CN101775389A - 一种提取副溶血弧菌总rna的方法 - Google Patents

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潘迎捷
赵勇
孙晓红
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Abstract

本发明提供一种提取副溶血弧菌总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：①取副溶血弧菌菌液1ml于离心管中，离心；②弃上清，菌体用液氮速冻，磨成粉末，把粉末转到离心管中，加入Trizol，振荡1min，冰上静置3min，反复震荡3次；③加入氯仿/异戊醇，离心；④将上清500ul转入离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，放置使充分沉淀，离心；⑤小心移去上清，用70％的乙醇洗，离心；⑥小心的尽可能吸走上清，超净台上倒置将酒精空干，加入DEPC水溶解；-80℃保存。由于采用了上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果是：本发明所述的方法能在短暂的三小时内提取出浓度高，纯度高，完整性好的总RNA，且所用试剂简单，成本低廉。

Description

一种提取副溶血弧菌总RNA的方法
技术领域
本发明涉及一种提取副溶血弧菌总RNA的方法。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，广泛存在于海水中，在含食盐浓度3％～3.5％的培养基中生长良好，故又称致病性嗜盐菌。副溶血弧菌是水产品、咸菜、熟肉类、禽肉及禽蛋类中常见的致病菌，由于人们生活方式的改变以及水环境的恶化，越来越多人由于进食受污染的食物或未煮熟的食物而导致食物中毒，因此对副溶血弧菌进行生物学研究具有重大的意义。分离提取高质量的RNA是后续的PCR，Real-time PCR，基因克隆，cDNA文库建立等分子生物学研究的基础。而细菌的RNA具有含量少，半衰期短，容易降解等特点，所以相比较植物，动物等真核生物而言，更难提取出高质量的RNA。目前国内外也还没有针对副溶血弧菌RNA提取的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取副溶血弧菌总RNA的方法，以方便对副溶血弧菌进行分子生物学研究。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
一种提取副溶血弧菌总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
①取副溶血弧菌菌液1ml于离心管中，离心；
②弃上清，菌体用液氮速冻，磨成粉末，把粉末转到离心管中，加入Trizol，振荡1min，冰上静置3min，反复震荡3次；
③加入氯仿/异戊醇，离心；
④将上清500ul转入离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，放置使充分沉淀，离心；
⑤小心移去上清，用70％的乙醇洗，离心；
⑥小心的尽可能吸走上清，超净台上倒置将酒精空干，加入DEPC水溶解；-80℃保存。
所述方法中的离心是指转速为12000rpm，离心时间为1-5min。
步骤①所述的离心是在4℃离心。
步骤②所述的加入Trizol为800ul。
步骤③所述的加入氯仿/异戊醇的量为200ul，混合比例为24∶1。
步骤④所述的放置使充分沉淀是指在室温放置10min，或者-20℃放置1小时或更长时间。
步骤⑥所述的加入DEPC为40ul。
本发明所述“Trizol”是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。所述“Trizol”可从商业途径购买得到。
本发明所述“DEPC”即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯，是一种RNA酶抑制剂。
对提取出的RNA在-80℃保存，以防止RNA降解。用核酸测定仪测定RNA在A260、A280、A230的数值和其浓度，并计算A260/A280、A260/A230的比值，以此鉴定RNA的纯度。
由于采用了上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果是：步骤④所述的放置使充分沉淀是指在室温放置10min即能充分沉淀，从而使得放置使充分沉淀时间大大缩短，本发明所述的方法能在短暂的三小时内提取出浓度高，纯度高，完整性好的总RNA，且所用试剂简单，成本低廉。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
按照以下步骤提取副溶血弧菌总RNA：
1.沉淀菌体：取副溶血弧菌菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，12000rpm离心1min；
2.破裂细胞，溶解出细胞里的核酸，蛋白质，多糖等物质：弃上清，菌体用液氮速冻，磨成粉末，把粉末转到1.5ml离心管中(液氮上操作，保证低温)，加入800ul Trizol，振荡1min，冰上静置3min，反复震荡3次；
3.去除其中的蛋白质，多糖等杂质：加入200ul混合比例为24∶1的氯仿/异戊醇；12000rpm离心5min；将上清500ul转入1.5ml离心管中，加入与上清等体积的预冷异丙醇，室温沉淀10min以使充分沉淀，注意不要吸取中层物质，否则会有DNA污染；
