CN116425846A - 蛋白质OsNLP4在植物分蘖调控中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白质OsNLP4在调控水稻分蘖中的应用。本发明通过过量表达OsNLP4基因显著增加水稻有效分蘖数目，从而提高水稻产量和氮素利用效率，同时通过CRISPR技术在OsNLP4敲除突变体中证实了该基因调控分蘖的功能。本发明还对OsNLP4调控水稻分蘖的机理进行了探究，发现OsNLP4通过降低OsD3的表达量进而抑制独角金内酯信号通路来提高水稻的分蘖数目。本发明解析了OsNLP4调控水稻分蘖的分子机理，为培育具备分蘖优势的农作物(特别是水稻、小麦等农作物)提供了重要的基因资源和理论基础，具有广泛的生产应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体涉及蛋白质OsNLP4在调控水稻分蘖中的应用，同时涉及该基因对分蘖调控的分子机理，具有重要的生产应用价值。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的农作物之一，为全球一半以上的人口(约40亿)提供主粮。因此，提高水稻产量对保障粮食安全和提高人民生活水平具有至关重要的作用。我国是世界上最大的水稻生产国和稻米消费国，如何用全世界7％的耕地来供养全世界22％的人口，是我国农业面临的巨大挑战。分蘖是生长在叶片腋下未伸长的基部节间上的可以发育为穗的特殊分枝，是决定水稻产量的最重要的农艺性状之一，提高分蘖数目是一种有效的增产策略。
水稻分蘖的研究在过去二十年中得到了广泛的关注，在分蘖调控机理的研究方面取得了重大进展。OsMOC1是控制水稻分蘖的关键转录调控基因，主要在腋芽中表达，在水稻的营养和生殖生长阶段正向调控腋芽分生组织的起始和生长促进水稻分蘖。随后OsTAD1和OsTE被鉴定到位于OsMOC1的上游并在叶腋中与其共表达，OsTAD1和OsTE通过与OsMOC1相互作用促进其降解进而调节水稻的分蘖，后续发现OsAPC10、OsCDC27和APC/C也参与这一调控模型靶向OsMOC1的降解并影响水稻分蘖。OsOSH1同样是分生组织功能和芽活性必需的基因，受OsMOC3的正向调控来促进水稻分蘖。TB1是在玉米中发现的控制分枝的关键基因，它在水稻中的同源蛋白基因OsTB1/BRC1在腋芽中特异表达同样抑制分蘖。
除了这些水稻分蘖调控基因外，植物激素同样对水稻分蘖具有重要的影响。研究发现，生长素抑制分蘖芽的生长而细胞分裂素则促进分蘖芽的生长。此外，赤霉素和油菜素内酯也对分蘖表现了相反的作用，分别抑制和促进分蘖芽的生长。调控水稻分蘖的激素还有很多，在众多激素中，独角金内酯(SL)是近年来发现的可以抑制植物分枝的新型植物激素，并且围绕着以SL为中心的分蘖调控模型也逐渐被人们所熟知。研究发现DWARF蛋白(D蛋白)在SL合成和信号传递中占据不可代替的地位。在水稻中，OsD27、OsD17和OsD10是合成SL前体的关键酶，OsD14和OsD3则参与SL的感知和信号传递。在SL的信号传递中，SL信号需要首先被潜在的SL受体OsD14所识别，随后与Skp–Cullin–F-box(SCF)E3泛素连接酶复合体的F-box组分D3进行激素依赖性相互作用，最终泛素化OsD3结合的底物OsD53。OsD53是一种转录抑制因子，负责抑制分蘖负向调控基因如OsFC1、OsCKX9等基因的表达从而促进水稻分蘖。
NIN-LIKE PROTEIN(NLP)是一种植物特有的RWP-RK转录因子家族，研究发现该家族在响应氮信号促进氮的吸收和利用方面发挥重要功能。但依然需要对NLPs的新功能进行研究，以培育开发高产作物。
发明内容
本发明揭示了NLPs的新功能并发现OsNLP4是调控水稻分蘖的重要转录因子。本发明发现提高蛋白质OsNLP4的含量，可以降低OsD3的表达，抑制下游的SL信号通路从而促进水稻分蘖，大大的提高水稻产量和氮素利用效率。本发明解析了OsNLP4对水稻分蘖的调控机制，并利用基因工程技术改良植物分蘖，对于培育多蘖高产的作物品种有重要的应用价值。
本发明的目的在于提供蛋白质OsNLP4在调控植物分蘖中的用途和使用方法，以及解析蛋白质OsNLP4对水稻分蘖的调控机制。
本发明首先提供下述任意一种应用：
A1)蛋白质OsNLP4在调控植物分蘖中的应用；A2)蛋白质OsNLP4在调控植物D3基因表达量中的应用；A3)蛋白质OsNLP4在调控植物独角金内酯信号通路中的应用。
所述蛋白质OsNLP4来源于禾本科稻属(Oryza sativa L.)，全称为NIN-LIKEPROTEIN 4。所述蛋白质OsNLP4可为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)所述蛋白质OsNLP4氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示；a2)由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加得到的、来源于水稻的具有相同生物学功能的蛋白质；a4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性、来源于水稻且具有相同生物学功能的蛋白质。
其中序列SEQ ID NO:1由843个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列SEQ ID NO:1的氨基端或羧基端添加如表1所示标签。
表1.标签的序列
上述a3)中的蛋白质，均可由人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质编码基因可通过将序列SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或多个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或多个碱基对的错义突变，和/或在其5’末端和/或3’末端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述与蛋白质OsNLP4相关的生物材料的应用也属于本发明的保护范围。与所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料的应用可为如下B1)至B3)的至少一种：
