CN105671032A - 一种提取拟南芥种子中总rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，包括：(1)在液氮冷却条件下研磨拟南芥种子，得拟南芥种子冻干粉；(2)加入到预热的提取缓冲液中，再加入β-巯基乙醇，涡旋混合，离心，吸取上清液；(3)加入氯仿和水饱和酚，涡旋混匀，18～25℃条件下离心，吸取上清液；(4)加入氯化锂，静置，离心，得第一离心沉淀；(5)用DEPC水溶解第一离心沉淀，加乙酸钠和异丙醇，静置，离心，得第二离心沉淀；(6)将第二离心沉淀经醇洗，干燥，复溶即得所述拟南芥种子总RNA。本发明方法操作时间短，重复性好，提取的拟南芥种子的RNA纯度好、质量高，为其他高油、高脂、以及多糖多酚植物组织的提取提供技术参考。

Description

一种提取拟南芥种子中总RNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提取拟南芥种子中总RNA的方法。
背景技术
RNA提取是分子生物学研究领域的基础，高产量，高纯度的RNA样品是后续进行基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。因此，一套高效的RNA提取方法在分子生物学研究中显得非常重要。
植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取比其他生物材料更加困难。富含酚类化合物和多糖类物质，或含有大量次生代谢产物，或内源RNase含量较高是这些植物RNA提取的主要障碍。很多植物组织含有大量的多酚和多糖类物质，酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质，与RNA不可逆地结合，从而影响RNA的分离纯化。多糖的许多理化性质与RNA相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，很难将他们分开。
公告号为CN101638651B的专利文献公开了一种利用异硫氰酸胍-氯仿抽提、Tris饱和酚纯化植物RNA的抽提方法。改良了传统的异硫氰酸胍法，采用裂解后氯仿抽提加酚纯化两步法，分别从红皮梨的叶片和果皮、葡萄的叶片和果肉、果皮组织以及草莓果实和新疆紫草愈伤组织中提取到了高质量的总RNA。该方法的抽提缓冲液中含有异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、柠檬酸钠、可溶性聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇，既能高效裂解植物细胞释放RNA，有效抑制RNA酶的活性，还能防止酚类物质的氧化和排除次生代谢物质的干扰。第二步用Tris饱和酚纯化粗提RNA溶液，能除去与RNA共沉淀的多糖和蛋白质。该方法操作步骤简单、经济实惠、稳定性好，适用于从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取高质量总RNA。
拟南芥作为典型的模式植物，从拟南芥中提取纯度高、完成性好的总RNA，有利于其分子生物学研究的开展。但是拟南芥种子含有大量的脂类、蛋白、多糖多酚等物质，严重影响了RNA提取的质量和纯度，目前常用的提取方法如Trizol法、苯酚法、异硫氰酸胍酚法、RNAplantplus以及ReagentKits很难提取拟南芥种子RNA。
公告号为CN102220312B的专利文献公开了一种室温提取花生种子中总RNA的方法，包括如下步骤：(1)研磨花生未成熟种子，制得花生冻干粉；(2)将花生冻干粉加入Trizol试剂，然后加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃离心，取上清液；(3)加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃离心，取上清液；(4)加入异丙醇混合，静置，20～32℃离心，取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即得。该方法离心步骤在20～32℃完成，且操作时间较原有技术时间短，从而缩短了RNA被降解的时间，重复性好，提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点。
