CN106801051B - 一种用于提取植物rna的试剂盒以及提取方法 - Google Patents

一种用于提取植物rna的试剂盒以及提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于提取植物RNA的试剂盒以及提取方法。本发明用于提取植物RNA的试剂盒包括：溶液A：1～2％SDS、10～100mM EDTA(pH 8.0)、0.1～1M Tris‑HCl(pH 7.0～8.0)、0.5～2M NaCl和1～10％β‑巯基乙醇；溶液B：3～7M KAC；溶液C：水饱和酚(pH 4.5)；溶液D：体积比为24：1的氯仿和异戊醇；溶液E：异丙醇。本发明用于提取植物RNA的试剂盒可以高效提取得到纯度高且完整性好的植物RNA，是分子生物学的多项实验研究的关键前提，具有良好的应用前景和实用价值。本发明还公开了一种使用上述试剂盒提取RNA的方法。

Description

一种用于提取植物RNA的试剂盒以及提取方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，更具体地说，本发明涉及一种可以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA的试剂盒以及相应的提取方法。
背景技术
在进行植物基因克隆、Northern杂交分析、cDNA文库构建、RT-PCR和Realtime PCR等分子生物学的研究中，需要得到完整的RNA；近年兴起的高通量测序，对RNA的质量和浓度要求更高，高通量测序的RNA浓度要求大于200ng/uL，总量大于15ug。从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA，是顺利进行上述的实验关键。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年附生草本植物。由于其水溶性多糖含量较高，从中提取RNA非常困难。这是因为植物组织中水溶性多糖的理化性质与RNA相似，溶于水而不溶于有机溶剂(无水乙醇、异丙醇)，很难将它们分开。另外多糖可以还能抑制许多酶的活性，污染了水溶性多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。另外，由于富含多酚类的植物，在植物组织受到破坏后，就会释放出大量的酚，酚被氧化而形成褐色醌类物质能与RNA稳定结合，很难分离；淀粉也是一类降低RNA质量和产量的物质。所以很难从富含水溶性多糖、多酚和淀粉的植物材料中分离提取到高纯度、高浓度完整的RNA。
目前针对富含水溶性多糖、多酚和淀粉的植物的RNA提取方法和RNA提取试剂盒的效果均不理想，有人通过CTAB法针对富含水溶性多糖多酚的植物进行RNA提取，但存在RNA降解的问题，提取效率低；还有人使用改良版SDS法对植物进行RNA提取，经实验，提取过程中溶液会粘稠成团，无法摇匀，无法进行下一步实验；还有人使用天泽RNA Out2.0进行RNA提取，在水溶性多糖含量低于20％时可以提取到RNA，但效率较低，只能满足一些常规实验，无法满足高通量测序的需求；当水溶性多糖含量更高时，水溶性多糖会与RNA缠绕在一起堵住滤膜，无法洗脱。还有使用低浓度乙醇处理、氯化锂沉淀法等来去除水溶性多糖，但均会使RNA提取效率大大降低。
有鉴于此，确有必要提供一种可以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA的试剂盒以及相应的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有植物RNA提取中，当植物水溶性多糖、多酚、蛋白质含量较高时出现的影响RNA提取效率等问题，提供一种可以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA的试剂盒以及相应的提取方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于提取植物RNA的试剂盒，包括：
溶液A：1～2％SDS、10～100mM EDTA(pH 8.0)、0.1～1M Tris-HCl(pH 7.0～8.0)、0.5～2M NaCl和1～10％β-巯基乙醇；
溶液B：3～7M KAC；
溶液C：水饱和酚；
溶液D：体积比为24：1的氯仿和异戊醇；
溶液E：异丙醇。
作为本发明用于提取植物RNA的试剂盒的一种改进，所述试剂盒还包括溶液F，其中，所述溶液F为含有75％乙醇，用于对RNA沉淀进行洗涤。
作为本发明用于提取植物RNA的试剂盒的一种改进，所述植物为富含水溶性多糖、富含多酚和/或富含淀粉类的植物。
作为本发明用于提取植物RNA的试剂盒的一种改进，所述植物为铁皮石斛、菠萝蜜叶片或水稻种子。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种使用上述试剂盒提取植物RNA的方法，包括如下步骤：
(1)粉碎植物样品；
(2)加入权利要求1中所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D，将植物样品的细胞壁裂解并去除植物样品中的水溶性多糖、多酚和淀粉；
(3)加入权利要求1中所述溶液E，将步骤(2)所得中间产物进行沉淀，得到植物RNA。
