CN101781646A

CN101781646A - 一种提取甘薯块根rna的方法及其应用

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Publication number: CN101781646A
Application number: CN200910214224A
Authority: CN
Inventors: 王章英; 房伯平; 陈景益; 张雄坚; 罗忠霞; 黄立飞; 陈新亮; 温少旋
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-25
Filing date: 2009-12-25
Publication date: 2010-07-21

Abstract

本发明公开了一种提取甘薯块根RNA的方法及其应用。本发明通过使用β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮，避免多酚类物质对RNA分离的干扰作用；另外再使用高浓度的NaCl、无水乙醇和醋酸钾，使多糖快速沉淀，避免多糖对RNA提取的影响。在避免多酚类物质和多糖对RNA分离的干扰作用时，RNA仍然保留于溶液中，得到了质量好、纯度高、完整性好的RNA，而且RNA获得率高、量大。本发明具有较大的实际应用价值，可以满足反转录、Northern杂交、cDNA文库构建、转录组分析等分子生物学研究。

Description

一种提取甘薯块根RNA的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种提取甘薯块根RNA的方法及其应用。

背景技术

甘薯是重要的工业原料、生物质能源和保健食品。因此，人们亟需更为深入地了解甘薯的遗传信息，而提取高纯度、高质量的RNA是了解甘薯遗传信息的必要前提和关键。

甘薯块根富含多糖(主要是淀粉)、酚类及其它次生代谢产物，严重影响了RNA的提取。其中多糖的理化性质与核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA时，蛋白多糖和RNA一块沉淀下来，产生难溶的胶状物复合体，在去除多糖的同时RNA也被带走，造成RNA大量丢失。此外，甘薯块根富含的酚类化合物易产生褐化效应(Browning effect)，使匀浆液呈褐色，其氧化产物与RNA不可逆结合，也会导致RNA活性丧失或产生不溶性复合物。因此，用常规的RNA提取方法难以提取出高质量的块根总RNA，影响了对甘薯分子生物学的研究.

目前，RNA的提取方法很多，采用Trizol试剂盒、SDS法以及常规的CTAB等方法均不能提取出大量的高质量甘薯块根RNA。You等(2003)利用胍盐一SDS裂解液，结合CsCI梯度离心提取了甘薯膨大初期块根的总RNA。为了避免淀粉的膨胀和凝胶化，Mohan Kumar等(2007)通过SDS和高盐沉淀法从甘薯块根中提取总RNA，但是，这些方法或存在所用裂解液毒性大或存在费时费力等不足。近年来，国内外也相继开发出了一些总RNA抽提试剂(盒)用于富含多糖和多酚等特殊植物材料的RNA提取，但结果不理想。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提取甘薯块根RNA的方法。该方法提取的甘薯块根总RNA获得率高、量大，并且质量好、纯度高、完整性好。

本发明的另一目的在于提供上述提取甘薯块根RNA的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提取甘薯块根RNA的方法，包含以下步骤：

(1)将甘薯块根放入液氮中，迅速研磨成粉末状，加入65℃预热的RNA提取缓冲液；RNA提取缓冲液的用量为每1～5g甘薯块根用15ml；

(2)将4ml多糖去除液加入到步骤(1)所得的混合液中，冰上放置10分钟；

(3)用氯仿异戊醇混合液抽提步骤(2)得到的混合液，收集上清液；这个步骤可达到去除多糖和蛋白的目的；

(4)将步骤(3)收集的上清液中的RNA沉淀，离心，回收沉淀，干燥，用DEPC处理水溶解；

(5)用无RNase的DNase处理步骤(4)得到的RNA溶液，可将痕量DNA污染去除；

(6)用苯酚、氯仿异戊醇混合液依次抽提步骤(5)的RNA溶液，进一步纯化RNA，取上清；

(7)将步骤(6)得到的上清液中的RNA沉淀，离心，回收沉淀，洗涤，干燥，得到高纯度的甘薯块根RNA；

步骤(1)中所述RNA提取缓冲液含有浓度为50mM Tris-HCl(pH9.0)，1～4％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)(w/v)，1～3M NaCl，25mM EDTA(pH8.0)，1～2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(w/v)，1～2％(体积百分比)β-巯基乙醇，1/3总体积的水饱和酚(pH4.3)；

