CN103484448A - 一种提取铁皮石斛rna的方法 - Google Patents

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李聪
斯金平
朱玉球
高燕会
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Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛RNA的提取方法，包括下述过程：铁皮石斛幼嫩叶片低温研磨，利用CTAB提取缓冲液进行细胞裂解、离心分离过程，其特征在于：所述的铁皮石斛组织与提取液混合物经离心后的上清液，以等量的10MLiCl混合，静置后再离心分离、沉淀，再用Trizol法提取RNA的过程。由于本发明通过对现有的CTAB法进行改良，加入CTAB提取液充分裂解后直接利用等体积高浓度LiCl进行RNA沉淀，并同时利用高浓度LiCl去掉分离液中的多糖，不仅最大程度保留了RNA，同时也去除了大部分多糖，提高了RNA纯度。

Description

一种提取铁皮石斛RNA的方法
技术领域
本发明涉及一种RNA的提取方法，尤其涉及到一种利用改良CTAB法与Trizol法相结合提取铁皮石斛RNA的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生附生草本植物,2010年版《中国药典》单独收载，具有独特的药用价值，为石斛之极品。在研究铁皮石斛遗传学基础中，RNA的提取是一项基础性的工作。目前国内外提取RNA通常采用CTAB法进行：提取材料中加入CTAB提取液后充分裂解，离心之后，取其上清液先用氯仿异戊醇抽提2~3次，去除蛋白及一些色素及杂质；然后取上清液，加入四分之一体积10 M LiCl 4 ℃过夜沉淀，沉淀完之后用SSTE溶解，然后再用无水乙醇沉淀最终得到RNA。由于铁皮石斛多糖含量很高，普通的CTAB法中，少量的LiCl不能充分沉淀RNA，另外氯仿异戊醇主要作用是去蛋白，而铁皮石斛蛋白含量很低，在加入CTAB提取液充分裂解后加入氯仿异戊醇抽提2~3次不仅没有必要，而且可造成RNA的大量损失。因此，用现有的CTAB 法提取铁皮石斛RNA效率比较低，且所获得的RNA的纯度也不高。
发明内容
本发明提供的是一种高效提取铁皮石斛的RNA的方法，将改良的CTAB法与Trizol法结合，可以提取高质量的铁皮石斛RNA，然后进行转录组测序，以便于铁皮石斛在分子领域中的后续研究。
本发明是通过下述方式实现的：一种提取铁皮石斛RNA的方法，包括下述过程：
用液氮冷却研钵将铁皮石斛幼嫩叶片研磨，充分研磨后，立即加入到预热好的CTAB提取缓冲液中，均匀摇动；
将铁皮石斛组织与提取液混合物置于65℃水浴条件下20 min后，冷却至室温，4 ℃，12000 rpm离心10 min；
其特征在于：所述的铁皮石斛组织与提取液混合物经离心后的上清液，以等量的10 M LiCl混合，溶液在4 ℃条件静置8-12小时，4 ℃条件下，12000 rpm离心20 min；
弃上清液，用75%乙醇清洗沉淀，在4 ℃条件下，12000 rpm离心5 min，弃上清液；
用SSTE溶解沉淀，然后加入Trizol，摇匀后加入氯仿，4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；
取上清液，加入与上清液等体积氯仿与异戊醇的混合液，其中氯仿：异戊醇按24：1比例配合，在4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；
取上清液，加与上清液等体积异丙醇，-20 ℃沉淀至少20 min， 4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；
弃上清液，用75%乙醇清洗沉淀，连续洗涤两次，干燥沉淀，得纯铁皮石斛RNA。
由于本发明通过对现有的CTAB法进行改良，加入CTAB提取液充分裂解后直接利用等体积高浓度LiCl进行RNA沉淀，并同时利用高浓度LiCl去掉分离液中的多糖，不仅最大程度保留了RNA，同时也去除了大部分多糖，提高了RNA纯度。
附图说明
图1 为本发明的工艺流程图
图2为样本78×72用本发明方法提取总RNA凝胶电泳图；
图3为样本78×72以用CTAB法提取总RNA凝胶电泳图；
图4为样本A39用本发明方法提取总RNA凝胶电泳图；
图5为样本A39用CTAB法提取总RNA凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例：
一、材料准备：
试验所用的铁皮石斛种植于浙江农林大学遗传学科实验基地，本实验选用两种种质：78×72（多糖含量较高）和A39（多糖含量较低），采集其幼嫩叶片，于液氮中快速冷冻后保存于-70℃的超低温冰箱备用.
CTAB溶液：2% CTAB，2% PVP，100 mmol·L-1 Tris-HCL(PH 8.0),25 mmol·L-1 EDTA,2.0 mol·L-1 NaCl。
SSTE：1.0 mol·L-1 NaCl,0.5% SDS,1 mmol·L-1 EDTA(PH 8.0),10 mmol·L-1 Tris-HCl(PH 8.0)。Trizol（RNAiso Plus(D9108B)）为Takara公司产品，琼脂糖为Promega 公司产品，其他试剂均为分析纯。
二、总RNA提取，具体提取步骤如下（见图1）：
1.      将1 ml CTAB提取液、20 uLβ-巯基乙醇于2 mL离心管中，65℃水浴20 min；
2.      用液氮冷却研钵，取100 mg左右铁皮石斛幼嫩叶片（嫩叶提取效果最佳），迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，均匀摇动；
3.      65℃水浴20 min后冷却至室温，4 ℃12000 rpm离心10 min；
4.      取上清，加入等体积的10M的LiCl混合，4 ℃溶液过夜，然后4 ℃12000 rpm离心20 min；
5.      弃上清，用500 uL的75%乙醇清洗沉淀，4 ℃12000 rpm离心5 min，弃上清；
6.      用500 uL的SSTE溶解沉淀，然后加800 mL的trizol，摇匀后加200 mL氯仿，4 ℃12000 rpm离心10 min；
7.      取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀。4 ℃，12000 rpm离心10 min；
8.      取上清，加等体积异丙醇，-20 ℃沉淀至少20 min，4 ℃，12000 rpm离心10 min；
9.      弃上清，用500 uL的75%乙醇清洗沉淀，连续洗涤两次，干燥沉淀，得纯铁皮石斛RNA。
三、结果与分析
1、对铁皮石斛种质78×72和A39用本发明方法提取的总RNA进行OD值检测。结果见表1。
表1 本发明方法提取铁皮石斛RNA质量
注：表中78×72①、78×72②代表用本发明方法提取铁皮石斛种质78×72 RNA的两个平行；表中A39①、A39②代表用本发明方法提取铁皮石斛种质A39总 RNA的两个平行。
    从表1 可以看出，不论是种质78×72还是A39，从100 mg左右铁皮石斛新鲜材料中RNA平均得率0.245 ug/mg, 显示RNA得率很高。其A260/A280平均为2.14, A260/A230平均为2.27, 显示RNA很纯,没有被蛋白质或酚等污染。
对铁皮石斛种质78×72和A39用CTAB法提取的总RNA进行OD值检测。结果见表2。
表2 CTAB方法提取铁皮石斛RNA质量
注：表中78×72③、78×72④代表用CTAB方法提取铁皮石斛种质78×72 RNA的两个平行；表中A39③、A39④代表用CTAB方法提取铁皮石斛种质A39总 RNA的两个平行。
   从表2 可以看出，不论是铁皮石斛种质78×72还是A39，从100 mg左右铁皮石斛新鲜材料中RNA平均得率仅有0.033ug/mg, 表明RNA得率很低。
2、对提取的总RNA进行电泳分析
对铁皮石斛种质78×72用本发明方法和CTAB法分别提取的总RNA进行琼脂糖电泳检测。结果见图2、图3。
从图2和图3可以看出，铁皮石斛种质78×72用本发明方法提取的总RNA，28S和18S的两条带都比较清晰,且28S/18S比值约为2, 5S条带也比较明显，说明提取的总RNA完整性和质量很好。而用CTAB法提取的总RNA条带不够清晰，而且明显混有DNA，需要进一步的纯化处理。
对铁皮石斛种质A39用本发明方法和CTAB法分别提取的总RNA进行琼脂糖电泳检测，结果见图4、图5。
从图4和图5可以看出，铁皮石斛种质A39用本发明方法提取的总RNA，28S和18S的两条带特别清晰,且28S/18S比值约为2, 5S条带也比较明显，说明提取的总RNA完整性和质量很好。而用CTAB法提取的总RNA条带不明显，很暗，而且明显混有少量DNA，需要进一步的纯化处理。 

