CN102424825B - 榛子叶片和花芽总rna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从植物组织中提取总RNA的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1)将植物组织与PVP和维生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物组织、所述PVP和所述维生素C的配比为0.2g∶0.01g∶0.01g；2)将步骤1)得到的粉末加入到55-65℃的提取液中，55-65℃保温10min，得到样品混合液；3)对步骤2)得到的样品混合液进行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到总RNA；所述抽提为用氯仿/异戊醇进行的抽提。所述提取液含有3％的CTAB、100mM的Tris-c1(pH8.0)、25mM的EDTA(pH8.0)、2M的NaCl、5％的β-巯基乙醇、3％的PVP、0.05％的三盐酸亚精胺等。实验证明，本发明所提供的方法能够从植物组织，如榛子的幼叶、雄花芽或成熟叶片中提取得到高质量的总RNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种从植物组织中提取总RNA的方法，特别涉及一种从富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物的植物组织中提取总RNA的方法。
背景技术
榛属于榛科(Corylaceae)榛属(Corylus L)树种，是珍贵的木本粮油资源，榛仁含脂肪、蛋白质、碳水化合物、还含有维生素C、E和多种矿物质，榛子的果壳可以作为制造活性碳的原料。树皮和果苞含单宁，可制栲胶，榛子树叶、树皮和果仁中发现有抗癌物紫杉醇，具有很高的经济价值(张宇和，柳鎏，等.中国果树志[M].北京：中国林业出版社.2005：1-248.聂洪超，孙万河，等.杂交榛子生产上存在的问题及发展建议[J].北方果树.2010，(6)：46-47.)。
近年来，随着分子生物学的日益普及，国内外也逐渐开始利用分子生物学手段SSR(魏鑫，魏永祥，王颖，等.平欧杂种榛ISSR反应体系的优化与验证[J].北方园艺.2010，(4)：125-128.Kahraman Gürcan，Shawn A.Mehlenbacher.Development ofmicrosatellite marker loci for European hazelnut(Corylus avellana L.)from ISSRfragments[J].Mol Breeding.2010，(26)：551-559.)、RAPD(Shawn A.Mehlenbacher，Rebecca N.Brown，Eduardo R.Nouhra，Tufan Gükirmak，Nahla V.Bassil，ThomasL.Kubisiak.A genetic linkage map for hazelnut(Corylus avellana L.)based on RAPD andSSR markers[J].Genome.2006，(49)：122-133.)、RT-PCR以及免疫组织定位(D.Rigola，M.E.Pè，M.Sari-Gorla.A cDNA clone from hazelnut(Corylus avellana L.)encoding a lowmolecular weight heat shock protein expressed in the reproductive structures[J].Sex PlantReprod.1998，(11)：29-30.)等技术对榛子的物种遗传多样性、亲缘关系、基因克隆、蛋白定位等进行研究。而从榛子中提取高质量的总RNA是进行这些研究的基础和关键。
榛子叶片以及花芽富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物，多糖的很多理化性质与RNA相似，很难将其分开，而多酚易被氧化成褐色的醌类物质，会使RNA降解，RNase和多酚氧化酶都属于蛋白质，要获得完整的、高质量的总RNA就必须能够去除蛋白，次生代谢产物则易与RNA结合，阻碍RNA的分离。因此，去除多糖、蛋白和次生代谢物质、抑制多酚的氧化是榛子总RNA提取成败的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种从植物组织中提取总RNA的方法，该方法特别适用于从富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物的植物组织榛子中提取总RNA。
本发明所提供的从植物组织中提取总RNA的方法称为改良CTAB法，包括如下步骤：
1)将植物组织样品与聚乙烯吡咯烷酮和维生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物组织样品、所述聚乙烯吡咯烷酮和所述维生素C的配比为0.2g∶0.01g∶0.01g；
