CN103484448A - 一种提取铁皮石斛rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛RNA的提取方法,包括下述过程:铁皮石斛幼嫩叶片低温研磨,利用CTAB提取缓冲液进行细胞裂解、离心分离过程,其特征在于:所述的铁皮石斛组织与提取液混合物经离心后的上清液,以等量的10MLiCl混合,静置后再离心分离、沉淀,再用Trizol法提取RNA的过程。由于本发明通过对现有的CTAB法进行改良,加入CTAB提取液充分裂解后直接利用等体积高浓度LiCl进行RNA沉淀,并同时利用高浓度LiCl去掉分离液中的多糖,不仅最大程度保留了RNA,同时也去除了大部分多糖,提高了RNA纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种RNA的提取方法,尤其涉及到一种利用改良CTAB法与Trizol法相结合提取铁皮石斛RNA的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生附生草本植物,2010年版《中国药典》单独收载,具有独特的药用价值,为石斛之极品。在研究铁皮石斛遗传学基础中,RNA的提取是一项基础性的工作。目前国内外提取RNA通常采用CTAB法进行:提取材料中加入CTAB提取液后充分裂解,离心之后,取其上清液先用氯仿异戊醇抽提2~3次,去除蛋白及一些色素及杂质;然后取上清液,加入四分之一体积10 M LiCl 4 ℃过夜沉淀,沉淀完之后用SSTE溶解,然后再用无水乙醇沉淀最终得到RNA。由于铁皮石斛多糖含量很高,普通的CTAB法中,少量的LiCl不能充分沉淀RNA,另外氯仿异戊醇主要作用是去蛋白,而铁皮石斛蛋白含量很低,在加入CTAB提取液充分裂解后加入氯仿异戊醇抽提2~3次不仅没有必要,而且可造成RNA的大量损失。因此,用现有的CTAB 法提取铁皮石斛RNA效率比较低,且所获得的RNA的纯度也不高。
发明内容
本发明提供的是一种高效提取铁皮石斛的RNA的方法,将改良的CTAB法与Trizol法结合,可以提取高质量的铁皮石斛RNA,然后进行转录组测序,以便于铁皮石斛在分子领域中的后续研究。
本发明是通过下述方式实现的:一种提取铁皮石斛RNA的方法,包括下述过程:
用液氮冷却研钵将铁皮石斛幼嫩叶片研磨,充分研磨后,立即加入到预热好的CTAB提取缓冲液中,均匀摇动;
将铁皮石斛组织与提取液混合物置于65℃水浴条件下20 min后,冷却至室温,4 ℃,12000 rpm离心10 min;
其特征在于:所述的铁皮石斛组织与提取液混合物经离心后的上清液,以等量的10 M LiCl混合,溶液在4 ℃条件静置8-12小时,4 ℃条件下,12000 rpm离心20 min;
弃上清液,用75%乙醇清洗沉淀,在4 ℃条件下,12000 rpm离心5 min,弃上清液;
用SSTE溶解沉淀,然后加入Trizol,摇匀后加入氯仿,4 ℃条件下,12000 rpm离心10 min;
取上清液,加入与上清液等体积氯仿与异戊醇的混合液,其中氯仿:异戊醇按24:1比例配合,在4 ℃条件下,12000 rpm离心10 min;
取上清液,加与上清液等体积异丙醇,-20 ℃沉淀至少20 min, 4 ℃条件下,12000 rpm离心10 min;
弃上清液,用75%乙醇清洗沉淀,连续洗涤两次,干燥沉淀,得纯铁皮石斛RNA。
由于本发明通过对现有的CTAB法进行改良,加入CTAB提取液充分裂解后直接利用等体积高浓度LiCl进行RNA沉淀,并同时利用高浓度LiCl去掉分离液中的多糖,不仅最大程度保留了RNA,同时也去除了大部分多糖,提高了RNA纯度。
附图说明
图1 为本发明的工艺流程图
图2为样本78×72用本发明方法提取总RNA凝胶电泳图;
图3为样本78×72以用CTAB法提取总RNA凝胶电泳图;
图4为样本A39用本发明方法提取总RNA凝胶电泳图;
图5为样本A39用CTAB法提取总RNA凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例:
一、材料准备:
试验所用的铁皮石斛种植于浙江农林大学遗传学科实验基地,本实验选用两种种质:78×72(多糖含量较高)和A39(多糖含量较低),采集其幼嫩叶片,于液氮中快速冷冻后保存于-70℃的超低温冰箱备用.