步骤(1)中所述多糖去除液含有体积百分比为10～30％的乙醇和终浓度为0.4～0.6mol/L的醋酸钾。

步骤(3)和步骤(6)中所述的氯仿异戊醇混合液为氯仿与异戊醇按体积比24∶1混合而得；

步骤(3)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量优选为相当于步骤(2)得到的混合液的1倍体积；

步骤(3)所述的抽提为剧烈振荡后，优选至少2000×g离心至少15min；

步骤(3)中所述的抽提的次数优选为2次；

步骤(4)中所述RNA沉淀是往步骤(3)中的上清液中加入LiCl，LiCl的终浓度为1.5～2.5mol/L，冰上放置过夜；

步骤(5)中所述的处理的条件优选为37℃反应30分钟；

步骤(6)中所述的苯酚的用量优选为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积；

步骤(6)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量优选为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积；

步骤(6)所述的抽提为剧烈震荡后，优选至少10000×g离心至少10min；

步骤(6)中所述的抽提的次数优选为2次；

步骤(7)中所述RNA沉淀是往步骤(6)中的上清液中加入2倍体积的无水乙醇和终浓度为0.3～0.6mol/L的醋酸钠，-70℃放置20分钟；

步骤(7)中所述的洗涤为通过体积百分比为70％乙醇溶液洗涤。

RNA抽提中所用的试剂和耗材均用DEPC进行处理，根据《分子克隆》的指导进行。

所述提取甘薯块根RNA的方法适用于富含多糖、多酚等难提RNA植物组织的总RNA提取。

本发明的方法中，RNA提取缓冲液中的β-巯基乙醇和PVP可以避免多酚类物质对RNA分离的干扰作用，而且，与PVP结合的多酚可以在氯仿抽提时直接除去。本发明同时采用了2种方法沉淀与去除多糖，一是在RNA提取缓冲液中加入高浓度的盐份NaCl，二是在RNA溶液中加入一定比例的无水乙醇和醋酸钾，可以使多糖快速沉淀下来，而RNA仍然保留于溶液中，去除了多糖对RNA提取的影响，得到了高质量的RNA，具有较大的实际应用价值。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明所述提取甘薯块根RNA的方法提取的甘薯块根总RNA获得率高、量大，并且质量好、纯度高、完整性好，可以满足反转录、Northern杂交、cDNA文库构建、转录组分析等分子生物学研究。

附图说明

图1为本发明的方法和常规的TRIZOL法分别提取的甘薯块根RNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中：

泳道1、2和3分别为本发明所述方法提取的甘薯块根发育初期、中期和后期的总RNA；

泳道4为常规的TRIZOL法提取的甘薯块根发育初期的总RNA。

图2为以本发明方法提取的甘薯块根发育初期的RNA为模板的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)试剂的配制

A、DEPC水的配制：加0.1％(体积比)DEPC至重蒸水中，搅拌4小时以上，置于37℃处理过夜，121℃灭菌20min；

B、lmol/L Tris-HCl(pH9.0)：100ml灭菌的DEPC水加12.114g Tris，用浓盐酸调节pH值至9.0；

C、0.5mol/L EDTA(pH8.0)：将18.61g EDTANa₂.H₂O，用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，用NaOH颗粒调节其pH值至8.0，121℃灭菌20min；

D、8mol/L liCl：将33.912g LiCl用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，121℃灭菌20min；

E、4mol/L NaCl：将23.26g NaCl用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，121℃灭菌20min；

F、5mol/L醋酸钾：将49.07g醋酸钾用未灭菌的DEPC水溶解，定容至100ml，121℃灭菌20min；

G、RNA提取缓冲液(配制100ml)：5ml 1mol/L Tris-HCl(pH9.0)、50ml 4mol/L NaCl、5ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)、4g CTAB和2g PVP混匀，接着用灭菌的DEPC水定容至65ml，使用前加入33ml水饱和酚(pH4.3)和2ml β-巯基乙醇。

