CN103540585A - 一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，该方法的特征在于用常规的Trizol法(Invitrogen公司)提取RNA后，加入苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)进行抽提一次，然后转移上清液至一新管，加入上清液0.7倍体积异丙醇和总体积0.2倍体积1mol/L醋酸钠进行沉淀RNA，所获得的RNA使用1mL 3mol/L醋酸钠(pH＝5.2)和1mL 75％乙醇各清洗一次，最后经过干燥，用DEPC水溶解，这种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度高，可以满足反转录、Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究。
Description
一、技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种提取马铃薯块茎RNA的方法。
二、背景技术
马铃薯(Solaunm tuberosum L.)是世界上重要的粮食作物、工业原料和保健食品，尤其是块茎与人类的关系尤为密切，在马铃薯基因组序列测定后，研究块茎中基因的功能至关重要，而获得高纯度、高质量的RNA是进行Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究必要前提和关键。
马铃薯块茎中含有大量淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物，会严重影响其总RNA提取质量，例如液氮研磨时块茎中的大量淀粉会失水成干粉状，加入变性液后干粉迅速吸水呈凝胶状，即使通过高速离心亦无法使其与液相分离，导致RNA被包裹其中而无法提取；而块茎中的多糖会使RNA沉淀难溶于水，或者溶解后成粘稠状，同时多糖可以抑制许多酶的活性；多酚类化合物在研磨后匀浆时会被释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，被氧化的酚类化合物(如醌类)能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。
目前，总RNA提取方法很多，主要有异硫氰酸胍法、CTAB法、Chan法、SDS法、Logeman法、苯酚法、Trizol法等。DAVID等(1998)通过采用加有尿素的裂解液和氯化锂沉淀的方法，从马铃薯块茎周皮组织中提取到高质量的RNA；杨建文等(2006)利用改进的异硫氰酸胍法提取到高质量的马铃薯块茎RNA；赵宝勰等(2010)分别采用Chan法和Trizol法提取马铃薯块茎总RNA，结果表明：Chan法比Trizol法更适宜提取马铃薯块茎总RNA；刘柏林等(2012)选用3种快捷的商品化提取试剂提取马铃薯块茎总RNA，结果表明：3种商品化试剂均可不同程度的提取马铃薯块茎总RNA，但纯度和浓度存在较大差异。Trizol法自问世以来，由于其操作简单方便，耗时较短，被广泛应用于组织的RNA提取，但它对于富含淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物马铃薯块茎效果不理想。
三、发明内容
本发明的目的在于克服现有方法的缺点与不足，提供一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，该方法提取的马铃薯块茎总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度高。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，包含以下步骤：
(1)取新鲜块茎加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入1mL Trizol试剂，充分混匀，25℃静置5min；
(2)4℃，12000r/min离心5min，直接倒上清入新1.5mL离心管中；
(3)将步骤(2)收集的上清液中加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min离心15min；
(4)将步骤(3)收集的上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃沉淀30min；
(5)4℃，12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗沉淀，4℃，8000r/min离心5min，弃上清，干燥；
(6)将步骤(5)干燥的沉淀加入500μl DEPC水溶解，再加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，4℃，12000r/min离心20min；
(7)将步骤(6)收集的上清转移至新1.5mL离心管中，加入上清液0.7倍体积异丙醇和总体积0.2倍体积1mol/L醋酸钠，上下颠倒混匀；
(8)-20℃沉淀30min。4℃，12000r/min离心20min，弃上清，加入1mL 3mol/L醋酸钠(PH＝5.2)清洗，4℃，10000r/min离心5min；
(9)弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀，在超净工作台干燥，加入DEPC水溶解，-20℃储存备用。
RNA提取中所用的试剂和耗材均用DEPC进行处理。
综上所述改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法适用于富含淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物的植物组织的总RNA提取。
本发明相对于现有Trzol法，具有如下的优点及有益效果：
