CN102220312A

CN102220312A - 一种室温提取花生种子中总rna的方法

Info

Publication number: CN102220312A
Application number: CN 201110123513
Authority: CN
Inventors: 毕玉平; 陈高; 彭振英; 范仲学; 张斌; 张燕; 李兰
Original assignee: High Tech Research Center Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: High Tech Research Center Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-05-13
Also published as: CN102220312B

Abstract

本发明涉及一种室温提取花生种子中总RNA的方法，属于生物技术技术领域。包括如下步骤：(1)研磨花生未成熟种子，制得花生冻干粉；(2)将花生冻干粉加入Trizol试剂，然后加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃离心，取上清液；(3)加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃离心，取上清液；(4)加入异丙醇混合，静置，20～32℃离心，取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即得。该方法离心步骤在20～32℃完成，且操作时间较原有技术时间短，从而缩短了RNA被降解的时间，重复性好，提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点。

Description

一种室温提取花生种子中总RNA的方法

技术领域

本发明涉及一种室温提取花生种子中总RNA的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

花生(Arachis hypogaea L.)是世界上重要的油料作物和经济作物，含人体所必须的各种氨基酸，是食用油的重要来源。我国是花生生产大国，全国花生产量占油料作物总产量的一半以上，同时也是世界上花生出口量最多的国家，出口量占世界总量的40％。当前，随着人们消费水平的提高及对植物油日益增长的需求，提高花生的产量和油脂品质已具有重大意义。已有研究表明，决定食用植物油脂品质的关键因素是脂肪酸的构成。在花生脂肪酸研究中，对控制花生脂肪酸相关酶基因在花生不同部位的表达模式进行分析及其重要，而花生总RNA提取过程中DNA污染对半定量RT-PCR的影响尤为严重。不同的RNA提取方法对花生同一组织材料提取的结果差异很大。

花生种子总RNA提取是花生分子生物学实验中的必备技术，目前因为花生中多糖、多酚等次生代谢物质较多，总RNA提取相对困难。使用CTAB法、SDS法及常规试剂盒对花生总RNA的提取存在提取量少、降解严重及DNA污染等问题，严重阻碍了花生脂肪酸的研究工作。

公开号为CN101935648A(申请号201010281633.6)的中国专利，公开了一种提取RNA的方法和试剂盒。提取RNA的方法为样品与裂解液混匀，离心收集上清与1/2体积无水乙醇混匀，结合于0.45μm玻璃纤维素膜后，用去蛋白液和漂洗液洗涤，最后洗脱吸附的RNA。上述方法，还包括裂解细胞与助提剂混匀，离心去除多糖多酚类物质。提取RNA的试剂盒包括裂解液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液，还包括助提剂。

公开号为CN101638651A(申请号200910094704.9)的中国专利，公开了一种利用异硫氰酸胍-氯仿抽提、TRIS饱和酚纯化植物RNA的抽提方法。本发明改良了传统的异硫氰酸胍法，采用裂解后氯仿抽提加酚纯化两步法，分别从红皮梨的叶片和果皮、葡萄的叶片和果肉、果皮组织以及草莓果实和新疆紫草愈伤组织中提取到了高质量的总RNA。该方法的抽提缓冲液中含有异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、柠檬酸钠、可溶性聚乙烯吡咯烷酮和B-巯基乙醇，既能高效裂解植物细胞释放RNA，有效抑制RNA酶的活性，还能防止酚类物质的氧化和排除次生代谢物质的干扰。第二步用TRIS饱和酚纯化粗提RNA溶液，能除去与RNA共沉淀的多糖和蛋白质。

上述专利虽然部分解决了杂质对结果的影响，但上述方法操作繁琐，操作周期长，且对实验温度等条件要求苛刻，因此导致该方法的可再现性较差，实验结果的准确性不高。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种室温提取花生种子中总RNA的方法。该方法提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点，同时可为花生基因克隆、定量表达分析及功能研究等分子生物学实验研究奠定基础。

一种室温提取花生种子中总RNA的方法，步骤如下：

(1)在液氮冷却并去除RNA酶的条件下研磨花生未成熟种子，研磨时间为0.5～1.5min，得花生冻干粉；

(2)将步骤(1)制得的花生冻干粉加入Trizol试剂，然后加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃、12000～13000rpm离心5～7min，取上清液，得一次离心上清液；加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮避免多酚类物质的影响；