2)将步骤1)得到的粉末加入到55-65℃的提取液中，55-65℃水浴10min，得到样品混合液；
所述提取液的溶剂为水(DEPC与水体积比为1∶1000的DEPC水)，溶质为十六烷基三甲基溴化铵、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三盐酸亚精胺、聚乙烯咯烷酮(简写PVP，分子式(C6H9NO)n)；Solarbio公司的，商品目录号是P8290，分子量：40000；纯度：＞99％)、氯化钠、β-巯基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化铵在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化铵，所述Tris-Cl的终浓度为100mM(pH8.0)，所述乙二胺四乙酸的终浓度为25mM(pH8.0)，所述三盐酸亚精胺在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有0.05g所述三盐酸亚精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化钠的终浓度为2M，所述β-巯基乙醇的终浓度为体积百分含量5％。由于β-巯基乙醇易降解，在配制所述提取液时，β-巯基乙醇在所述提取液使用之前(水浴之后加入样品之前加到提取液中)加入。
3)对步骤2)得到的样品混合液进行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到总RNA；所述抽提为用氯仿/异戊醇进行的抽提；所述氯仿/异戊醇是由氯仿与异戊醇按照24∶1的体积比混合得到的混合物。
在本发明的实施例中，所述植物样品具体为按照如下方法得到的样品：将新鲜的的植物组织置于液氮中速冻后-80℃保存(抑制内源RNase的活性)，得到所述植物组织样品。
所述氯仿/异戊醇在抽提体系中体积百分含量可为50％。步骤3)中所述RNA的沉淀包括用LiCl对所述RNA进行沉淀的步骤；所述LiCl在沉淀体系中的终浓度为2M。步骤3)中所述RNA的沉淀还包括用无水乙醇对所述RNA进行沉淀的步骤。
在本发明的实施例中，所述RNA的抽提和所述RNA的沉淀具体包括如下步骤：
a)向所述样品混合液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
b)向步骤a)得到的上清液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混匀，于4℃，12000r/min离心10min，回收上清液；
c)向步骤b)得到的上清液中加入LiCl，使其终浓度为2M，混匀后于4℃放置过夜，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
d)将步骤c)所得的RNA沉淀用75％乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；
e)将步骤d)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液溶解，加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混匀，于4℃，12000r/min离心10min，回收上清液；所述SSTE缓冲液的溶剂为水(DEPC与水体积比为1∶1000的DEPC水)，溶质为NaCl、十二烷基磺酸钠、Tris-Cl和EDTA；所述NaCl的终浓度为0.5M，所述十二烷基磺酸钠在所述SSTE缓冲液中的含量为每100ml所述SSTE缓冲液中含有0.5g所述十二烷基磺酸钠，所述Tris-Cl的终浓度为10mM(pH8.0)，所述EDTA的终浓度为1mM(pH8.0)。
f)向步骤e)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，于-20℃放置2h，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
g)将步骤f)得到的RNA沉淀用75％乙醇洗两次，再用无水乙醇洗一次，自然干燥，溶于100μl DEPC水，得到所述总RNA。
本发明的另一个目的是提供一种从植物组织中提取总RNA的提取液。
本发明所提供的提取液的溶剂为水(DEPC与水体积比为1∶1000的DEPC水)，溶质为十六烷基三甲基溴化铵、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三盐酸亚精胺、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、β-巯基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化铵在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化铵，所述Tris-Cl的终浓度为100mM(pH8.0)，所述乙二胺四乙酸的终浓度为25mM(pH8.0)，所述三盐酸亚精胺在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有0.05g所述三盐酸亚精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化钠的终浓度为2M，所述β-巯基乙醇的终浓度为体积百分含量5％。由于β-巯基乙醇易降解，在配制所述提取液时，β-巯基乙醇在所述提取液使用之前加入。
