CN102424823A

CN102424823A - 油桐成熟叶片和老叶片基因组dna提取方法

Info

Publication number: CN102424823A
Application number: CN2011104543944A
Authority: CN
Inventors: 彭俊华; 张玲玲
Original assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Current assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2031-12-30
Also published as: CN102424823B

Abstract

本发明公开了一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法，涉及分子生物学实验中植物基因组DNA分离提取技术。本方法主要包括预处理叶片组织样、细胞的破碎、非DNA成分的抽提、DNA的析出、离子的去除和组织样品的循环提取。本发明使用洗液预处理油桐成熟叶片和老叶片组织样一次，能有效地去除叶片内富含的多酚、多糖等次生代谢产物；本发明对叶片组织样进行循环提取，该步骤在传统基因组DNA提取方法中是不存在的，本发明方法1份组织样可进行4次基因组DNA提取，使基因组DNA产量显著提高；本发明能从长期低温储存的成熟叶片和老叶片中提取到高质量高产量的基因组DNA。本发明适用于油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA的提取。

Description

油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学实验中植物基因组DNA分离提取技术，尤其涉及一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法。

背景技术

基因组DNA的提取是分子生物学实验很重要的一个环节。基因组DNA的质量和产量，直接影响分子生物实验中与DNA有关的后续实验的进行。药用植物、芳香族植物及木本植物富含次生代谢产物；对这一类富含次生代谢产物的植物，传统的DNA提取方法不易提到高质量的基因组DNA。这类植物叶片内次生代谢产物的种类极其复杂，且不同物种间甚至同一物种间不同季节，不同叶龄的叶片间次生代谢产物的异质性程度都较高；因此，一种植物的基因组DNA提取方法往往不能很好地应用于另一种植物基因组DNA的提取。

油桐原产于中国，具有极高的工业价值。从油桐桐果中提取的桐油是我国传统的大宗出口创汇物资。在我国，桐油主要用于油墨和涂料的生产。现今，能源危机不断加剧，环境问题日益严重，对可持续的新型清洁能源的需求迫在眉睫。油桐被选为能源植物物种，从油桐果实中提取的桐油可作为生产生物柴油的原料。因此用先进的分子生物学手段深入地研究油桐资源将对选育高产品种以及将桐油转化为生物柴油提供理论依据和技术支持。目前油桐资源分子方面的研究还处于起步阶段，提取高质量高产量的油桐基因组DNA是开展一系列后续分子生物学实验的基础。油桐叶片富含多糖、单宁、蛋白及多酚类物质，这些次生代谢产物影响油桐基因组DNA的提取。而物种间次生代谢产物的异质性致使其它物种基因组DNA的提取方法并不是油桐基因组DNA的最佳提取方法。研究发现油桐叶片的叶龄影响油桐基因组DNA的提取。

经检索，到目前为止，现有技术中还没有专门针对油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法的报道。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，针对油桐成熟叶片和老叶片富含多糖、单宁、多酚及蛋白的特点，提供一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法(简称方法)。

本发明的目的是这样实现的：

1、本方法包括下列步骤：

①将叶片(指油桐成熟叶片和老叶片)组织样品在液氮速冻下磨成细粉后，取0.3g转入2mL离心管中，加入1.5mL洗液，充分混匀后，冰中静止15min，12000rpm离心弃上清液；

②弃掉洗液后，加入500μl预热的3％CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴40min；

③12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1.5mL离心管中，加入100μl的24∶1的氯仿-异戊醇，充分混匀后，常温12000rpm离心15min，抽提1～2次，抽提后的上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20℃的100％酒精；放置于-20℃冰柜30min，让DNA沉淀充分析出；将析出的DNA沉淀转移到含有1mL 70％酒精的1.5mL离心管中，漂洗2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100μl的T_0.1E充分溶解，并用1μl浓度为10μg/mLRNA酶37℃消化30min，该过程得到的DNA样品，称为1^stDNA；

④对步骤③中转移上清液后离心管底部的组织样品，继续加入500μl的3％CTAB提取液进行提取，该组织样共循环提取4次，依此又得到3批次DNA样品，分别称为2^ndDNA、3^rdDNA和4^thDNA。

所述100％酒精是指纯的酒精溶液。

所述70％酒精是指70mL纯酒精用无菌纯净水定容到100mL的酒精溶液。

本发明所提取的多批次DNA样品中，未经低温储存的成熟叶片和老叶片1^stDNA、2^ndDNA、3^rdDNA产量较高，浓度大致为300～800ng/μl之间。而4^thDNA的产量大致在50～100ng/μl之间，产量明显降低，可只进行前3次循环提取。

本发明所提取的多批次DNA样品中，长久低温储存的成熟叶片和老叶片1^stDNA产量较低，大致在0～50ng/μl之间，水浴后可弃掉离心产生的上清液，直接进行后续3次DNA的提取；而2^ndDNA、3^rdDNA，产量高，浓度大致为100～500ng/μl之间。