已有的报导提取含油脂、多糖、多酚的种子RNA的方法(如SIMONABIRTIC,ILSEKRANNER.,Phytochem.Anal.2006,17:144-148)应用到拟南芥种子的RNA提取中，效果均不理想，且提取步骤多，提取试剂贵；利用Trizol提取的RNA的快速方法(LingandLewis,Biotechnol.J.,2010,5:183-186)也不能在拟南芥种子中提取高纯度的RNA，提取质量不好。
发明内容
本发明提供了一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，解决了现有技术中提取步骤多、提取质量不高的问题。
一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，包括以下步骤：
(1)在液氮冷却条件下研磨拟南芥种子，得拟南芥种子冻干粉；
(2)将拟南芥种子冻干粉加入到预热的提取缓冲液中，再加入β-巯基乙醇，涡旋混合，离心，吸取上清液，得第一离心上清液；
(3)第一离心上清液中加入氯仿和水饱和酚，涡旋混匀，18～25℃条件下离心，吸取上清液，得第二离心上清液；
(4)第二离心上清液中加入氯化锂，静置，离心，得第一离心沉淀；
(5)用DEPC水溶解第一离心沉淀，加乙酸钠和异丙醇，静置，离心，得第二离心沉淀；
(6)将第二离心沉淀经醇洗，干燥，复溶即得所述拟南芥种子总RNA。
所述提取缓冲液的成分为：100mMTris-HCl，10mMEDTA，2％w/v十二烷基硫酸锂，0.6MNaCl，0.4M柠檬酸三钠。
作为优选，步骤(2)中，每百毫克拟南芥种子冻干粉中加入提取缓冲液1～3mL，β-巯基乙醇50～150μL。
本发明在提取缓冲液中添加抗氧化剂β-巯基乙醇、金属离子螯合剂EDTA和RNase抑制剂十二烷基硫酸锂，高效裂解植物细胞和释放RNA到水相。高钠环境有利于RNA从种子细胞中释放。
本发明研究表明，提取缓冲液加热到一定温度，有助于种子细胞的破碎和核酸的释放。作为优选，步骤(2)中，提取缓冲液的预热温度为40～60℃。更为优选的，提取缓冲液的预热温度为60℃。
作为优选，步骤(2)中，涡旋振荡1～2min。
本发明用氯仿-水饱和酚代替传统的苯酚-氯仿-异戊醇的提取方法，避免了异戊醇这种有毒害试剂，而且不影响RNA的提取效果。
氯仿-水饱和酚用于去除蛋白质，作为优选，步骤(3)中，氯仿添加量为1倍体积的第一离心上清液，水饱和酚添加量为1倍体积的第一离心上清液。
本发明在研究中发现，在进行到步骤(3)时，4℃条件下离心，得到的离心液的分层效果与常温(18-25℃)离心相比，分层效果不好，得到的上清液回收效率低，常温离心所得上清液约是4℃离心所得上清液的1.5倍。因此，本发明对该步骤进行了改进，提高离心时的温度条件，在18～25℃条件下离心，得到更大体积的离心液。
获得的第二离心上清液经高浓度氯化锂作用下选择性沉淀RNA，降低多糖污染。作为优选，步骤(4)中，所述氯化锂的终浓度为2～3M。
作为优选，步骤(4)中，-80℃条件下静置15min～2h。更为优选的，-80℃条件下静置1h。本发明研究发现，静置1小时得到的RNA产率最高。
静置结束，4℃、12000～13000rpm条件下离心3～5min，获得RNA粗品。
步骤(5)对RNA进一步纯化，RNA粗品重新溶于DEPC水中，用乙酸钠除去多余的多糖等物质。作为优选，步骤(5)中，所述乙酸钠的终浓度为0.15～0.3M。
步骤(5)中，添加等体积异丙醇后，室温静置3～5min，异丙醇再次沉淀RNA。
作为优选，步骤(2)和(5)中，离心的条件为18～25℃。
第二离心沉淀经75％乙醇洗涤、室温干燥后加入RNasefree水溶解即得高质量的RNA。
本发明具备的有益效果：(1)本发明对提取缓冲液进行预热，缓冲液中各组分充分溶解，有助于植物细胞的裂解和RNA释放；(2)本发明一次性加入足量的氯仿-酚，有效去除蛋白等杂质，减少抽提次数，减少RNA在提取过程中的损失；(3)本发明所述方法的离心在室温条件下进行，有助于分相，提高RNA产量；(4)本发明方法操作时间短，重复性好，提取的拟南芥种子的RNA纯度好、质量高，为其他高油、高脂、以及多糖多酚植物组织的提取提供技术参考。