当所述提取植物RNA的试剂盒中含有溶液F时，所述植物RNA的提取方法包括如下步骤：
(1)粉碎植物样品；
(2)加入权利要求1中所述溶液A、溶液B、溶液C和溶液D，将植物样品的细胞壁裂解并去除植物样品中的水溶性多糖、多酚和蛋白质；
(3)加入权利要求1中所述溶液E和溶液F，将步骤(2)所得中间产物进行沉淀，得到植物RNA。
作为本发明植物RNA的提取方法的一种改进，步骤(1)中，所述粉碎植物样品是在液氮中将植物样品研磨成粉末。
作为本发明植物RNA的提取方法的一种改进，所述植物样品为富含水溶性多糖、富含多酚和/或富含淀粉类的植物。
作为本发明植物RNA的提取方法的一种改进，所述植物样品为铁皮石斛、菠萝蜜叶片或水稻种子。
与现有技术相比，本发明用于提取植物RNA的试剂盒及相应的RNA提取方法具有如下优点：
1)本发明实验步骤少，操作简单，可大大缩短实验时间，缩短时间可有效防止RNA降解，减少操作步骤可最大限度减少RNA在操作过程中的损失；
2)本发明用于提取植物RNA的试剂盒适用于各种植物，特别适用于富含水溶性多糖、多酚和/或淀粉量高的植物，提取得到的RNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序；
3)本发明用于提取植物RNA的试剂盒中所用药品为一般实验药品，对人体无害，对环境友好。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明用于提取植物RNA的试剂盒及提取方法及其有益效果进行详细说明。
图1为铁皮石斛茎中的水溶性多糖百分含量，其中，Stage 1表示生长期为10个月的铁皮石斛茎中的水溶性多糖百分含量，Stage 2表示生长期为12个月的铁皮石斛茎中的水溶性多糖百分含量。
图2为实施例1中的铁皮石斛的RNA电泳图，其中，1表示生长期为10个月的铁皮石斛茎的RNA，2表示生长期为12个月的铁皮石斛茎的RNA。
图3为Agilent2100检测生长期为10个月的铁皮石斛茎的RNA。
图4为Agilent2100检测生长期为12个月的铁皮石斛茎的RNA。
图5为实施例2中的菠萝蜜叶片的RNA电泳图。
图6为实施例3中的水稻种子的RNA电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的配方、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
以下实施例中使用本发明植物RNA提取试剂盒可采用如下操作步骤：
(1)取0.1g的植物材料于研钵中，液氮充分研磨成粉末，装入1.5mL的离心管中，加入800～1000uL的Solution A，充分混匀。65℃金属浴15～20min，每3～5min摇匀一次。13000rpm离心5min。
(2)取上清于1.5mL的离心管中，加入0～1/2体积的Solution B，充分混匀。-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心10min。(若水溶性多糖含量低于20％，可以省略)
(3)取上清液，加入1/2体积的Solution C，充分混匀，-20℃放置5min；4℃、13000rpm离心10min。
(4)取上清于2mL的离心管中，加入等体积的Solution D，充分混匀，4℃、13000rpm离心10min。
(5)取上清，加入等体积的Solution E，-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心15min。
(6)弃上清，用Solution F洗涤沉淀2次，离心，用枪头尽可能去残液，室温放置3min，使残留的酒精挥发，加入30～80uL的DEPC H2O，取2uL电泳检测或进行其他的质量检测。
实施例1铁皮石斛茎中RNA的提取
从生长期为10个月和12个月的铁皮石斛茎中提取RNA(样品中水溶性多糖含量请参见图1)：
(1)取0.6g的生长期为10个月和生长期为12个月的铁皮石斛茎杆于研钵中，液氮充分研磨成粉末，分装于6个1.5mL的离心管中，分别加入1mL的Solution A，充分混匀。65℃金属浴20min，每5min摇匀一次。
(2)13000rpm离心5min，将溶于Solution A中的核酸和一些不溶物质如细胞壁碎片等分开。
(3)取900uL的上清于1.5mL的离心管中，加入300uL的Solution B，充分混匀。-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心10min。
(4)取上1000uL的上清液，加入500uL的Solution C，充分混匀，-20℃放置5min；4℃、13000rpm离心10min。
(5)取900uL的上清于2mL的离心管中，加入900uL的Solution D，充分混匀，4℃、13000rpm离心10min。
(6)取800uL上清，加入800uL的Solution E，-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心15min。
(7)弃上清，用Solution F洗2次沉淀，集合6个管中的沉淀为一管，稍离心，用枪头尽可能去残液，室温放3min，使残留的酒精挥发，加入80uL的DEPC H2O，加入DNA酶，进行DNA消化处理，最后进行RNA质量检测。
电泳检测