本发明所使用洗液的成分为：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，350mM山梨醇，2％PVP，0.5％β-巯基乙醇，PH值为8.0。

所述的2％是指2g/100mL，所述的0.5％是指0.5mL/100mL。

本发明所使用的3％CTAB提取液成分为：3％CTAB，100mM Tris-HCl，20mMEDTA，1.4M NaCl，2％PVP，0.5％β-巯基乙醇，pH值为8.0。

所述的3％是指3g/100mL，所述的2％是指2g/100mL，

所述的0.5％是指0.5mL/100mL。

本发明所使用的T_0.1E成分为：10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.0。

工作原理：油桐叶片中富含的次生代谢产物，例如多糖、单宁、多酚等在DNA提取过程中与DNA共分离或抑制DNA的提取等。在用3％CTAB提取液裂解细胞前，先用洗液预处理液氮研磨的叶片组织样，可提前除去干扰DNA分离的次生代谢产物。预处理后的叶片组织样加入3％CTAB提取液在65℃下裂解细胞，离心转移的上清再经过氯仿：异戊醇的萃取、酒精的沉淀，得到絮状的DNA沉淀，最后利用70％乙醇的洗涤DNA沉淀，得到第1次DNA沉淀，即1^stDNA。而离心转移上清后位于离心管底部的组织样可继续加3％CTAB提取液，进行新一轮的DNA提取，依此组织样共循环提取4次，又得到3批次DNA样本。本发明可分离到高质量(少多糖、少多酚、少色素和蛋白质)、高产量(1份组织样得到4批次DNA沉淀)的油桐基因组DNA，满足分子生物学实验对DNA浓度和质量的要求。

2、油桐基因组DNA的鉴定

用本方法提取的油桐基因组DNA样品，可经0.8％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和质量。

3、本方法的用途

本方法可以从油桐成熟叶片和老叶片鲜样中提取高产量高质量的基因组DNA。尤其是在长久低温储存状况下，油桐成熟叶片和老叶片内化学成分发生质的改变，致使本方法四次循环提取中第1次提取得到的基因组DNA产量非常低(琼脂糖凝胶检测不到)，而后续三次得到的基因组DNA产量较高，故组织样只提取1次的传统方法较难从长久低温储存的油桐成熟叶片和老叶片中提取到基因组DNA；但本方法可克服这种长久低温储存对油桐成熟叶片和老叶片DNA提取的影响，能较好地提取到高产量高质量的基因组DNA，满足分子生物学后续实验对DNA浓度和质量的要求。

4、本发明具有下列优点和积极效果：

①本方法中发明的洗液，处理油桐成熟叶片和老叶片组织样1次，能有效地去除叶片内富含的多酚、多糖、单宁等次生代谢产物；

②本方法中循环提取的步骤是传统基因组DNA提取方法中所没有的，1份组织样可进行4次基因组DNA提取，得到4次基因组DNA样本，使基因组DNA产量显著提高；

③本方法能从长期低温储存的成熟叶片和老叶片中提取到高质量高产量的基因组DNA。

本发明适用于油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA的提取。

附图说明

图1是老叶片和成熟叶片的图片；

图中：左边的是老叶片，右边的是成熟叶片。

图2是用本提取方法提取的油桐10个基因型成熟叶片混合鲜样基因组DNA的电泳图片；

图中：1、2、3、4分别为1^st、2^nd、3^rd、4^thDNA的电泳图片，设置2个重复。

图3是用本方法提取的油桐10个基因型老叶片混合样鲜样基因组DNA的电泳图片；

图4是图2所述叶片在低温储存7个月后的情况。

图5是图3所述叶片在低温储存7个月后的情况。

英译汉：

1、CTAB：Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵；

2、EDTA：Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸；

3、PVP：Polyvinyl Pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮；

4、β-Mercaptoethanol：巯基乙醇。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

一、提取方法

选取油桐10个基因型成熟叶混合样鲜样和老叶混合样鲜样，各4份，其中2份储存0天和2份储存7个月。使用本发明方法进行下述8次提取作业：

①在液氮中将叶片组织样品充分研磨成粉末，迅速称取0.3g，快速转移到2mL离心管中，放入-70℃冰箱待用；加入1.5mL洗液，充分混匀后，冰中静止15min，12000rpm离心弃上清液；

②加入500μl预热的3％CTAB提取液，充分混匀后，放入水浴锅中65℃水浴40min，12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1.5mL离心管中；

③转移的上清液，使用24∶1的氯仿-异戊醇抽提1次，充分混匀后，12000rpm离心15min，转移上清液到新的1.5mL离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20℃的100％酒精；放置-20℃冰箱30min，让DNA充分沉淀析出。该过程得到的DNA样品为1^stDNA；

④步骤③中转移上清液后离心管下部的组织样品，继续加预热的CTAB提取液，充分混匀，进行新一轮的DNA提取步骤，这个过程中得到的DNA样品为2^ndDNA，而对第二次转移上清液后离心管中的组织样品继续加预热的CTAB提取液，依此循环又得到3^rd和4^thDNA；