B1)与所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料在调控植物分蘖中的应用；B2)与所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料在调控植物D3基因表达量中的应用；B3)与所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料在调控植物独角金内酯信号通路中的应用。
上述应用中，所述生物材料为下述c1)-c7)中的任意一种：
c1)编码所述蛋白质OsNLP4的核酸分子；c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体，或含有c2)所述核酸分子表达盒的重组载体；c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物，或含有c2)所述核酸分子表达盒的重组微生物，或含有c3)所述重组载体的重组微生物；c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系，或含有c2)所述核酸分子表达盒的转基因植物细胞系；c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织，或含有c2)所述核酸分子表达盒的转基因植物组织；c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官，或含有c2)所述核酸分子表达盒的转基因植物器官。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子可为编码所述蛋白质OsNLP4的基因及其调控序列形成的核酸分子。
例如，编码所述蛋白质OsNLP4的核酸分子可以为如下d1)-d4)中的任意一种：
d1)编码区为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；d2)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于水稻且编码权利要求1所述蛋白质OsNLP4的DNA分子；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，来源于水稻且编码权利要求1所述蛋白质OsNLP4的DNA分子。
所述严格条件例如为：在含有6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列SEQ ID NO:2由2529个碱基组成，所示为蛋白质OsNLP4的cDNA编码区。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质OsNLP4的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的蛋白质OsNLP4的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsNLP4且来源于水稻，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码蛋白质OsNLP4的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述任一所述的应用中，所述调控植物分蘖为增加植物有效分蘖。所述调控植物D3基因表达量为降低D3基因表达量。所述调控植物独角金内酯信号通路为抑制植物独角金内酯信号通路。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入增强蛋白质OsNLP4的含量和/或活性的物质，得到转基因植物；
所述转基因植物与受体植物相比，所述转基因植物至少具有以下一种特性：1)植物有效分蘖增加；2)植物D3基因表达量降低；3)植物独角金内酯信号通路受抑制。
上述方法中，所述“增强蛋白质OsNLP4的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到表达或过量表达所述蛋白质、或提高所述蛋白质的活性的效果。
上述方法中，所述“增强蛋白质OsNLP4的含量和/或活性的物质”具体可为上文记载的所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料。例如，向受体植物中导入编码所述蛋白质OsNLP4的核酸分子。
上述方法中，所述“向受体植物中导入编码所述蛋白质OsNLP4的核酸分子”为通过重组表达载体导入所述出发植物；所述重组表达载体具体可为实施例提及的OsNLP4基因过量表达载体。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括将通过上述方法获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤。所述后代转基因植物与所述转基因植物(即作为亲本的转基因植物)表型基本一致。
上述任一项所述植物可为如下e1)至e5)的任意一种：e1)双子叶植物；e2)单子叶植物；e3)禾本科植物；e4)水稻；e5)水稻品种中花11。
携带有本发明OsNLP4基因或其它同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任意一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
上述任一项所述双子叶植物还可为拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、或烟草。上述任一所述单子叶植物还可为玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、或高梁。
水稻作为重要的粮食作物，而分蘖是影响水稻产量的重要因子，深入探究水稻分蘖的调控机制具有重要的理论意义与应用价值，有利于培育多蘖高产水稻品种。
下述实施例实验证明，蛋白质OsNLP4通过降低OsD3基因的表达量，抑制下游的独角金内酯信号通路从而正向调控水稻分蘖，提高水稻产量和氮素利用效率。OsNLP4是水稻分蘖改良的优良候选基因。利用植物基因工程对OsNLP4进行改造，是培育多蘖高产作物新品种的有效分子策略。
附图说明