所述植物组织可为富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物的植物组织。在本发明的实施例中，所述植物组织具体为榛子组织，如榛子的幼叶、雄花芽或成熟叶片。
本发明所提供的改良CTAB法，提取液中3％(w/v)的CTAB可以使蛋白质变性凝聚，进一步用氯仿抽提去除蛋白质；提取液中β-巯基乙醇、PVP的浓度分别加大至5％(v/v)、3％(w/v)，还加入了0.05％(w/v)三盐酸亚精胺，这抑制了酚类的氧化，并去除未氧化的酚类化合物；提取液中用了高浓度的NaCl，沉淀步骤使用了高浓度的LiCl将部分多糖留在上清液中，通过氯仿抽提可以除去一些多糖。这些试剂增强了榛子植物组织的裂解能力，提供了还原条件，使RNase活性抑制和变性的物质强力抑制了多酚的氧化，在一定程度上去除蛋白、多糖的效果显然非常好，此法提到的总RNA产量也比较高。
实验证明，与CTAB法和改良SDS法相比，本发明所提供的改良CTAB法更适合榛子总RNA的提取，所获得的榛子叶片和雄花芽总RNA完整性更好，检查得出纯度和产量更高以及蛋白、多糖和酚类物质去除也更加彻底。所获得的总RNA能够满足后续试验的需求，是一种比较理想的榛子幼叶和雄花芽总RNA提取方法，随着榛子叶片不断成熟，各种水解酶大量积累，多酚和多糖的含量也随之增加，因此榛子成熟叶片总RNA的提取难度更大，成熟叶片的效果较嫩叶和雄花芽稍差一些，但提取效果仍明显优于CTAB法和改良SDS法。
附图说明
图1为榛子幼叶总RNA样品的电泳结果。其中，A为改良CTAB法提取结果(泳道1-3为3个重复)；B为CTAB法提取结果(泳道1-2为2个重复)；C为改良SDS法提取结果(泳道1-2为2个重复)。
图2为榛子雄花芽总RNA样品的电泳结果。其中，A为改良CTAB法提取结果(泳道1-3为3个重复)；B为CTAB法提取结果；C为改良SDS法提取结果(泳道1-2为2个重复)。
图3为榛子成熟叶片总RNA样品的电泳结果。其中，A为改良CTAB法提取结果(泳道1-2；B为CTAB法提取结果(泳道3-5为3个重复)；C为改良SDS法提取结果(泳道1-2为2个重复)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
溶液的配制：
(1)DEPC水：1000ml超纯水中加入1000μl焦碳酸二乙酯(DEPC)，摇匀，通风橱中过夜，第二天早上摇匀，121℃湿热灭菌1h，摇匀，冷却后备用，以下用到的所有溶液都需要用0.1％(v/v)DEPC水配制。
(2)1M Tris-Cl(pH＝8.0)500ml：称60.5g Tris-Cl溶于约400ml DEPC水中，浓盐酸调节pH至8.0，定容至500ml。
(3)0.5M EDTA(pH＝8.0)500ml：称取93.05g Na2EDTA·2H2O和10gNaOH，溶于350ml DEPC水，溶解后，用5M的NaOH(DEPC水溶液)调节pH至8.0，定容至500ml。
(4)5M NaCl：146g NaCl溶于500ml DEPC水中。
(5)10％SDS 500ml：50gSDS，溶解于500ml DEPC水中。
(6)10M LiCl 200ml：84.8g无水氯化锂溶于200ml DEPC水中。
(7)改良CTAB的提取液：终浓度为3％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、终浓度为100mM Tris-Cl(pH8.0)、终浓度为25mM的乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)、终浓度为2M的NaCl、终浓度为3％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Solarbio公司，商品目录号是P8290，分子量：40000；纯度：＞99％)、终浓度为0.05％(w/v)的三盐酸亚精胺、终浓度为5％(体积百分含量)的β-巯基乙醇(易降解，使用时现加)。
(8)SSTE缓冲液：终浓度为0.5M的NaCl、终浓度为0.5％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)、终浓度为10mM的Tris-Cl(pH＝8.0)、终浓度为1mM的EDTA(pH＝8.0)。
(9)10×RNA上样缓冲液(10×loading buffer)：终浓度为60％(体积百分含量)的甘油、终浓度为0.25％(w/v)的溴酚蓝、终浓度为10mM的EDTA(pH＝8.0)、终浓度为100mM的Tris-Cl(pH＝8.0)，使用时用DEPC处理水稀释成1×loading buffer。
