CN113584018A - 莲叶桐核酸提取改良版ctab法 - Google Patents

莲叶桐核酸提取改良版ctab法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生态学实验领域，具体提供了一种针对濒危半红树植物莲叶桐基因组DNA改良版的CTAB提取方法。濒危半红树植物莲叶桐，因富含多糖多酚，其组织研磨液极其粘稠，提取质量好的核酸极其困难。本发明在传统CTAB法基础上采用改进的裂解液对细胞进行裂解，并通过一定比例的Tris平衡酚‑氯仿‑异戊醇混合液进行抽提。再用改进体积的醋酸钠‑异丙醇进行沉淀DNA、纯化DNA，从而获得高质量的基因组DNA。采用本发明提供的濒危半红树植物莲叶桐核酸提取方法提取的DNA浓度高、纯度高，还不易降解，最重要的是能够有效去除多糖多酚。为后续的PCR扩增、分子标记技术开发、基因组文库构建等分子生物学实验奠定基础。

Description

莲叶桐核酸提取改良版CTAB法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种濒危半红树植物莲叶桐核酸提取改良版CTAB法。
背景技术
莲叶桐(Hernandia nymphaeifolia(J.Presl)Kubitzki)是莲叶桐科、莲叶桐属常绿乔木，莲叶桐材料因富含多糖、多酚、高蛋白，成分特殊，提取液极其粘稠，且容易褐化，所以核酸提取较困难。
传统的CTAB法如下：
(1)称取0.2g样品用液氮研磨成粉,置于2ml离心管中，加入800uL经65℃预热的CTAB裂解液(2％(m/v)CTAB，0.1mol/LTris-HClpH8.0,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl).充分混合以后，将其混匀在水浴锅中65℃加热40min,每10min颠倒摇匀数次。
(2)冷却至室温加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1,后充分的颠倒摇匀，25℃，转速设置为每分钟12000rpm,离心约10min。
(3)取上清,加入已预热的1/10倍体积的CTAB/NaCl，充分颠倒混匀。再用相同体积的比例为24:1的氯仿和异戊醇再次抽提，然后低温条件下离心10min，将上清吸取置于2ml的EP管中。
(4)吸取相同体积的CTAB沉淀液于离心管中，进行充分颠倒混匀，在4℃，转速设置为每分钟3500rpm，离心5min，然后取上清，再用500μL的TE缓冲液溶解沉淀，溶解后再加入0.6倍体积的异丙醇，充分颠倒混匀，在4℃，转速设置为每分钟12000rpm,离心15min。
(5)倒上清液，取出一定量70％的乙醇冲洗白色沉淀2次。放置在室温条件下进行风干之后用0.1mLTE缓冲液进行溶解。
采用传统的CTAB法提取的莲叶桐植物基因组DNA过程中出现裂解时细胞裂解不完全，抽提过程中除糖和蛋白不完全，DNA沉淀出现胶状，点样跑胶时出现枪头拉丝，DNA主条带不清晰等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适用于莲叶桐核酸提取的方法，解决采用传统CTAB法提取时出现的细胞裂解不完全，抽提时多糖处理不干净，点样跑胶时出现枪头拉丝、DNA主条带不清晰等问题。
本发明的技术方案为：莲叶桐核酸提取的方法，包括如下步骤：
(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入RNA酶，涡旋震荡1min，混匀后65℃水浴锅中水浴加热40min，每隔10min颠倒摇匀一次，所述裂解液组成为：2％(m/v)CTAB,0.1mol/L Tris-HCl pH8.0,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2％(m/v)β疏基乙醇，2％(m/v)PVP；
(2)放置冷却至室温，加入等体积的Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1,在转速为11000～13500rpm室温下离心10～15min；
(3)取上清液转入一新离心管，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置40～60min，在转速为11000～13500rpm 4℃离心10～15min；
(4)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，加入50～250μLTE缓冲液，充分混匀后，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置40～60min，在转速为11000～13500rpm 4℃离心10～15min；
(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL TE溶解，充分混匀后，置于－20℃冰箱中保存。
进一步地，所述步骤(1)中的RNA酶浓度为20mg/ml。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、裂解液成分：加了PVP、β疏基乙醇、RNaseA。PVP化学名称为聚乙烯吡咯烷酮，它是一种具有较强的溶解性的抗氧化剂。它能够与多酚、多糖结合形成络合物，使得多酚多糖与DNA分离，从而去除杂质。β疏基乙醇主要是抗氧化，它能防止DNA呈褐色，避免植物体内的多酚物质氧化成醌。减少对核酸的损失。加入RNaseA可有效去除DNA中的RNA以及其他的蛋白质杂质。
2、抽提液成分：在传统的氯仿：异戊醇抽提液中，加入了Tris平衡酚。酚能够保持DNA中的水分，减少DNA的损失。
3、沉淀试剂：采用醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，把95％乙醇改成异丙醇，异丙醇具有用量少、速度快的特点，比较适合浓度低、体积大的DNA沉淀。醇类物质具有沉淀DNA，去除多糖的作用。沉淀DNA首选的醇物质是无水乙醇，但是由于本实验对象莲叶桐的DNA体积较大，浓度低，异丙醇沉淀效果更佳。