图1.OsNLP4促进水稻分蘖。A.野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)在土壤中生长14天时的分蘖芽的形态示意图。比例尺＝1cm。B.野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)为土壤中生长60天时的分蘖形态示意图。比例尺＝15cm。C.野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)在土壤中生长11周的分蘖数目统计图。每周统计一次水稻分蘖数直至分蘖数不再增加时停止统计。其中，数据值为平均值±SD，每组样本量包含16株苗，柱状图上方的不同字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。D.野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)田间有效分蘖数目统计图。田间试验在不同氮水平下进行(LN：低氮水平，施尿素80kg/hm2，NN：正常氮水平，施尿素200kg/hm2，HN：高氮水平，施尿素500kg/hm2)。其中，数据值为4个独立重复的平均值±SD，每个重复包含18株苗，柱状图上方的不同字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。
图2.OsNLP4直接结合OsD3的启动子并抑制OsD3的转录。A.OsD3在野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)的分蘖基部组织中的转录水平。选取土培30天的水稻分蘖基部组织(去除多余的叶片)作为样品进行基因表达量鉴定。其中，RT-qPCR数据值为3个独立重复的平均值±SD，柱状图上方的不同字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。B.染色质免疫共沉淀(ChIP)定量PCR实验分析OsNLP4对OsD3基因启动子的结合情况。使用水培3周的OsACTIN1pro：OsNLP4-GFP材料进行ChIP-qPCR分析，表征富集(相对于野生型)来源于OsD3启动子中的类NRE顺式元件，选择OsD3启动子中不含有NRE序列的C片段作为对照，具体操作见实施例2.2所述。其中，ChIP-qPCR数据值为3个独立重复的平均值±SD，柱状图上方的不同字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。C.凝胶阻滞迁移实验(EMSA)检测OsNLP4结合到含有类NRE顺式元件的OsD3启动子区域的能力。使用生物素标记的OsD3-NRE-like基因顺式片段作为探针，未标记的片段作为竞争性探针。体外表达带有MBP标签的OsNLP4蛋白对OsD3-NRE探针进行凝胶阻滞迁移实验，具体操作步骤见实施例2.2所述。D.双荧光素酶报告基因系统顺式分析OsNLP4对OsD3基因的转录调控。将荧光素酶报告基因载体pAN580-OsNLP4与pGreenⅡ0800-LUC-OsD3-promoter/cis瞬转进水稻原生质体中进行表达，通过荧光素酶的表达情况来判断OsNLP4蛋白对的OsD3启动子或OsD3-NRE-like顺式作用元件的结合情况，具体操作步骤见实施例2.2。
图3.OsNLP4抑制OsD3下游SL信号通路。A.免疫印迹法(Western)检测OsD53在野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)中的蛋白水平。选取土培30天的水稻分蘖基部组织(去除多余的叶片)作为样品进行蛋白水平鉴定，并通过ImageJ定量OsD53蛋白水平相对于OsActin蛋白水平的比值，具体操作步骤见实施例3.1。其中，数据值为3个独立重复的平均值±SD，不同的字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。B.OsD53下游靶基因OsCKX9在野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)中的转录水平。选取土培30天的水稻分蘖基部组织(去除多余的叶片)作为样品进行基因表达量鉴定。其中，RT-qPCR数据值为3个独立重复的平均值±SD，柱状图上方的不同字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。C.OsD53下游靶基因OsFC1在野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)中的转录水平。选取土培30天的水稻分蘖基部组织(去除多余的叶片)作为样品进行基因表达量鉴定。其中，RT-qPCR数据值为3个独立重复的平均值±SD，柱状图上方的不同字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。
图4.OsNLP4与OsD3在同一遗传途径并位于OsD3的上游。A.分别在野生型中花11(ZH11)与OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1)背景中敲除OsD3获得的突变体(d3、d3 nlp4-1)的编辑类型。突变体d3缺失1个碱基，d3 nlp4-1在相同位置缺失1个碱基。通过对这些突变体基因组DNA中OsD3序列的测序证实了这些突变。B.野生型中花11(ZH11)，OsNLP4基因敲除株系nlp4-1，OsD3基因敲除株系d3，OsNLP4和OsD3基因双敲除株系d3 nlp4-1在土壤中生长60天时的分蘖表型示意图。比例尺为15cm。C.野生型中花11(ZH11)，OsNLP4基因敲除株系nlp4-1，OsD3基因敲除株系d3，OsNLP4和OsD3基因双敲除株系d3 nlp4-1在土壤中生长60天时的分蘖数目统计结果。其中，数据值为平均值±SD，每组样品量包含18株苗，柱状图上方的不同字母表示差异显著性(P<0.05)，用Ducan’s检验进行单因素方差分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步描述，给出的实例仅为了阐释本发明而不限制本发明的范围。以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或产品说明书进行，其中所涉及的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中涉及的引物名称及核苷酸序列见表1.