(10)10×TBE：称取108g Tris，7.44g Na2EDTA·2H2O，55g硼酸，溶于800ml的DEPC水中，搅匀；用NaOH调节pH8.3，DEPC处理水定容至1L，室温保存。使用时稀释成1×TBE。
塑料制品和玻璃器皿的灭菌处理：塑料制品和玻璃器皿都121℃，高压灭菌60min，最好使用进口的枪头及离心管；电泳槽、制胶槽以及梳子用0.5M EDTA和5M NaOH(0.5M EDTA 500ul、5M NaOH 5ml、DEPC水定容至250ml)浸泡2小时，75％乙醇冲洗，晾干备用；用75％的乙醇拭擦移液枪内部和外部。
24×1.5/2ml离心管使用离心机型号：Sorval Primo-R台式高速冷冻离心机；6×50ml离心管使用离心机型号：德国heraeus Bifuge Stratos全能台式高速离心机。
实施例1、从榛子幼叶提取总RNA样品及其鉴定
一、榛子幼叶总RNA样品的提取
试验地设在位于北京市西郊鹜峰林场实验基地。2010年春季3月底，采集平欧杂交榛达维(育种代号84-254)(张宇和，柳鎏，等.中国果树志板栗榛子卷[M].北京：中国林业出版社.2005：1-248.)带芽枝条带回室内得到水培幼叶。
下面将详述如何利用改良CTAB法从榛子幼叶提取较高质量的总RNA样品，具体操作步骤如下：
1)采样：2010年3月底采集榛子(平欧杂交榛达维，育种代号84-254)带芽枝条室内水培，一周后采集水培抽出的幼叶，将其经液氮速冻后立即置于-80℃冰箱中保存(液氮速冻的目的是抑制内源RNase的活性)，得到样品1；
2)向50ml无菌离心管中加入10ml改良CTAB提取液，于65℃水浴锅中预热约10min；
3)取约0.2g步骤1)制备的样品1，置于预冷的研钵中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和维生素C(PVP和维生素C各0.01g)，用液氮充分研磨成粉，得到样品2；
4)迅速将步骤3)研好的粉末(样品2)倒入步骤2)预热的改良CTAB提取液中，65℃水浴10min，期间振荡1次，使其混匀，得到样品混合液3；
5)向步骤4)得到的样品混合液3中加入等体积的氯仿异戊醇(氯仿/异戊醇体积比为24∶1)，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
6)向步骤5)得到的上清液中加入等体积氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
7)向步骤6)得到的上清液中加入1/4体积的10M的LiCl，混匀后于4℃放置过夜，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
8)将步骤7)所得的RNA沉淀用预冷的75％乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；
9)将步骤8)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液(如果用的是1.2ml的离心管，加500ul即可；一般是加所用离心管的2/5体积即可)溶解，加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
10)向步骤9)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，于-20℃放置2h，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
11)将步骤10)得到的RNA沉淀用预冷的75％乙醇洗两次，再用预冷的无水乙醇洗一次，自然干燥5min(时间不宜太长，否则RNA不易溶解)，溶于100μl DEPC水，混匀，于-80℃保存备用(可长期保存于2倍无水乙醇中)，总RNA样品不易降解。
同时以CTAB法和改良SDS法作为对照。其中，所述CTAB法所用提取液配方为：终浓度为2％(w/v)的CTAB；终浓度为100mM的Tris-Cl；终浓度为25mM的EDTA；终浓度为2％(w/v)的PVP；终浓度为0.05％(w/v)的三盐酸亚精胺；终浓度为2％(v/v)的β-巯基乙醇。具体的提取步骤如下：(1)1.5ml无菌离心管中加入600μl提取液于65℃水浴锅中预热15min；(2)预冷研钵中放入0.1g植物材料，加少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和维生素C(PVP和维生素C各0.01g)，用液氮将0.1g叶片研磨成细末；(3)迅粉速将研后的细末装到预热的提取液中，65℃水浴10min；(4)加等量体积的氯仿异戊醇(24∶1)，振荡10min；(5)4℃，12000r/min离心15min；(6)取上清，加等量的氯仿异戊醇重复抽提，4℃，12000r/min离心10min；(7)收集上清液，加1/4体积10M的LiCl，混匀，4℃过夜；(8)4℃，12000r/min离心30min；(9)弃上清，DEPC水溶解沉淀，加入等体积氯仿异戊醇抽提；(10)4℃，12000r/min离心15min；(11)收集上清，加2倍体积无水乙醇于-20℃或冰上中放置2h，沉淀总RNA；(12)4℃12000r/min离心30min；(13)弃上清75％乙醇洗2次，无水乙醇冲洗一遍，超净台自然干燥15min；(14)加入50μl无RNAse的水溶解沉淀，-80℃保存备用。