H、多糖去除液(配制100ml)：30ml无水乙醇、10ml 5M醋酸钾和60ml灭菌的DEPC水混合而得。

I、氯仿异戊醇混合液(配制100ml)：96ml氯仿与4ml异戊醇混合而得。

(2)不同发育时期的甘薯块根的总RNA提取

A、取大田生长的甘薯品种广薯87的块根发育初期(生育期50天)、中期(生育期80天)和后期(生育期140天)的甘薯块根组织各3g，分别立即放入液氮中研磨成粉末状，然后迅速加入到65℃预热的15ml RNA提取缓冲液中，剧烈振荡10分钟。

B、加入4ml多糖去除液，冰上放置10分钟

C、加入等体积氯仿异戊醇，剧烈振荡10分钟，于4℃、2000×g离心20分钟，取上清；再次加等体积氯仿异戊醇，混匀，振荡10分钟，于4℃、2000×g离心15分钟。

D、取上清，加1/3体积的8mol/L LiCl，冰上沉淀8小时以上。

E、于4℃、2000×g离心20分钟，弃上清。

F、沉淀用70％乙醇漂洗1次，于4℃、11400×g离心10分钟，吹干，加500μlDEPC水溶解。

G、用1～2个单位的DNase 37℃消化处理30分钟去除痕量的DNA污染。

H、加入等体积苯酚抽提蛋白，剧烈振荡10分钟，于4℃、11400×g离心10分钟，取上清。再用等体积氯仿去除多余苯酚和蛋白，剧烈振荡10分钟，于4℃、11400×g离心10分钟。

I、取上清，加入1/10体积3mol.L^-1醋酸钠(pH5.2)，2倍体积的无水乙醇，-70℃放置2小时，于4℃、11400×g离心20分钟，回收沉淀。

J、沉淀用70％乙醇漂洗，于4℃、11400×g离心10分钟，吹干，溶于100μlDEPC-H₂O中，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，保存于-70℃。

电泳检测RNA的完整性：上样量1μl，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，结果如图1所示，泳道1、2和3分别为本发明所述方法提取的甘薯块根发育初期、中期和后期的总RNA；泳道4为常规的TRIZOL法提取的甘薯块根发育初期的总RNA。从图1可以看出，经本发明方法提取的RNA经电泳检测可见清晰的28s和18s条带，且条带无拖尾现象，无基因组DNA的污染。而用常规的TRIZOL试剂盒(Invitrogen，美国)提取的甘薯块根发育初期的RNA(操作规程严格按照试剂盒的说明书进行)有明显的降解、拖尾现象，且28s和18s的主带不明显。

提取RNA的纯度检测：用NanoDrop spectrophotometer(ND-1000，NanoDropTechnologies，Inc.Wilmington，DE USA)检测实施例1RNA的纯度，结果如表1所示。从表1可以看出，经本发明方法提取的RNA经NanoDrop检测其A260/A280比值均在1.99-2.11之间，A260/A230比值均在2.13-2.35之间，产量可高达528.12μg/g甘薯块根鲜重。较Kim和Hamada(2005)方法的177μg/g甘薯块根鲜重(Kim S.H.，and Hamada T.，2005，Rapid and reliable method of extracting DNA andRNA from sweetpotato，Biotechnol.Lett.，27(23-24)：1841-1845)和Mohan Kumar等(2007)的237μg/g甘薯块根鲜重(Mohan Kumar G.N.，lyer S.，and Richard KnowlesN.，2007，Extraction of RNA from fresh，frozen，and lyophilized tuber and root tissues，J.Agr.Food Chem.，55(5)：1674-1678)的产量均高。说明所提RNA纯度较高，产量较大，可以满足不同分子生物学研究的要求。

表1RNA样品的纯度检测

Tissue	A₂₆₀/A₂₈₀	A₂₆₀/A₂₃₀	产量(μg/g鲜重)
Tissue	A₂₆₀/A₂₈₀	A₂₆₀/A₂₃₀	产量(μg/g鲜重)	初期	2.11	2.13	527.66
中期	1.99	2.32	528.12	初期	2.11	2.13	527.66
中期	1.99	2.32	528.12	后期	2.10	2.35	482.15