(3)将步骤(2)制得的一次离心上清液中加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃、12000～13000rpm离心5～7min，取上清液，得二次离心上清液；

(4)将步骤(3)制得的二次离心上清液中加入异丙醇混合，-20～-25℃静置10～15min，20～32℃、12000～13000rpm离心5～7min，取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即得。

所述步骤(2)中每百毫克花生冻干粉中加入Trizol试剂为700～900μl、2％β-巯基乙醇15～20μl、2％聚乙烯吡咯烷酮15～20μl。

所述步骤(2)中苯酚/氯仿/异戊醇混合液为苯酚、氯仿和异戊醇按体积比25∶24∶1混合制得。

所述步骤(2)中的振荡为涡旋振荡15～25s。

所述步骤(3)中氯仿/异戊醇混合液为氯仿和异戊醇按体积比24∶1混合制得。

所述步骤(2)和步骤(3)中的静置为2～6℃静置3～7min。

所述步骤(4)中的醇洗为75％乙醇洗涤。

所述步骤(4)中的复溶为灭菌DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解。

本发明具有以下优点

1、本发明所述方法离心步骤在20～32℃的室温下操作，且各步骤操作时间较原有技术时间短，从而缩短了RNA被降解的时间，因此，重复性好，操作时间短，提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点。

2、本发明所述方法利用β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮去除多糖及多酚类物质对RNA的干扰及影响；同时利用苯酚/氯仿/异戊醇抽提次数少，减少了RNA在提取过程中的损失。

3、本发明所述方法具有鉴定效率高，成本低，周期短等优点。提取的RNA可直接进行下游半定量RT-PCR、RACE和Real-time PCR等分子生物学研究。

附图说明

图1、本发明提取的花生种子总RNA琼脂糖凝胶电泳图；

其中：1、花生果针入土后10天的未成熟种子总RNA，2、花生果针入土后20天的未成熟种子总RNA，3、花生果针入土后30天的未成熟种子总RNA，4、花生果针入土后40天的未成熟种子总RNA，5、花生果针入土后50天的未成熟种子总RNA，6、花生果针入土后60天的未成熟种子总RNA，7、花生果针入土后70天的未成熟种子总RNA。

图2、花生种子各发育时期Real-time PCR扩增曲线图；

图3、花生种子各发育时期Real-time PCR熔解峰图；

图4、花生种子各发育时期AhFatB基因半定量RT-PCR结果；

图5、花生种子个发育时期AhFatB基因Real-time PCR结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图及实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所用实验用品处理及试剂配制说明：

RNA提取过程中要使用的枪头、枪头盒、离心管等塑料器皿应使用0.1％DEPC水浸泡4h后高压蒸汽灭菌，烘干；

研钵用氯仿润洗消毒；研钵、药匙及玻璃器皿应用铝箔纸包好后于烘箱中180℃干热灭菌6-8h；

75％乙醇用0.1％DEPC H₂O配制。

实施例

一种室温提取花生种子中总RNA的方法，步骤如下：

1)分别称取花生果针入土后10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天(10-70DAP)的未成熟种子100mg于酒精烧过并液氮冷却的研钵中，加液氮研磨1分钟，制得花生冻干粉；

2)将步骤1)制得的花生冻干粉加入到含有800μl Trizol的1.5EP管中，并加入2％β-巯基乙醇18μl和2％聚乙烯吡咯烷酮18μl，以避免多酚类物质的影响；涡旋振荡20s后加500μl苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，充分混匀，静置1min；13000rpm，24℃离心5min；取上清液，得一次离心上清液；

3)将步骤2)制得的一次离心上清液转入新的1.5ml离心管中，加500μl氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，充分混匀，静置1min；13000rpm，24℃离心5min；取上清液，得二次离心上清液；

4)取步骤3)制得的二次离心上清液转入新的1.5ml离心管中，然后加500μl异丙醇，-20℃静置10min；然后13000rpm，24℃离心5min，取沉淀，加入75％乙醇洗涤沉淀，13000rpm，24℃离心2min，弃上清；在超净工作台上吹干后加灭菌的0.1％DEPC H₂O溶解，即得花生种子中总RNA。