改良SDS法提取液的配方为：终浓度为50mM的Tris-HCl(pH8.0)，终浓度为0.2M的NaCl；终浓度为25mM的EDTA；终浓度为4％(W/V)的SDS；终浓度为3％(W/V)的PVP；终浓度为15％(v/v)的乙醇；终浓度为5％(v/v)的β-巯基乙醇。具体的提取步骤如下：(1)取0.1g叶片于研钵中，加少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和维生素C(PVP和维生素C各0.01g)，加入液氮研磨成粉末状；(2)转入加有1ml 65℃预热的提取液中；(3)加入1ml酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，涡旋振荡混匀；(4)4℃12000r/min离心15min；(5)取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀；(6)4℃12000r/min离心15min；(7)取上清，加入1/4体积10M的氯化锂，-20℃放置2-3h或4℃过夜；(8)4℃12000r/min离心30min；(9)用75％乙醇清洗，DEPC水溶解沉淀，加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)抽提；(10)4℃12000r/min离心15min；(11)收集上清，加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置2-3h；(12)4℃12000r/min离心30min，弃上清，75％乙醇洗沉淀2次；(13)于通风橱中干燥后溶于50μl无RNAse的水中，-80℃保存备用。
二、榛子幼叶总RNA样品的鉴定
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取好坏，主要依据28SrRNA与18SrRNA电泳谱带的特征。如果带型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且约是18SrRNA的2倍，则表明所提取到的总RNA量大、质量高、未降解。利用分光光度计检测所提取的总RNA样品的浓度和纯度，若OD260/280在1.8-2.0之间，说明所提的总RNA较纯，无其他杂质的污染。
1、榛子幼叶总RNA完整性的检测
取1μl上述步骤一提取的总RNA样品，进行1％琼脂糖凝胶1×TBE电泳检测。由图1所示，本发明所提供的改良CTAB法提取的榛子幼叶总RNA样品，点样孔干净，条带清晰，无拖尾，所提到的RNA较完整，且28SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，说明提取过程中没有降解现象发生，而且在电泳检测中看不到蛋白质和多糖污染，所提的RNA纯净。而CTAB法提取的榛子幼叶总RNA，条带也比较清晰，28SrRNA亮度与18SrRNA相当，说明28SrRNA降解明显，条带有拖尾现象，DNA污染严重，有蛋白质、多糖等杂质污染，产量也较少；改良SDS法提取的榛子幼叶总RNA，不完整，28SrRNA降解明显，条带有拖尾，DNA、蛋白质、多糖等杂质污染严重。
2、榛子幼叶总RNA浓度和纯度的检测
上述步骤1以1％琼脂糖凝胶1×TBE电泳检测榛子幼叶总RNA完整性，其结果表明改良CTAB法提取榛子幼叶总RNA样品的效果比较好。以下为利用分光光度计检测上述步骤一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子幼叶总RNA样品的OD值，进一步比较这两种方法提取的产率和质量。
结果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的幼叶的OD260/280分别为2.04和1.80，在1.8-2.0之间，说明这两种方法方法所提取的RNA纯度较高，DNA、蛋白质和多糖污染少。但是，在RNA产率上看，改良CTAB法(每克榛子幼叶提取241.57μg总RNA)远比改良SDS法(每克榛子幼叶提取111.8μg总RNA)高。
本实施例的结果表明，综合上述三种方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能从榛子幼叶中提取到总RNA，相比较而言，改良CTAB法所提的总RNA较完整，条带清晰，得到了较高质量的RNA；同时改良CTAB法所提取的总RNA样品的产率也较高(每克榛子幼叶提取241.57μg总RNA)，这说明本发明所提供的改良CTAB法适合于榛子幼叶总RNA的提取。
实施例2、从榛子雄花芽提取总RNA样品及其鉴定
一、榛子雄花芽总RNA样品的提取