表1
试验材料：选用粳稻品种中花11(WT)、粳稻品种中花11背景下OsNLP4基因敲除突变体(nlp4-1，nlp4-2)和OsNLP4过量表达的水稻株系(OE-1，OE-9)进行试验。突变体是通过基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术获得，过量表达株系是通过农杆菌(EHA105)转化和抗性筛选获得(参照文献Wu et al.(2021).Rice NIN-LIKE PROTEIN 4plays a pivotal rolein nitrogen use efficiency.Plant Biotechnology Journal 19,448-461)。
实施例1：OsNLP4促进水稻分蘖
1.OsNLP4遗传材料在水稻分蘖初期的分蘖芽生长情况分析
将野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)的种子用蒸馏水清洗干净，然后在37℃恒温培养箱中孵育3天。待种子萌发后将其转移至装满土壤的方型花盆(花盆尺寸15×15×15cm)中，然后放置在一个提供12h光照(30℃)/12h黑暗(28℃)循环生长条件的温室中培养。待水稻幼苗在土壤中生长14天后，观察分蘖芽生长情况并拍照。此时需要将水稻样品从土壤中取出并将水稻根部清洗干净(尤其是与地上部分相连的部位)，然后将水稻基部外层的叶片剥去至露出分蘖芽时进行拍照。如图1A所示，结果发现与野生型中花11(ZH11)相比，OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)的分蘖芽较小，生长缓慢。而OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)的分蘖芽则明显大于野生型，生长较快。以上这些结果说明OsNLP4正向调控水稻分蘖芽的生长。
2.OsNLP4遗传材料在水稻分蘖后期的分蘖状况分析
将野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1、nlp4-2)和OsNLP4过表达株系(OE-1、OE-9)的种子用蒸馏水清洗干净，然后在37℃恒温培养箱中孵育3天。待种子萌发后将其转移至装满土壤的方型花盆(花盆尺寸15×15×15cm)中，然后放置在一个提供12h光照(30℃)/12h黑暗(28℃)循环生长条件的温室中培养。对OsNLP4遗传材料进行分蘖数目统计至其分蘖数目不再增加，每周统计其分蘖的数目并拍照。如图1B所示，OsNLP4遗传材料的分蘖数目在60天时出现非常明显的差异，与野生型中花11(ZH11)相比，OsNLP4基因敲除株系nlp4-1和nlp4-2分蘖数目骤减，而OsNLP4过表达株系OE-1和OE-9则相反。通过每周统计水稻的分蘖数目(图1C)发现OsNLP4过表达株系OE-1和OE-9分蘖增加速率最大，与WT相比，过表达株系分蘖数量显著增加了38.8％(OE-1)和90.8％(OE-9)。OsNLP4基因敲除株系nlp4-1/nlp4-2分蘖增加速率最小，与WT相比，突变体株系分蘖数量显著少了28.6％(nlp4-1)和26.5％(nlp4-2)。以上这些结果表明OsNLP4促进水稻分蘖数目的增加。
3.不同氮水平田间OsNLP4遗传材料的有效分蘖状况分析
田间实验在中国四川省成都市自然生长条件下的稻田进行，包括了5个OsNLP4基因型(野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系nlp4-1和nlp4-2以及OsNLP4过表达株系OE-1和OE-9)和3个氮处理条件：以尿素为氮源，低氮(LN)处理为每公顷80kg尿素，正常氮(NN)处理为每公顷200kg尿素，高氮(HN)处理为公顷500kg尿素。每块地(大小约8m2)种植200株水稻，每种氮素条件设4个重复。同时为减少田间试验的数据变动性，在每一施氮水平下，各小区均施化肥。在数据收集时，为了避免边缘效应，我们将每个小区的边缘样品都排除在外。结果如图1D所示，无论氮浓度如何，OsNLP4过表达株系OE-1和OE-9的有效分蘖数目均高于野生型，尤其是NN处理条件下增幅最大，OE-1和OE-9株系的有效分蘖数目分别增加了15.0％和17.1％，而OsNLP4基因敲除株系nlp4-1和nlp4-2的分蘖数则低于野生型，在NN处理条件下的nlp4-1和nlp4-2株系的有效分蘖数均减少了20.7％。这些数据进一步说明了OsNLP4对水稻分蘖表型的正向调控作用。
实施例2：OsNLP4直接结合OsD3的启动子并抑制OsD3的转录
1.OsD3在OsNLP4遗传材料中的转录水平分析
待实施例1中的OsNLP4遗传材料生长至30天时选用其分蘖基部作为实验样品，并使用TRIzol试剂(TRANSGEN，cat#ET111)进行植物总RNA抽提。考虑到RNA的不稳定性，容易降解，因此我们在得到了RNA以后，会立即使用反转录试剂盒(TRANSGEN，cat#AE311-02)将其反转录成可长期保存的cDNA。最终获得的cDNA选用Takara公司的SYBR试剂盒(cat#Q111-02)进行荧光定量PCR用于检测OsNLP4遗传材料中的OsD3转录水平。为了保证实验结果的可靠性，每一次qRT-PCR实验至少重复三次，分别为三个独立RNA样品。水稻Actin1被用作内参，使用的引物在表1中显示。如图2A所示，结果表明与WT相比，敲除突变体(nlp4-1，nlp4-2)分蘖部位的OsD3的表达水平升高，而OsNLP4过表达株系(OE-1和OE-9)分蘖部位的OsD3的表达水平则降低。因此推测OsD3可能作为OsNLP4潜在的负调控靶基因参与SL信号通路来影响水稻的分蘖。