花生种子总RNA完整性及纯度检测：

1)1.2％琼脂糖凝胶电泳检测上述制得的花生种子总RNA样品，由图1可见，5s、18s、28s条带清晰、整齐，28s条带亮度接近是18s条带亮度的两倍，说明所提取的花生种子总RNA具有完整性较好。

2)取上述制得的花生种子总RNA样品，用灭菌的0.1％DEPC H₂O稀释20倍，以灭菌的0.1％DEPC H₂O为空白对照，利用紫外分光光度计测230nm、260nm、280nm波长处得OD值。计算A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀比值。检测结果表明，所提取的花生种子总RNA A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8-2.0之间，A₂₆₀/A₂₃₀比值大于2.0，说明RNA纯度较好。具体花生种子总RNA纯度及得率检测结果参见下表：

反转录及特异基因表达分析：

以上述制得的花生种子总RNA为模板，用TaKaRa公司PrimeScript^TMRT-PCR Kit反转录成的cDNA稀释20倍后为模板，以花生β-actin为内参基因进行花生硫酯酶基因AhFatB的半定量RT-PCR和Real-time PCR检测。

其中AhFatB基因的半定量RT-PCR引物序列为：

上游P1：5’-TTCTTGGTGATGGCTTTG-3’；下游P2：5’-GACCCGTGCGAATGTAAT-3’；

β-actin基因引物序列为：

上游P3：5’-GCAGGGCGTGATTTAACTG-3’；下游P4：5’-CTCCGATCCAGACACTGTACT-3’；

PCR反应体系(25μl)：

1.0μl cDNA，12.5μl Trans公司2×Taq HiFi PCR SuperMix，10pmol上游引物μl，10pmol下游引物；

PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存；

1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图4所示。

AhFatB基因Real-time PCR引物序列为：

上游P5：5’-GCAGCCAATCTTGGAGAGTC-3’；下游P6：5’-TCAGCACCATCTTCAAGTCG-3’；

β-actin基因引物序列为：

上游P7：5’-GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3’；下游P8：5’-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3’。

PCR反应体系(25μl)：

2.0μlcDNA，12.5μl TaKaRa公司2×SYBR Green I Ex Taq^TMII，10pmol上游引物，10pmol下游引物；

PCR扩增程序：94℃1min；94℃10s，60℃30s，72℃30s，42个循环；72℃5min，4℃保存。

扩增曲线、熔解峰如图2及图3所示。荧光定量相对表达量分析如图5所示。

对花生硫酯酶基因AhFatB的半定量RT-PCR和Real-time PCR检测结果表明，本发明的花生种子总RNA提取方法获得的RNA可以满足下游半定量RT-PCR和Real-time PCR等分子生物学研究。

对照实验

下面为了突出本发明的优良效果，做如下对比试验：

根据公开号CN101638651A(申请号200910094704.9)的中国专利中实施例1的方法、公开号CN101724626A(申请号200910223727.5)的中国专利中实施例的方法、公开号CN101875930A(申请号200910310602.6)的中国专利中实施例2的方法、公开号CN1587405A(申请号200410060812.1)的中国专利中实施例的方法、公开号CN101781646A(申请号2009110214424)的中国专利中实施例1的方法、公开号CN1884524A(申请号200810089308.3)的中国专利中实施例1的方法，对花生种子提取花生种子总RNA，对其操作时间、离心操作温度及总RNA得率做对比试验，结果如下表所示。

通过对比试验可以发现，本发明的方法能有效的提取花生种子总RNA，提取方法快速、高效，尤其是可以在室温(20-32℃)条件下离心操作，提取的花生种子总RNA具有得率高于其它方法。

Claims

1.一种室温提取花生种子中总RNA的方法，步骤如下：

(2)将步骤(1)制得的花生冻干粉加入Trizol试剂，然后加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃、12000～13000rpm离心5～7min，取上清液，得一次离心上清液；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中每百毫克花生冻干粉中加入Trizol试剂为700～900μl、2％β-巯基乙醇15～20μl、2％聚乙烯吡咯烷酮15～20μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中苯酚/氯仿/异戊醇混合液为苯酚、氯仿和异戊醇按体积比25∶24∶1混合制得。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的振荡为涡旋振荡15～25s。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中氯仿/异戊醇混合液为氯仿和异戊醇按体积比24∶1混合制得。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的静置为2～6℃静置3～7min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的醇洗为75％乙醇洗涤。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的复溶为灭菌DEPC水溶解。