试验地设在位于北京市西郊鹜峰林场实验基地。2010年8月，采集平欧杂交榛达维(育种代号84-254)(张宇和，柳鎏，等.中国果树志板栗榛子卷[M].北京：中国林业出版社.2005：1-248.)雄花芽。
下面将详述如何利用改良CTAB法从榛子雄花芽提取较高质量的总RNA样品，具体操作步骤如下：
1)采样：2010年7月初采集榛子(平欧杂交榛达维，育种代号84-254)雄花芽，将其经液氮速冻后立即置于-80℃冰箱中保存(抑制内源RNase的活性)，得到样品1；
2)向50ml无菌离心管中加入10ml改良CTAB提取液，于65℃水浴锅中预热约10min；
3)取约0.2g步骤1)制备的样品1，置于预冷的研钵中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和维生素C(PVP和维生素C各0.01g)，用液氮充分研磨成粉，得到样品2；
4)迅速将步骤3)研好的粉末(样品2)倒入步骤2)预热的改良CTAB提取液中，65℃水浴10min，期间振荡1次，使其混匀，得到样品混合液3；
5)向步骤4)得到的样品混合液3中加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
6)向步骤5)得到的上清液中加入等体积氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
7)向步骤6)得到的上清液中加入1/4体积的10M的LiCl，混匀后于4℃放置过夜，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
8)将步骤7)所得的RNA沉淀用预冷的75％乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；
9)将步骤8)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液(如果用的是1.2ml的离心管，加500ul即可；一般是加所用离心管的2/5体积即可)溶解，加入等体积的氯仿与异戊醇(氯仿/异戊醇体积比为24∶1)，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
10)向步骤9)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，于-20℃放置2h，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
11)将步骤10)得到的RNA沉淀用预冷的75％乙醇洗两次，再用预冷的无水乙醇洗一次，自然干燥5min(时间不宜太长，否则RNA不易溶解)，溶于100μl DEPC水，混匀，于-80℃保存备用(可长期保存于2倍无水乙醇中)，总RNA样品不易降解。
同时以CTAB法和改良SDS法作为对照(具体方法同实施例1)。
二、榛子雄花芽总RNA样品的鉴定
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取好坏，主要依据28SrRNA与18SrRNA电泳谱带的特征。如果带型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且约是18SrRNA的2倍，则表明所提取到的总RNA量大、质量高、未降解。利用分光光度计检测所提取的总RNA样品的浓度和纯度，若OD260/280在1.8-2.0之间，说明所提的总RNA较纯，无其他杂质的污染。
1、榛子雄花芽总RNA完整性的检测
取1μl上述步骤一提取的总RNA样品，进行1％琼脂糖凝胶1×TBE电泳检测。由图2所示，本发明所提供的改良CTAB法提取的榛子雄花芽总RNA样品，点样孔干净，条带清晰，无拖尾，所提到的RNA较完整，且28SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，说明提取过程中没有降解现象发生，而且在电泳检测中看不到蛋白质和多糖污染，所提的RNA纯净；CTAB法提取的榛子雄花芽总RNA，条带也比较清晰，但是28SrRNA亮度与18SrRNA相当，说明28SrRNA降解明显，条带有拖尾现象，DNA污染严重，有蛋白质、多糖等杂质污染，产量也较少；改良SDS法提取的榛子雄花芽总RNA，不完整，28SrRNA降解明显，条带有拖尾，DNA、蛋白质、多糖等杂质污染严重。
2、榛子雄花芽总RNA浓度和纯度的检测
上述步骤1以1％琼脂糖凝胶1×TBE电泳检测榛子雄花芽总RNA完整性，其结果表明改良CTAB法提取榛子雄花芽总RNA样品的效果相对比较好。以下为利用分光光度计检测上述步骤一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子雄花芽总RNA样品的OD值，进一步比较这两种方法提取的产率和质量。
结果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的雄花芽的OD260/280分别为2.01和1.08，这说明，相比改良SDS法，改良CTAB法所提取的RNA纯度较高，DNA、蛋白质和多糖污染少。同时，在RNA产率上看，改良CTAB法(每克榛子雄花芽提取199.53μg总RNA)远比改良SDS法(每克榛子雄花芽提取60.01μg总RNA)高。