2.OsNLP4对OsD3启动子区域的结合能力分析
为了进一步验证OsNLP4是否直接结合OsD3基因的启动子调控其表达，我们采用染色质免疫共沉淀(ChIP)定量PCR、凝胶迁移实验(EMSA)和双荧光素酶报告基因系统这三种生化手段进行验证。
首先，我们进行ChIP实验分析OsNLP4是否可以结合到OsD3启动子上。用水培培养14天大小的OsACTIN1pro:OsNLP4-GFP水稻(该转基因水稻所转化的载体采用GatewayTechnology高通量构建载体的方法，具体参考文献：汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)幼苗作为实验样品，野生型作为对照。称取3-4g样品用1％甲醛在真空条件中交联10min进行固定，然后加入125mM甘氨酸中止反应。随后样品在液氮中冷冻并研磨成粉末，通过低温(4℃)超声将染色质碎片化至平均大小400-600bp。最后用GFP-trap(Bimake,B23202)磁珠对上述步骤获得的蛋白质DNA复合物的免疫沉淀并以无抗体沉淀的染色质为内参，采用qRT-PCR检测基因富集水平。相关引物序列见表1。将富集的DNA片段进行ChIP-qPCR分析，最终结果如图2B所示，相对于野生型，OsACTIN1pro:OsNLP4-GFP材料富集到更高丰度的含有类NRE元件的OsD3启动子片段，表明OsNLP4可以直接结合到OsD3基因启动子片段上。
紧接着，我们采用EMSA实验分析OsNLP4是否直接结合OsD3启动子区域的类NRE元件。通过将OsNLP4的CDS片段构建进pET30a表达载体中，然后将载体转化进大肠杆菌Rosseta菌株(DE3)进行蛋白表达，从而获得了MBP-OsNLP4融合蛋白和MBP蛋白。同时对OsD3启动子上的NRE-like顺式元件片段进行人工合成，并在其DNA末端标记生物素作为目标探针。使用相同序列的未标记生物素片段作为竞争性探针。EMSA使用Thermo Scientific公司的
化学发光EMSA试剂盒(cat#20148)进行。每个反应在0.5×TBE缓冲液中上样到2％的天然琼脂糖凝胶上进行电泳。检测结果使用CCD摄像系统(GE Healthcare,ImageQuant LAS 4000)。通过EMSA对OsNLP4与OsD3启动子上的NRE-like顺式元件片段的结合情况进行分析，如图2C所示，OsNLP4蛋白可以结合到OsD3探针上，且该结合可以被竞争性探针抑制，说明该结合为特异性结合。以上实验结果证明了OsNLP4可以直接结合OsD3启动子的NRE-like顺式元件。
最后，尽管OsD3在OsNLP4遗传材料的转录水平表明OsNLP4很可能抑制OsD3的表达(见图1A所示)，为了验证这一推测，发明人利用双荧光素酶系统对OsNLP4与OsD3之间的调控作用进行了实验分析。通过将OsNLP4的CDS序列构建入表达载体pAN580中，将OsD3的启动子片段及NRE-like顺式元件片段(cis片段)分别构建进LUC系统载体pGreenⅡ-0800载体(该载体采用Gateway Technology高通量构建载体的方法，具体参考文献：汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)中后，将这些载体瞬转入水稻原生质体中进行表达，12-18h后用试剂盒(Vazyme，cat#DL101-01)检测LUC与REN值并算出比值来分析结果，如图2D所示，无论是OsD3的启动子片段还是cis片段，OsNLP4均对其表现出了抑制作用。这些结果表明了OsNLP4可以直接结合到OsD3的启动子NRE-like顺式元件区域并抑制其转录。
实例3：OsNLP4抑制OsD3下游SL信号通路
为了验证OsNLP4是否通过降低OsD3的表达，抑制其下游的SL信号通路进而促进水稻的分蘖，本发明的发明人分别检测了OsD3的负向靶蛋白OsD53在OsNLP4遗传材料中的蛋白水平以及OsD53的靶基因OsCKX9与OsFC1在OsNLP4遗传材料中的转录水平。
1.OsD53在OsNLP4遗传材料中的蛋白水平
本实验的样品来自实施例1中生长30天的OsNLP4遗传材料分蘖基部组织，用液氮研磨至粉末，使用RIPA裂解缓冲液(Beyotime,China,cat#P0013B)对这些粉末进行提取，随后离心获得的上清液即为蛋白提取物。蛋白质提取物通过SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维膜上用于观察OsNLP4遗传材料中OsD53的蛋白水平。蛋白印迹(Western blotting)实验所使用的抗体如下：anti-OsD53(兔源，抗体由河南大学王学路教授实验室制备(Strigolactones and brassinosteroids antagonistically regulate the stabilityof D53-OsBZR1complex to determine FC1 expression in rice tillering.MolecularPlant.13:586-597(2020))；Anti-ACTIN(M20009，鼠源，Abmart公司)；Goat anti-mouselgG-HRP(M21001，Abmart)；Goat anti-rabbit lgG-HRP(M21002，Abmart)。结果如图3A所示，与野生型相比，OsD53蛋白水平在OsNLP4基因敲除株系中较低(nlp4-1与nlp4-2的OsD53蛋白水平相比WT分别降低了50％和84％)，而在OsNLP4过表达株系较高(OE-1与OE-9的OsD53蛋白水平分别是WT的3.1倍和2.8倍)。