将10月和12月的铁皮石斛茎的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，可观测到28SRNA，18S RNA，5S RNA三条带，基本无拖带现象(请参见图2)。
NanoDrop 2000分光光度计检测
表1铁皮石斛RNA分光光度计检测结果
Figure BDA0001241944450000081
由表1可见，10月和12月铁皮石斛茎的RNA浓度都大于500ng/L，260/280都在2左右，表明RNA完整性较好，基本无DNA和蛋白污染；260/230都大于2，说明没有碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂的污染。
Agilent2100检测
生长期为10个月和12个月的铁皮石斛茎的RNA经Agilent2100检测，RIN值都为8.5，说明RNA的完整好(请参见图3和图4)。
实施例2菠萝蜜叶片中RNA的提取
菠萝蜜的叶片中含有丰富的酚类和水溶性多糖物质，在组织受到破坏后，很容易褐化，影响RNA的质量和产量。菠萝蜜叶片摘取后，伤口流出白色的汁液，随后变成褐色。目前，菠萝蜜的RNA提取仍有很大的难度。
(1)取0.2g的菠萝蜜叶片于研钵中，液氮充分研磨成粉末，分装于2个1.5mL的离心管中，分别加入1mL的Solution A，充分混匀。65℃金属浴15min，每2min摇匀一次。
(2)13000rpm离心2min。
(3)取900uL上清于2mL的离心管中，加入1/2体积的Solution C，充分混匀，4℃、13000rpm离心10min。
(4)取上清，加入等体积的Solution D，充分混匀，4℃、13000rpm离心10min。
(5)取上清，加入等体积的Solution E，-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心15min。
(6)弃上清，用Solution F洗2次沉淀，稍离心，用枪头尽可能去残液，室温放3min，使残留的酒精挥发，加入30uL的DEPC H2O，取2uL电泳检测。可以看到三条较亮的带，有少量的DNA污染，若要进行下一步的实验，可以进行去DNA处理(请参见图5)。
实施例3水稻种子中RNA的提取
水稻种子中含有丰富的淀粉、含纤维素、半纤维素、可溶性糖以及一些存储型蛋白。
(1)取0.2g的水稻种子于研钵中，液氮充分研磨成粉末，分装于2个1.5mL的离心管中，分别加入1mL的Solution A，充分混匀。65℃金属浴15min，每2min摇匀一次。
(2)13000rpm离心2min。
(3)取900uL上清于2mL的离心管中，加入1/2体积的Solution C，充分混匀，4℃、13000rpm离心10min。
(4)取上清，加入等体积的Solution D，充分混匀，4℃、13000rpm离心10min。
(5)取上清，加入等体积的Solution E，-20℃放置10min；4℃、13000rpm离心15min。
(6)弃上清，用Solution F洗2次沉淀，稍离心，用枪头尽可能去残液，室温放3min，使残留的酒精挥发，加入30uL的DEPC H2O，取2uL电泳检测。可以看到三条较亮的带，有少量的DNA污染，若要进行下一步的实验，可以进行去DNA处理(请参见图6)。
提取纯度高且完整性好的RNA是进行分子生物学相关实验的前提，但是，从富含水溶性多糖、多酚或淀粉类物质的植物组织中提取RNA仍是棘手的难题，本发明为一种快速高效提取富含水溶性多糖、多酚或淀粉类物质的植物材料RNA的方法及相关试剂盒，将有广阔的市场需求。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (1)

1.一种植物RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取0.1 g的植物材料于研钵中，液氮充分研磨成粉末，装入1.5 mL的离心管中，加入800~1000 uL的溶液 A，充分混匀，65℃ 金属浴15~20 min，每3~5 min摇匀一次，13000 rpm离心5 min；
（2）取上清于1.5 mL的离心管中，加入0~1/2体积且不为0的溶液 B，充分混匀，-20℃放置10 min；4℃、13000 rpm 离心10 min；
（3）取上清液，加入1/2体积的溶液 C，充分混匀，-20℃放置5 min；4℃、13000 rpm 离心10 min；
（4）取上清于2 mL的离心管中，加入等体积的溶液 D，充分混匀，4℃、13000 rpm 离心10 min；
（5）取上清，加入等体积的溶液 E，-20℃放置10 min；4℃、13000 rpm 离心15 min；
（6）弃上清，用溶液F洗涤沉淀2次，离心，用枪头尽可能去残液，室温放置3 min，使残留的酒精挥发，加入30~80 uL的DEPC H2O；
溶液A：1~2% SDS、10~100 mM EDTA pH 8.0、0.1~1M Tris-HCl pH 7.0~8.0、0.5~2 MNaCl和1~10% β-巯基乙醇；
溶液B：3~7 M KAC；
溶液C：水饱和酚；
溶液D：体积比为24：1的氯仿和异戊醇；
溶液E：异丙醇；
所述溶液F为含有75%乙醇；
所述植物样品为铁皮石斛。
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