本实施例的结果表明，综合上述三种方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能从榛子雄花芽中提取到总RNA，相比较而言，改良CTAB法所提的总RNA较完整，条带清晰，得到了较高质量的RNA；同时改良CTAB法所提取的总RNA样品的产率也较高(每克榛子雄花芽提取199.53μg总RNA)，这说明本发明所提供的改良CTAB法适合于榛子雄花芽总RNA的提取。
实施例3、从榛子成熟叶片提取总RNA样品及其鉴定
一、榛子成熟叶片总RNA样品的提取
试验地设在位于北京市西郊鹜峰林场实验基地。2010年8月，采集平欧杂交榛达维(育种代号84-254)(张宇和，柳鎏，等.中国果树志板栗榛子卷[M].北京：中国林业出版社.2005：1-248.)的成熟叶片。
下面将详述如何利用改良CTAB法从榛子成熟叶片提取较高质量的总RNA样品，具体操作步骤如下：
1)采样：采集榛子(平欧杂交榛达维，育种代号84-254)的成熟叶片，将其经液氮速冻后立即置于-80℃冰箱中保存(抑制内源RNase的活性)，得到样品1；
2)向50ml无菌离心管中加入10ml改良CTAB提取液，于65℃水浴锅中预热约10min；
3)取约0.2g步骤1)制备的样品1，置于预冷的研钵中，加入少量聚乙聚烯吡咯烷酮(PVP)和维生素C(PVP和维生素C各0.01g)，用液氮充分研磨成粉，得到样品2；
4)迅速将步骤3)研好的粉末(样品2)倒入步骤2)预热的改良CTAB提取液中，65℃水浴10min，期间振荡1次，使其混匀，得到样品混合液3；
5)向步骤4)得到的样品混合液3中加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
6)向步骤5)得到的上清液中加入等体积氯仿异戊醇(氯仿/异戊醇的体积比为24∶1)，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
7)向步骤6)得到的上清液中加入1/4体积的10M的LiCl，混匀后于4℃放置过夜，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
8)将步骤7)所得的RNA沉淀用预冷的75％乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；
9)将步骤8)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液(如果用的是1.2ml的离心管，加500ul即可；一般是加所用离心管的2/5体积即可)溶解，加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
10)向步骤9)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，于-20℃放置2h，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
11)将步骤10)得到的RNA沉淀用预冷的75％乙醇洗两次，再用预冷的无水乙醇洗一次，自然干燥5min(时间不宜太长，否则RNA不易溶解)，溶于100μl DEPC水，混匀，于-80℃保存备用(可长期保存于2倍无水乙醇中)，获得较纯的总RNA样品。
同时以CTAB法和改良SDS法作为对照(具体方法同实施例1)。
二、榛子成熟叶片总RNA样品的鉴定
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取好坏，主要依据28SrRNA与18SrRNA电泳谱带的特征。如果带型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且约是18SrRNA的2倍，则表明所提取到的总RNA量大、质量高、未降解。利用分光光度计检测所提取的总RNA样品的浓度和纯度，若OD260/280在1.8-2.0之间，说明所提的总RNA较纯，无其他杂质的污染。
1、榛子成熟叶片总RNA完整性的检测
取1μl上述步骤一提取的总RNA样品，进行1％琼脂糖凝胶1×TBE电泳检测。由图3所示，本发明所提供的改良CTAB法提取的榛子成熟叶片总RNA样品，点样孔干净，条带清晰，无拖尾，所提到的RNA较完整，且28SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，说明提取过程中没有降解现象发生，而且在电泳检测中看不到蛋白质和多糖污染，所提的RNA纯净。而CTAB法提取的榛子成熟叶片总RNA，条带也比较清晰，28SrRNA亮度与18SrRNA相当，说明28SrRNA降解明显，条带有拖尾现象，DNA污染严重，有蛋白质、多糖等杂质污染，产量也较少；改良SDS法提取的榛子成熟叶片总RNA，不完整，28SrRNA降解明显，条带有拖尾，DNA、蛋白质、多糖等杂质污染严重。
2、榛子成熟叶片总RNA浓度和纯度的检测