2.OsD53下游靶基因OsCKX9与OsFC1在OsNLP4遗传材料中的转录水平
本实验选用在土壤中生长了30天的水稻的分蘖基部进行RNA抽提并反转录为cDNA，用于检测OsNLP4遗传材料中的OsCKX9与OsFC1的转录水平(具体步骤同实施例2.1)。如图3B所示，结果表明与WT相比，OsNLP4过表达株系OE-1与OE-9中的OsCKX9的转录水平相比WT分别下调了18.5％和37.5％，OsFC1的转录水平分别下调了14.2％和38.7％。而在OsNLP4基因敲除株系则相反，nlp4-1与nlp4-2株系的OsCKX9的转录水平分别是WT的2倍和2.1倍，它们的OsFC1转录水平分别是WT的1.5倍和1.3倍。由于OsD53对OsCKX9与OsFC1的表达均是起抑制作用的，在OsNLP4过表达株系中OsD53蛋白水平较高，因此对其下游靶基因OsCPX9与OsFC1的抑制作用更强，所以转录水平下降，同理在OsNLP4基因敲除株系的OsD53蛋白水平较低，因此OsCKX9与OsFC1的表达水平会更高，这一结果符合预期。
综上所述，OsNLP4通过抑制OsD3的表达以及下游的SL信号通路促进水稻分蘖。
实例4：OsNLP4与OsD3在同一遗传途径并位于OsD3的上游
为了获得OsNLP4负调控OsD3的遗传证据，发明人通过CRISPR/Cas9技术分别获得了中花11背景和OsNLP4基因敲除株系nlp4-1背景的2个OsD3功能缺失突变体d3和d3 nlp4-1。两个突变体均在突变位点缺失1个碱基(图4A)。将野生型中花11(ZH11)、OsNLP4基因敲除株系(nlp4-1)、OsD3基因敲除株系(d3)和OsD3OsNLP4双基因敲除株系(d3 nlp4-1)的种子用蒸馏水清洗干净，然后在37℃恒温培养箱中孵育3天。待种子萌发后将其转移至装满土壤的方型花盆(花盆尺寸15×15×15cm)中，然后放置在一个提供12h光照(30℃)/12h黑暗(28℃)循环生长条件的温室中培养。发明人对土壤培养60天的野生型(WT)、nlp4突变体株系(nlp4-1)、d3突变体株系以及d3 nlp4-1双突突变体株系分蘖表型进行观察和对分蘖的数目进行统计，结果如图4B和4C所示。nlp4-1植株的分蘖数相比WT减少了35.2％，而在nlp4-1植株中敲除OsD3基因的植株(即d3 nlp4-1)分蘖数目显著增加，比nlp4-1增加了7.04倍，是WT的5.2倍，这说明d3 nlp4-1恢复了nlp4-1分蘖减少的表型，更加趋向于d3的分蘖表型。这些结果从遗传证据上说明OsNLP4与OsD3在同一遗传途径中并位于OsD3的上游，也进一步证明了OsNLP4通过降低OsD3的表达，抑制SL信号通路提高水稻分蘖数。
序列
SEQ ID NO:1OsNLP4氨基酸序列
MEEGDPQPSISLARTPSEGAAAAVDLDLLEQLLSADNAWLEVAANTSRSPNFF
ATPSNCLTDASVATTTPANSWWIQPSGASTSVRERFDQALAYIRETQSDADVLV
QLWVPVKGNDGQLVLTTSGQPFTLDQRSNSLIQFREVSTKYQFSADVASGSSP
GLPGRVFIGRLPEWSPDVRYFTSYEYPRINHAQYLDVHGTMGLPVFERGNYSC
LGVIELIMTKQKLNFTSELNTICSALQAVNLTSTEVSSIPRAKLNSASYKDALPE
ILEVLRAACITHKLPLAQTWVTCAQQGKRGSRHSDENYKYCISTIDAACYVN
EPRMQSFHEACSEHHLLRGQGVAGKAFTTNQPCFLPDIGSSTKLEYPLSHHAK
IFNLKGAVAIRLRCTRTGIADFVLEFFLPTDCEVLEEQKAVLDSLSGTMRSVCQ
TLRVVTDKEMEDEAMREMNELNSFSPRGKNKVEELSFGDNTRGDREEASWT
TLVGTSQKGSDLAELHTHGMLSHGGHGSSQAGDQTSKEGSKVKRRTKTEKT
VSLQVLRQYFAGSLKDAAKSLGVCPTTLKRICRQHGINRWPSRKIKKVDHSLR
KLQQIIDSVHGAETAFQLNTLYKDLTNTSVSSDNNLSGSVTVPLANQNNLDFE
MHQHHRLSSNIPSTSLSHSSCSQSSDSSPSCSGGATKHSPQVGADQVRSGCLPQ
HSPVQTLQTEAASINEHFSGQEAPIDLLQDVAEKANGEQHMSQSPSSPKQTAN
VGMRVKVTFGSEKVRFRLKPECDFQELKQEISKRLSIADMNSLIVKYLDDDSEWVLMTCDADLHECFHVYKLADIQTIKISVHLAASPTTRITIGHTGFS*
SEQ ID NO:2OsNLP4-CDS