本发明所述改良Trzol法提取马铃薯块茎总RNA的步骤虽然繁琐一些，时间较长一些，但是总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度高，可以满足反转录、Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究，例如利用本法提取的马铃薯块茎总RNA杂质较少，28S、18S和5S条带清晰，28S条带的亮度是18S条带的两倍左右，而常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的电泳效果要差一些，28S条带的亮度并不是18S条带的两倍左右，杂质较多(附图1)，通过对两种方法提取的RNA进行纯度检测，发现改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNAOD260/OD280比值在1.8-2.0之间，要明显高于常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的INA样品(表1)，说明改良Trizo1法提取RNA纯度较好，而常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的RNAOD260/OD280比值低于1.8，说明有蛋白质和有机溶剂的污染，对于这4个样品的RNAOD260/OD230比值高于2，说明没有盐离子的残留。
表1提取RNA样品的纯度检测
表1提取RNA样品的纯度检测
1和2编号为改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA样品，3和4编号为Trizol法提取马铃薯块茎总RNA样品。
四、附图说明
图1为本发明的改良Trizo1法和常规Trizo1法(Invitrogen公司)提取的马铃薯块茎总RNA的琼脂糖凝胶电泳图，1和2泳道为改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA，3和4泳道为Trizol法提取马铃薯块茎总RNA。
五、具体实施方式
(1)取新鲜块茎约O.1g，加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入1mLTrizol试剂，充分混匀，25℃静置5min；(2)4℃，12000r/min离心5min，直接倒上清入新1.5mL离心管中；(3)将步骤(2)收集的上清液中加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min离心15min；(4)将步骤(3)收集的上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃沉淀30min；(5)4℃，12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗沉淀，4℃，8000r/min离心5min，弃上清，干燥；(6)将步骤(5)干燥的沉淀加入500μl DEPC水溶解，再加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，4℃，12000r/min离心20min；(7)将步骤(6)收集的上清转移至新1.5mL离心管中，加入上清液O.7倍体积异丙醇和总体积0.2倍体积1mol/L醋酸钠，上下颠倒混匀；(8)-20℃沉淀30min。4℃，12000r/min离心20min，弃上清，加入1mL 3mol/L醋酸钠(PH＝5.2)清洗，4℃，10000r/min离心5min；(9)弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀，在超净工作台干燥，加入40μl DEPC水溶解，-20℃储存备用。
Claims (1)
1.一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，其特征在于以下操作：
a、取新鲜块茎约0.1g，加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入1mL Trizol试剂，充分混匀，25℃静置5min，4℃，12000r/min离心5min，直接倒上清入新1.5mL离心管中，加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃沉淀30min；
b、4℃，12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗沉淀，4℃，8000r/min离心5min，弃上清，加入500μl DEPC水溶解沉淀，再加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，4℃，12000r/min离心20min；
c、吸取上清至新1.5mL离心管中，加入0.7倍体积异丙醇和0.2倍体积1mol/L醋酸钠，上下颠倒混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min离心20min，弃上清，加入1mL 3mol/L醋酸钠(PH＝5.2)清洗，4℃，10000r/min离心5min，弃上清，75％乙醇洗沉淀；
d、沉淀在超净工作台干燥，加入40μl DEPC水溶解，储存备用。
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| CN (1) | CN103540585A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106282162A (zh) * | 2016-08-16 | 2017-01-04 | 绵阳市农业科学研究院 | 一种用于提取块茎、块根高质量rna的方法 |
| CN107513529A (zh) * | 2017-10-24 | 2017-12-26 | 刘俊男 | 一种纯化rna的方法以及试剂组合 |
| CN108728454A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-02 | 四川农业大学 | 一种马铃薯StDWF1基因及其制备方法以及过表达该基因以促进马铃薯快速生根的方法 |
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2012
- 2012-07-15 CN CN201210256346.9A patent/CN103540585A/zh active Pending
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Application publication date: 20140129 |