Claims (1)

1.一种提取铁皮石斛RNA的方法，其特征在于包括下述过程：
用液氮冷却研钵将铁皮石斛幼嫩叶片研磨，充分研磨后，立即加入到预热好的CTAB提取缓冲液中，均匀摇动；将铁皮石斛组织与提取液混合物置于65℃水浴条件下20 min后，冷却至室温，4 ℃，12000 rpm离心10 min，其特征在于：它还包括下述步骤：
a. 所述的铁皮石斛组织与提取液混合物经离心后的上清液，以等量的10 M LiCl混合，溶液在4 ℃条件静置8-12小时，4 ℃条件下，12000 rpm离心20 min；
b. 上清液，用75%乙醇清洗沉淀，在4 ℃条件下，12000 rpm离心5 min，弃上清液；
c.  SSTE溶解沉淀，然后加入trizol，摇匀后加入氯仿，4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；
d. 上清液，加入与上清液等体积氯仿与异戊醇的混合液，其中氯仿：异戊醇按24：1比例配合，在4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；
e. 取上清液，加与上清液等体积异丙醇，-20 ℃沉淀至少20 min， 4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；
f. 弃上清，用500 uL的75%乙醇清洗沉淀，连续洗涤两次，干燥沉淀，得纯铁皮石斛RNA。
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