(3)总RNA的逆转录及特异基因的扩增

以上述提取的发育初期的甘薯块根总RNA为模板，用Promega公司的M-MLV反转录酶合成cDNA第1链后，稀释10倍作为PCR扩增的模板。PCR反应体系(25μL)中包括1μl cDNA，0.4mmol dNTP，上下游引物各10pmol，1U Taq酶。扩增甘薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶的引物序列分别为：上游：P 1，5′-ATGGAATTTTGTGCAACTTTGA-3′；下游：P2，5′-CCCGGGCTATACGACGGTTCCATCA-3′。cDNA模板在94℃变性5分钟后，扩增(94℃40秒，60℃40秒，72℃90秒)35个循环；最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图2所示。

以本发明方法提取的总RNA为模板，甘薯AGPase基因特异引物P1、P2进行RT-PCR，能成功扩增出预期的目的片段，说明该法提取的RNA样品质量好，可以进一步用于后续试验。

实施例2

(1)试剂的配制

A、RNA提取缓冲液(配制100ml)：5ml 1mol/L Tris-HCl(pH9.0)、25ml 4mol/L NaCl、5ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)、1g CTAB和1g PVP混匀，接着用灭菌的DEPC水定容至66ml，使用前加入33ml水饱和酚(pH4.3)和1ml β-巯基乙醇。

B、多糖去除液(配制100ml)：10ml无水乙醇、8ml 5M醋酸钾和82ml灭菌的DEPC水混合而得。

(2)甘薯块根发育后期的总RNA提取

同实施例1步骤(2)的操作，区别仅在于所用样品为发育后期(生育期140天)的甘薯块根组织1g。提取得到总RNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，28S、18S和5.8S带型清晰，说明得到的总RNA完整性较好；经NanoDropspectrophotometer检测，A260/A280比值均为2.01，A260/A230比值均为2.24，产量为498.85μg/g甘薯块根鲜重。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>广东省农业科学院作物研究所

<120>一种提取甘薯块根RNA的方法及其应用

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>上游引物

<400>1

atggaatttt gtgcaacttt ga 22

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>下游引物

<400>2

cccgggctat acgacggttc catca 25

Claims

1.一种提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)将甘薯块根放入液氮中，研磨成粉末状，加入65℃预热的RNA提取缓冲液；RNA提取缓冲液的用量为每1～5g甘薯块根用15ml；

(3)用氯仿异戊醇混合液抽提步骤(2)得到的混合液，收集上清液；

(5)用无RNase的DNase处理步骤(4)得到的RNA溶液；

(6)用苯酚、氯仿异戊醇混合液依次抽提步骤(5)的RNA溶液，取上清；

所述RNA提取缓冲液含有pH9.0、50mM的Tris-HCl，质量体积比为1～4％的十六烷基三甲基溴化铵，1～3M的NaCl，pH8.0、25mM的EDTA，质量体积比为1～2％的聚乙烯吡咯烷酮，体积百分比为1～2％的β-巯基乙醇，相当于所述RNA提取缓冲液总体积1/3的pH值为4.3的水饱和酚；

所述多糖去除液含有体积百分比为10～30％的乙醇和终浓度为0.4～0.6mol/L的醋酸钾；

所述的氯仿异戊醇混合液为氯仿与异戊醇按体积比24∶1混合而得。

2.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量为相当于步骤(2)得到的混合液的1倍体积；

步骤(3)中所述的抽提为剧烈振荡后，至少2000×g离心至少15min。

3.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(4)中所述RNA沉淀是往步骤(3)中的上清液中加入LiCl，LiCl的终浓度为1.5～2.5mol/L，冰上放置过夜。

4.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的处理的条件为37℃反应30分钟。

5.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的苯酚的用量为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积。

6.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的氯仿异戊醇混合液的用量为相当于步骤(5)得到的混合液的1倍体积。

7.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的抽提为剧烈震荡后，至少10000×g离心至少10min。

8.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(7)中所述RNA沉淀是往步骤(6)中的上清液中加入2倍体积的无水乙醇和终浓度为0.3～0.6mol/L的醋酸钠，-70℃放置20分钟。

9.根据权利要求1所述提取甘薯块根RNA的方法，其特征在于：步骤(7)中所述的洗涤为通过体积百分比为70％乙醇溶液洗涤。

10.权利要求1～8任一项所述提取甘薯块根RNA的方法用于富含多糖和/或多酚的植物组织的总RNA提取。