上述步骤1以1％琼脂糖凝胶1×TBE电泳检测榛子成熟叶片总RNA完整性，其结果表明改良CTAB法提取榛子成熟叶片总RNA样品的效果比较好。以下为利用分光光度计(紫外/可见分光光度计)检测上述步骤一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子成熟叶片总RNA样品的OD值，进一步比较这两种方法提取的产率和质量。
结果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的成熟叶片的OD260/280分别为2.02和1.68，这说明改良CTAB法所提取的RNA纯度较高，DNA、蛋白质和多糖污染少。同时，在RNA产率上看，改良CTAB法(每克榛子成熟叶片提取116.005μg总RNA)远比改良SDS法(每克榛子成熟叶片提取94.525μg总RNA)高。
本实施例的结果表明，综合上述三种方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能从榛子成熟叶片中提取到总RNA，相比较而言，改良CTAB法所提的总RNA较完整，条带清晰，得到了较高质量的RNA；同时改良CTAB法所提取的总RNA样品的产率也较高(每克榛子成熟叶片提取116.005μg总RNA)，这说明本发明所提供的改良CTAB法适合于榛子成熟叶片总RNA的提取。
表1两种提取方法提取榛子总RNA紫外吸收结果
Claims (1)
1.从植物组织中提取总RNA的方法，包括如下步骤：
1）将植物组织与聚乙烯吡咯烷酮和维生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物组织、所述聚乙烯吡咯烷酮和所述维生素C的配比为0.2g：0.01g：0.01g；
2）将步骤1）得到的粉末加入到55-65℃的如下所述提取液中，55-65℃保温10min，得到样品混合液；
3）对步骤2）得到的样品混合液进行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到总RNA；所述抽提为用氯仿/异戊醇进行的抽提；所述氯仿/异戊醇是由氯仿与异戊醇按照24：1的体积比混合得到的混合物；
所述提取液的溶剂为水，溶质为十六烷基三甲基溴化铵、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三盐酸亚精胺、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、β-巯基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化铵在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化铵，所述Tris-Cl的终浓度为100mM，所述乙二胺四乙酸的终浓度为25mM，所述三盐酸亚精胺在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有0.05g所述三盐酸亚精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化钠的终浓度为2M，所述β-巯基乙醇的终浓度为体积百分含量5%；
所述植物组织为榛子的幼叶、雄花芽或成熟叶片；
所述RNA的抽提和所述RNA的沉淀包括如下步骤：
a）向所述样品混合液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混匀，于4℃12000r/min离心10min，回收上清液；
b）向步骤a）得到的上清液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混匀，于4℃，12000r/min离心10min，回收上清液；
c）向步骤b）得到的上清液中加入LiCl，使其终浓度为2M，混匀后于4℃放置过夜，于4℃12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
d）将步骤c）所得的RNA沉淀用75%乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；
e）将步骤d）得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液溶解，加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混匀，于4℃，12000r/min离心10min，回收上清液；
f）向步骤e）得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，于-20℃放置2h，于4℃，12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；
g）将步骤f）得到的RNA沉淀用75%乙醇洗两次，再用无水乙醇洗一次，自然干燥，溶于100μl DEPC水，得到所述总RNA。
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