⑤将4次析出的DNA沉淀，分别转移到含有1mL 70％酒精的1.5mL离心管中漂洗1-2次，每次30min；

⑥倒干酒精，DNA沉淀干燥后，用100μl的T_0.1E充分溶解，并用1μlRNA酶(10μg/mL)，37℃消化30min，于-20℃冰柜储存，备用。

二、琼脂糖凝胶电泳法检测本方法提取的油桐基因组DNA的质量和产量

如图2，本方法提取油桐成熟叶混合样鲜样，得到的4次DNA中，1^stDNA、2^ndDNA和3^rdDNA在琼脂糖凝胶上检测到清晰且明亮的电泳条带，而4^thDNA电泳条带明显变暗或者没有检测到可以分辨的条带；说明本方法提取的油桐成熟叶片基因组DNA产量高，质量好。

如图3，本方法提取油桐老叶混合样鲜样，得到的4次DNA中，1^stDNA、2^ndDNA和3^rdDNA在琼脂糖凝胶上检测到清晰且明亮的电泳条带，而4^thDNA在琼脂糖凝胶上没有检测到可以分辨的条带；说明本方法提取的油桐老叶片基因组DNA产量高，质量好。

如图4，本方法提取低温储存7个月的油桐成熟叶混合样，得到的4次DNA，1^stDNA在琼脂糖凝胶上的条带较暗，2^ndDNA、3^rdDNA、4^thDNA均检测明亮清晰的电泳条带；说明本方法适合提取长时间低温储存的油桐成熟叶片基因组DNA，且得到的基因组DNA产量高，质量好。

如图5，本方法提取低温储存7个月的油桐老叶，得到的4次DNA，1^stDNA在琼脂糖凝胶上没有检测到条带，2^ndDNA、3^rdDNA，均检测到明亮清晰的电泳条带，而4^thDNA在琼脂糖凝胶上的条带明显变暗；说明本发明方法适合提取长时间低温储存的油桐老叶片基因组DNA，且得到的基因组DNA产量高，质量好。

如图2、图4及图3、图5，油桐成熟叶片、老叶片经低温长期储存，叶片内的化学成分发生了变化，对油桐基因组DNA的提取造成明显的影响；按照传统基因组DNA提取方法，经低温长期储存的油桐组织样只进行1次提取，得到的DNA产量将可能会很低；而用本方法的油桐成熟叶片和老叶片的提取方法，不仅能从未储存的成熟叶和老叶叶片中提取高产量的基因组DNA，还能有效的从低温长久储存的成熟叶片和老叶片中提取到高产量高质量的基因组DNA。

三、紫外分光光度计法检测本方法提取的油桐基因组DNA的质量和产量

以本方法提取的油桐成熟叶片(储存0天)四批次基因组DNA为例，用紫外分光光度计(型号为Ultrospec 1100)检测其质量和产量。分别测定4批次DNA在波长260纳米、230纳米和280纳米的吸光值，并计算A260/A280和A260/A230的比值，结果见下表：

通过本提取方法获得的油桐基因组DNA样本的A260/A280比值均在1.8～1.9范围之内，而A260/A230的比值均大于2.0，说明获得的基因组DNA样本中多酚、多糖、色素及蛋白质等杂质较少，基因组DNA纯度较高；而4批次基因组DNA的浓度范围在137～750ng/μl之间，得到的油桐基因组DNA产量高。

Claims

1.一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法，其特征在于包括下列步骤：

①将叶片组织样品在液氮速冻下磨成细粉后，取0.3g转入2mL离心管中，加入1.5mL洗液，充分混匀后，冰中静止15min，12000rpm离心弃上清液；

③12000rpm常温离心15min，转移上清液到新的1.5mL离心管中，加入100μl的24∶1的氯仿-异戊醇，充分混匀后，常温12000rpm离心15min，抽提1～2次，抽提后的上清液转入新的离心管中，加入两倍体积的提前预冷到-20℃的100％酒精；放置于-20℃冰柜30min，让DNA沉淀充分析出，将析出的DNA沉淀转移到含有1mL 70％酒精的1.5mL离心管中，漂洗1～2次，每次30min，倒干酒精，待DNA沉淀干燥后，用100μl的T_0.1E充分溶解，并用1μl浓度为10μg/mLRNA酶37℃消化30min，该过程得到的DNA样品，称为1^stDNA；

2.按权利要求1所述的一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法，其特征在于：

所述的洗液的成分为：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，350mM山梨醇，2％PVP，0.5％β-巯基乙醇PH值为8.0。

3.按权利要求1所述的一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法，其特征在于：

所述的3％CTAB提取液成分为：3％CTAB，100mM Tris-HCl，20mM EDTA，1.4MNaCl，2％PVP，0.5％β-巯基乙醇，pH值为8.0。

4.按权利要求1所述的一种油桐成熟叶片和老叶片基因组DNA提取方法，其特征在于：

所述的T_0.1E成分为：10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.0。