4.RNA的洗涤和溶解：12000rpm离心5min；小心移去上清，用70％的乙醇洗2遍，每次700ul，12000rpm离心3min；小心的尽可能吸走上清，超净台上倒置将酒精空干，加入40ul DEPC水溶解；-80℃保存。
5.RNA质量的鉴定：用核酸测定仪测定RNA在A260、A280、A230的数值和其浓度，并计算A260/A280、A260/A230的比值，结果如表1所示。
实施例2
按照以下步骤提取副溶血弧菌总RNA：
1.沉淀菌体：取副溶血弧菌菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，12000rpm离心1min；
2.破裂细胞，溶解出细胞里的核酸，蛋白质，多糖等物质：弃上清，菌体用液氮速冻，磨成粉末，把粉末转到1.5ml离心管中(液氮上操作，保证低温)，加入800ul Trizol，振荡1min，冰上静置3min，反复震荡3次；
3.去除其中的蛋白质，多糖等杂质：加入200ul混合比例为24∶1的氯仿/异戊醇；12000rpm离心5min；将上清500ul转入1.5ml离心管中，加入与上清等体积的预冷异丙醇，-20℃放置1小时以使充分沉淀，注意不要吸取中层物质，否则会有DNA污染；
4.RNA的洗涤和溶解：12000rpm离心5min；小心移去上清，用70％的乙醇洗2遍，每次700ul，12000rpm离心3min；小心的尽可能吸走上清，超净台上倒置将酒精空干，加入40ul DEPC水溶解；-80℃保存。
5.RNA质量的鉴定：用核酸测定仪测定RNA在A260、A280、A230的数值和其浓度，并计算A260/A280、A260/A230的比值，结果如表1所示。
实施例3
按照以下步骤提取副溶血弧菌总RNA：
1.沉淀菌体：取副溶血弧菌菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，12000rpm离心1min；
2.破裂细胞，溶解出细胞里的核酸，蛋白质，多糖等物质：弃上清，菌体用液氮速冻，磨成粉末，把粉末转到1.5ml离心管中(液氮上操作，保证低温)，加入800ul Trizol，振荡1min，冰上静置3min，反复震荡3次；
3.去除其中的蛋白质，多糖等杂质：加入200ul混合比例为24∶1的氯仿/异戊醇；12000rpm离心5min；将上清500ul转入1.5ml离心管中，加入与上清等体积的预冷异丙醇，-20℃放置大于1小时以使充分沉淀，注意不要吸取中层物质，否则会有DNA污染；
4.RNA的洗涤和溶解：12000rpm离心5min；小心移去上清，用70％的乙醇洗2遍，每次700ul，12000rpm离心3min小心的尽可能吸走上清，超净台上倒置将酒精空干，加入40ul DEPC水溶解；-80℃保存。
5.RNA质量的鉴定：用核酸测定仪测定RNA在A260、A280、A230的数值和其浓度，并计算A260/A280、A260/A230的比值，结果如表1所示。
表1实施例1-3提取得到的RNA的A260/A280、A260/A230的数值
  样品   A260/A280   A260/A230
 实施例1   2.01±0.02   2.27±0.02
 实施例2   2.05±0.01   2.13±0.01
 实施例3   2.04±0.01   2.36±0.01
RNA纯度的测定不仅要考虑A260/A280的比值，同时也要参考A260/A230，的比值。如果A260/A230的比值过低，表明可能有多聚糖、胍盐或者β-巯基乙醇的污染(法雷尔，2007)。经检测，结果如表1所示，该方法提取出的总RNA纯度较高，所有样品的A260/A280值均在1.9和2.1之间，A260/A230值基本大于2.0且小于2.4，表明RNA样品含酚类、多糖类物质和蛋白质等杂质少，该方法所提取的RNA样品纯度较好。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.一种提取副溶血弧菌总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
①取副溶血弧菌菌液1ml于离心管中，离心；
②弃上清，菌体用液氮速冻，磨成粉末，把粉末转到离心管中，加入Trizol，振荡1min，冰上静置3min，反复震荡3次；
③加入氯仿/异戊醇，离心；
④将上清500ul转入离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，放置使充分沉淀，离心；
⑤小心移去上清，用乙醇洗，离心；
⑥小心的尽可能吸走上清，超净台上倒置将酒精空干，加入DEPC水溶解；-80℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心是指转速为12000rpm，离心时间为1-5min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①所述的离心是在4℃离心。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④所述的放置使充分沉淀是指在室温放置10min，或者-20℃放置1小时或更长时间。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220312A (zh) * 2011-05-13 2011-10-19 山东省农业科学院高新技术研究中心 一种室温提取花生种子中总rna的方法

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