ATGGAAGAGGGAGACCCCCAGCCCAGCATCTCCTTGGCACGCACTCCGTC
GGAAGGCGCGGCGGCGGCAGTCGACTTGGATCTCCTTGAGCAGCTTCTCT
CAGCCGACAACGCCTGGCTTGAAGTGGCAGCAAACACTTCACGCTCACCC
AACTTCTTTGCTACCCCCTCCAACTGCTTGACAGATGCTTCGGTCGCCACC
ACCACACCTGCAAATTCATGGTGGATTCAGCCGAGCGGTGCAAGCACCTC
AGTTCGGGAACGGTTTGACCAAGCTCTAGCTTACATCAGGGAGACACAGA
GCGACGCCGATGTGCTTGTGCAGCTCTGGGTGCCAGTCAAGGGCAACGAT
GGTCAGCTGGTGTTGACGACGAGCGGGCAGCCATTCACTCTCGATCAGAG
GTCCAATAGCCTCATACAGTTCAGGGAGGTTTCGACAAAGTACCAGTTCTC
TGCAGATGTTGCTTCAGGTTCCTCACCTGGGCTACCAGGGAGGGTGTTCAT
CGGTAGGCTTCCTGAATGGTCACCAGACGTTCGATACTTCACCAGCTATGA
GTACCCTAGGATCAACCATGCACAATATTTGGATGTCCACGGGACGATGGG
GCTGCCGGTGTTTGAGAGGGGGAACTACTCATGCTTAGGTGTCATCGAGTT
GATCATGACCAAGCAGAAGCTCAACTTCACCTCCGAGCTCAATACCATTTG
CAGTGCTCTCCAGGCAGTTAACCTGACAAGCACAGAAGTTTCAAGCATTCC
GCGCGCAAAGCTTAACAGTGCTTCCTACAAAGATGCTTTACCAGAGATACT
AGAAGTCCTGAGAGCAGCCTGCATCACCCACAAGCTACCATTAGCTCAGA
CCTGGGTCACATGTGCTCAACAAGGAAAGCGGGGCAGTCGCCATTCTGAC
GAGAACTACAAGTACTGCATTTCCACCATTGATGCAGCATGCTATGTGAATG
AACCCCGGATGCAGAGCTTCCACGAGGCCTGCTCCGAACACCACCTGCTA
CGGGGGCAGGGGGTTGCAGGGAAAGCCTTCACCACAAACCAGCCATGCTT
CCTACCAGATATTGGATCCTCCACTAAACTGGAGTACCCATTGTCTCACCAT
GCTAAGATTTTCAATTTAAAAGGTGCAGTGGCAATCCGATTGCGTTGCACG
CGCACAGGGATTGCCGACTTTGTGCTAGAGTTCTTTCTGCCAACTGACTGT
GAAGTACTTGAGGAGCAGAAGGCAGTGCTGGACTCATTATCAGGCACCAT
GAGAAGTGTTTGCCAAACTTTACGTGTTGTTACTGACAAGGAGATGGAGGA
TGAGGCCATGAGAGAAATGAATGAGCTGAACTCATTTAGTCCTCGGGGCAA
GAACAAAGTTGAGGAGTTATCCTTTGGAGACAACACAAGAGGGGATAGAG
AGGAGGCATCTTGGACAACCTTAGTAGGGACTTCACAGAAAGGATCAGAT
TTAGCTGAATTGCATACACATGGAATGTTATCACATGGAGGGCATGGTTCAT
CTCAAGCTGGTGATCAAACAAGTAAAGAAGGTAGCAAAGTGAAAAGGCGT
ACAAAGACGGAGAAGACCGTGAGCTTGCAGGTCCTTCGGCAGTACTTTGC
TGGGAGCCTGAAGGATGCAGCAAAGAGCCTTGGAGTGTGCCCAACCACCC
TGAAAAGAATATGCAGGCAGCATGGCATAAACCGCTGGCCATCACGGAAG
ATAAAGAAAGTAGACCATTCTCTAAGGAAACTGCAGCAAATCATTGATTCA
GTTCATGGAGCAGAGACAGCTTTCCAGCTTAACACCCTCTACAAGGACCTC
ACAAACACCTCTGTATCATCTGACAACAATTTGTCAGGAAGTGTCACAGTT
CCTCTGGCTAACCAGAACAATCTAGACTTTGAAATGCACCAACACCACAGG
TTAAGCAGCAATATTCCATCGACTTCACTCTCACACTCATCATGCAGCCAAA
GTTCCGATTCAAGCCCTTCCTGCAGTGGAGGAGCAACAAAACATTCACCCC
AGGTTGGAGCTGATCAGGTGAGGTCAGGATGTCTTCCACAACATAGCCCTG
TCCAGACTCTGCAAACAGAAGCTGCTTCAATAAATGAACATTTCTCAGGTC
AGGAAGCACCAATAGATCTCTTACAGGATGTTGCTGAAAAGGCAAATGGTG
AACAGCACATGTCTCAAAGTCCATCATCCCCCAAGCAGACTGCAAATGTAG
GTATGAGAGTAAAGGTCACTTTTGGCTCAGAAAAGGTGAGGTTCAGATTG
AAACCTGAGTGTGACTTTCAAGAACTGAAGCAGGAGATATCAAAACGTCT
