer，1μM primer，1.5U Taq酶。
PCR反应程序如下：94℃变性45s，57℃退火60s，72℃延伸2min，38个循环，循环结束后72℃延伸10min。扩增产物用1.5％琼脂糖(含1％EB)电泳检测。
用本发明提取的悬铃木花序的总RNA，经第一链逆转录为cDNA，以此cDNA模板，成功扩增出Leafy基因第三段内含子，连接T载体(购自中国大连宝生物公司)后，经酶切及PCR鉴定(如图5所示)并测序，其大小为360bp(如图6所示)。用Clustal W 1.83软件进行序列分析，证明所克隆片段与Michael等(2000)在Platanus racemosa中报道的Leafy基因第三段内含子的同源性高达98％。
表3.本发明所涉及英文缩写的说明
Claims (3)
1、一种从悬铃木组织中抽提总RNA的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a.粗提：
(1)采样：将悬铃木新鲜的或低温保存的组织置于液氮中，得到样品1；
(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；
(3)取2g步骤(1)制备的样品1加液氮研磨成粉末，再加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，于65℃水浴5min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；
(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，使混匀成一相，于4℃12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，使混匀成一相，于4℃12000rpm/min离心10min，回收上清液；
(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后于-20℃放置8-16h，于4℃12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；
(7)将步骤(6)所得的RNA沉淀用75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA的粗提物；
b.纯化：
(1)将上述步骤制备的总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加正丁醇-CTAB和水饱和CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃12000rpm/min，离心6min，回收上清液；
(2)将步骤(1)所得的上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；
(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃12000rpm/min，离心30min，得到RNA沉淀；
(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，于-20℃保存，得到纯的悬铃木组织总RNA。
2、根据权利要求1所述的从悬铃木组织中抽提总RNA的方法，其特征在于，所述的新鲜组织选自悬铃木花序或叶片或离体培养的无菌苗。
3、权利要求1所述的方法在悬铃木RT-PCR和基因克隆中的应用。
Priority Applications (1)
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| 利用CTAB/酸酚法提取棉花组织总RNA. 蒋建雄，张天真. 棉花学报，第15卷第3期. 2003 * |
| 百合花瓣总RNA提取方法的研究. 郝福玲，刘雅莉，王跃进.西北植物学报，第25卷第6期. 2005 |
| 百合花瓣总RNA提取方法的研究. 郝福玲，刘雅莉，王跃进. 西北植物学报，第25卷第6期. 2005 * |
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