CTAB溶液:2% CTAB,2% PVP,100 mmol·L-1 Tris-HCL(PH 8.0),25 mmol·L-1 EDTA,2.0 mol·L-1 NaCl。
SSTE:1.0 mol·L-1 NaCl,0.5% SDS,1 mmol·L-1 EDTA(PH 8.0),10 mmol·L-1 Tris-HCl(PH 8.0)。Trizol(RNAiso Plus(D9108B))为Takara公司产品,琼脂糖为Promega 公司产品,其他试剂均为分析纯。
二、总RNA提取,具体提取步骤如下(见图1):
1. 将1 ml CTAB提取液、20 uLβ-巯基乙醇于2 mL离心管中,65℃水浴20 min;
2. 用液氮冷却研钵,取100 mg左右铁皮石斛幼嫩叶片(嫩叶提取效果最佳),迅速置于研钵中,不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化,充分研磨后,立即加入到预热好的提取缓冲液中,均匀摇动;
3. 65℃水浴20 min后冷却至室温,4 ℃12000 rpm离心10 min;
4. 取上清,加入等体积的10M的LiCl混合,4 ℃溶液过夜,然后4 ℃12000 rpm离心20 min;
5. 弃上清,用500 uL的75%乙醇清洗沉淀,4 ℃12000 rpm离心5 min,弃上清;
6. 用500 uL的SSTE溶解沉淀,然后加800 mL的trizol,摇匀后加200 mL氯仿,4 ℃12000 rpm离心10 min;
7. 取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),涡旋混匀。4 ℃,12000 rpm离心10 min;
8. 取上清,加等体积异丙醇,-20 ℃沉淀至少20 min,4 ℃,12000 rpm离心10 min;
9. 弃上清,用500 uL的75%乙醇清洗沉淀,连续洗涤两次,干燥沉淀,得纯铁皮石斛RNA。
三、结果与分析
1、对铁皮石斛种质78×72和A39用本发明方法提取的总RNA进行OD值检测。结果见表1。
表1 本发明方法提取铁皮石斛RNA质量
注:表中78×72①、78×72②代表用本发明方法提取铁皮石斛种质78×72 RNA的两个平行;表中A39①、A39②代表用本发明方法提取铁皮石斛种质A39总 RNA的两个平行。
从表1 可以看出,不论是种质78×72还是A39,从100 mg左右铁皮石斛新鲜材料中RNA平均得率0.245 ug/mg, 显示RNA得率很高。其A260/A280平均为2.14, A260/A230平均为2.27, 显示RNA很纯,没有被蛋白质或酚等污染。
对铁皮石斛种质78×72和A39用CTAB法提取的总RNA进行OD值检测。结果见表2。
表2 CTAB方法提取铁皮石斛RNA质量
注:表中78×72③、78×72④代表用CTAB方法提取铁皮石斛种质78×72 RNA的两个平行;表中A39③、A39④代表用CTAB方法提取铁皮石斛种质A39总 RNA的两个平行。
从表2 可以看出,不论是铁皮石斛种质78×72还是A39,从100 mg左右铁皮石斛新鲜材料中RNA平均得率仅有0.033ug/mg, 表明RNA得率很低。
2、对提取的总RNA进行电泳分析
对铁皮石斛种质78×72用本发明方法和CTAB法分别提取的总RNA进行琼脂糖电泳检测。结果见图2、图3。
从图2和图3可以看出,铁皮石斛种质78×72用本发明方法提取的总RNA,28S和18S的两条带都比较清晰,且28S/18S比值约为2, 5S条带也比较明显,说明提取的总RNA完整性和质量很好。而用CTAB法提取的总RNA条带不够清晰,而且明显混有DNA,需要进一步的纯化处理。
对铁皮石斛种质A39用本发明方法和CTAB法分别提取的总RNA进行琼脂糖电泳检测,结果见图4、图5。
从图4和图5可以看出,铁皮石斛种质A39用本发明方法提取的总RNA,28S和18S的两条带特别清晰,且28S/18S比值约为2, 5S条带也比较明显,说明提取的总RNA完整性和质量很好。而用CTAB法提取的总RNA条带不明显,很暗,而且明显混有少量DNA,需要进一步的纯化处理。
Claims (1)
1.一种提取铁皮石斛RNA的方法,其特征在于包括下述过程:
用液氮冷却研钵将铁皮石斛幼嫩叶片研磨,充分研磨后,立即加入到预热好的CTAB提取缓冲液中,均匀摇动;将铁皮石斛组织与提取液混合物置于65℃水浴条件下20 min后,冷却至室温,4 ℃,12000 rpm离心10 min,其特征在于:它还包括下述步骤:
a. 所述的铁皮石斛组织与提取液混合物经离心后的上清液,以等量的10 M LiCl混合,溶液在4 ℃条件静置8-12小时,4 ℃条件下,12000 rpm离心20 min;
b. 上清液,用75%乙醇清洗沉淀,在4 ℃条件下,12000 rpm离心5 min,弃上清液;
c. SSTE溶解沉淀,然后加入trizol,摇匀后加入氯仿,4 ℃条件下,12000 rpm离心10 min;
d. 上清液,加入与上清液等体积氯仿与异戊醇的混合液,其中氯仿:异戊醇按24:1比例配合,在4 ℃条件下,12000 rpm离心10 min;
e. 取上清液,加与上清液等体积异丙醇,-20 ℃沉淀至少20 min, 4 ℃条件下,12000 rpm离心10 min;
f. 弃上清,用500 uL的75%乙醇清洗沉淀,连续洗涤两次,干燥沉淀,得纯铁皮石斛RNA。
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