GAGTATAGCAGACATGAATTCCTTGATTGTAAAGTATTTGGATGACGATTCA
GAATGGGTCTTGATGACATGTGATGCAGATTTACACGAGTGTTTTCATGTTT
ATAAACTAGCAGATATCCAAACAATCAAGATTTCAGTTCATCTGGCTGCTAG
TCCAACAACAAGGATCACCATTGGTCACACTGGTTTCTCATGA
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.蛋白质OsNLP4的应用，其特征在于：所述应用为如下A1)-A3)中的至少一种：
A1)调控植物分蘖；
A2)调控植物D3基因的表达量；
A3)调控植物独角金内酯信号通路；
所述蛋白质OsNLP4，为如下a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)所述蛋白质OsNLP4氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
a2)由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加得到的、来源于水稻的具有相同生物学功能的蛋白质；
a4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％以上同源性、来源于水稻且具有相同生物学功能的蛋白质。
2.蛋白质OsNLP4的应用，其特征在于：所述应用为如下B1)-B3)中的至少一种：
B1)与权利要求1中所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料在调控植物分蘖中的应用；
B2)与权利要求1中所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料在调控植物D3基因的表达量中的应用；
B3)与权利要求1中所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料在调控植物独角金内酯信号通路中的应用；
所述生物材料为下述c1)-c7)中的任意一种：
c1)编码权利要求1所述蛋白质OsNLP4的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体，或含有c2)所述核酸分子表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物，或含有c2)所述核酸分子表达盒的重组微生物，或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系，或含有c2)所述核酸分子表达盒的转基因植物细胞系；
c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织，或含有c2)所述核酸分子表达盒的转基因植物组织；
c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官，或含有c2)所述核酸分子表达盒的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
c1)所述核酸分子为下述d1)-d4)中的任意一种：
d1)编码区为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
d2)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有80％以上同源性，来源于水稻且编码权利要求1所述蛋白质OsNLP4的DNA分子；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，来源于水稻且编码权利要求1所述蛋白质OsNLP4的DNA分子。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于：
所述调控植物分蘖为增加植物有效分蘖；
所述调控植物D3基因的表达量为降低植物D3基因的表达量；
所述调控植物独角金内酯信号通路为抑制植物独角金内酯信号通路。
5.一种培育转基因植物的方法，其特征在于：
包括向受体植物中导入提高权利要求1所述蛋白质OsNLP4的含量和/或活性的物质，得到转基因植物的步骤；
所述转基因植物与受体植物相比，所述转基因植物至少具有以下一种特性：
1)植物有效分蘖增加；
2)植物D3基因表达量降低；
IB236014
3)植物独角金内酯信号通路受抑制。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述提高权利要求1所述蛋白质OsNLP4含量和/或活性的物质，为权利要求2或3中所述蛋白质OsNLP4相关的生物材料。
7.如权利要求1至4中任一项所述的应用或权利要求5至6中任一项所述的方法，其特征在于：
所述植物为以下e1)至e5)中的任意一种：
e1)双子叶植物；e2)单子叶植物；e3)禾本科植物；e4)水稻；e5)水稻品种中花11。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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