4、沉淀试剂体积：采用等体积的异丙醇而不是常规方法中的2/3体积沉淀DNA，可以使沉淀的DNA浓度增高，同时也不影响DNA质量。
附图说明
图1为实施例1加热前裂解液中未加入PVP。
图2为实施例2加热前裂解液中加入PVP。
图3为实施例1与实施例2的对比图，左管为抽提液中未加入Tris平衡酚，右管为抽提液中加入Tris平衡酚。
图4莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，Improved1为实施例1提取物的琼脂糖凝胶电泳图，Improved2为实施例2提取物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1
(1)取适量的莲叶桐鲜叶，放在已经预冷好的研钵里，边加液氮边研磨,研磨充分后取叶片粉末200mg转移到预热到65℃的800μL CTAB裂解液(2％(m/v)CTAB，0.1mol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl,2％(v/v)β疏基乙醇)，将离心管放置涡旋仪中震荡1min，混匀后放入水浴锅，设置水浴温度65℃，水浴加热40min，隔10min一次颠倒摇匀。
(2)加热完毕后放入室内冷却，再加入相等体积的氯仿︰异戊醇＝24︰1，充分颠倒混匀，在转速为11000～13500rpm室温下离心10～15min；
(3)取上清，加入2/10倍体积的3mol/L的NaAc溶液和2倍体积的95％乙醇，轻微颠倒混匀，后于-20℃沉淀40～60min，在转速为11000～13500rpm，4℃离心10～15min。
(4)弃上清，将沉淀用70％的乙醇溶液洗涤2～4次后，室温条件下进置风干之后，继续加入0.1mLTE缓冲液进行溶解。
实施例2
(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。将粉末转至2mL的离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入RNA酶，涡旋震荡1min，混匀后65℃水浴锅中水浴加热40min，每隔10min颠倒摇匀一次。裂解液组成为：2％(m/v)CTAB,0.1mol/LTris-HClpH8.0,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2％(m/v)β疏基乙醇,2％(m/v)PVP；
(2)放置冷却至室温，加入等体积的Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1,在转速为11000～13500rpm室温下离心10～15min；
(3)取上清液转入一新离心管，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置40～60min，在转速为11000～13500rpm4℃离心10～15min；
(4)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，加入50～250μLTE缓冲液，充分混匀后，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置40～60min，在转速为11000～13500rpm4℃离心10～15min；
(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL TE溶解，充分混匀后，置于－20℃冰箱中保存。
图4为莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，Improved1为实施例1提取物的琼脂糖凝胶电泳图，Improved2为实施例2提取物的琼脂糖凝胶电泳图，从图4看出，改进后的CTAB法(实施例1和实施例2)提取的DNA条带更亮，点样孔也更清晰，说明改进后的CTAB法提取出来的DNA浓度高，纯度也高。对比之后，本发明实例2的方法效果最佳。

Claims (2)

1.莲叶桐核酸提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入RNA酶，涡旋震荡1min，混匀后65℃水浴锅中水浴加热40min，每隔10min颠倒摇匀一次，所述裂解液组成为：2％(m/v)CTAB,0.1mol/LTris-HCl pH8.0,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2％(m/v)β疏基乙醇，2％(m/v)PVP；
(2)放置冷却至室温，加入等体积的Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1,在转速为11000～13500rpm室温下离心10～15min；
(3)取上清液转入一新离心管，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置40～60min，在转速为11000～13500rpm 4℃离心10～15min；
(4)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，加入50～250μL TE，充分混匀后，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置40～60min，在转速为11000～13500rpm 4℃离心10～15min；
(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL TE缓冲液溶解，充分混匀后，置于－20℃冰箱中保存。
2.根据权利要求1所述的莲叶桐核酸提取的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的RNA酶浓度为20mg/ml。
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