附图说明
图1为实施例1提取的野生型拟南芥成熟种子总RNA的电泳图，其中L为RNAmarker；1-6为6个拟南芥成熟种子样品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例中所用实验用品处理及试剂配制说明：
RNA提取过程中所使用的枪头、离心管等塑料器皿应使用0.1％DEPC水浸泡后高压蒸汽灭菌，烘干。
研钵等工具用1mL无水乙醇燃烧灭菌。
提取Buffer：100mMTris-HCl(PH9.5)，10mMEDTA(PH＝8.0)，2％(W/V)十二烷基硫酸锂，0.6MNaCl，0.4M柠檬酸三钠，高压灭菌。
β-巯基乙醇(BioBasicInc)、水饱和酚(北京鼎国)、0.1％DEPC(Biosharp)水、异丙醇、氯仿、均为普通分析纯有机试剂。
8MLiCl，LiCl为分析纯无机试剂，加DEPC水溶解。
3M乙酸钠(PH5.2)，分析纯乙酸钠粉末，加DEPC水溶解，利用冰醋酸调PH至5.2。
75％乙醇用0.1％DEPC水配制。
实施例1
1、一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，步骤如下：
1)拟南芥成熟种子约100mg，液氮研磨，加入60℃提前预热的提取Buffer1mL，β-巯基乙醇50uL，涡旋1min，13000rpm、20℃离心10min；
2)吸取上清液(约1mL)，分装在三个1.5mLEppendorf管，每管加入1倍体积氯仿，1倍体积水饱和酚，涡旋15s，13000rpm、20℃离心10min；
3)每管吸取上清液(约300uL)于1个1.5mLEppendorf管内，加入1/3体积的8MLiCl，-80℃沉淀1h，溶解，13000rpm，4℃离心3min；
4)去上清，加入500uLDEPC水溶解，加入1/10体积3M乙酸钠(PH＝5.2)和等体积异丙醇，室温静置3min，13000rpm、20℃离心5min，获得沉淀；
5)沉淀经75％乙醇洗涤，13000rpm、20℃离心5min，室温干燥后加入30～40uLRNAasefree水溶解，-80℃保存。
2、拟南芥种子总RNA质量检测
1)利用上述方法，对拟南芥成熟种子(6个样品)进行RNA提取，获得RNA样品。电泳分析结果如图1所示，5s、18s、28s条带清晰、整齐，28s条带亮度接近是18s条带亮度的两倍，说明所提取的拟南芥种子总RNA具有完整性较好。
2)将上述制得的拟南芥种子总RNA样品，以灭菌的0.1％DEPC水为空白对照，利用Nanodrop测得A260/280和A230/260值，检测结果表明，所提取的拟南芥种子RNA的A260/280在1.9～2.1之间，A230/260＞1.8，说明RNA纯度较好；(RNAintegaritynumber)RIN≥7，说明RNA完整性好；具体纯度及产率参见表1。
表1.拟南芥种子RNA纯度及浓度检测
实施例2
提取流程参照实施例1，步骤(1)中提取缓冲液预热温度及步骤(3)中-80℃沉淀时间见表2，其他参数同实施例1。
提取得到的拟南芥种子总RNA样品进行纯度、产率检测，结果见表2。
表2.不同提取条件下RNA样品纯度及产率检测
对比例1
1、一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，步骤如下：
1)拟南芥成熟种子约100mg，液氮研磨，加入60℃提前预热的提取Buffer1mL，β-巯基乙醇50uL，涡旋1min，13000rpm、4℃离心10min；
2)吸取上清液(约1mL)，分装在三个1.5mLEppendorf管，每管加入1倍体积CIA(氯仿：异戊醇＝24:1)，1倍体积水饱和酚，上下颠倒混匀15次，13000rpm、4℃离心10min；
3)吸取上清液，平均分装在两个Eppendorpf管内，每管加入等体积的水饱和酚，颠倒混匀；室温静置3min，加入1/2体积CIA，剧烈摇晃混匀15s，13000rpm，4℃离心10min；
4)吸取上清液于1个1.5mLEppendorf管内，加入1/3体积8MLiCl，-80℃沉淀4h，溶解，13000rpm，4℃离心5min；
5)去上清，加入500uLDEPC水溶解，加入1/10体积3M乙酸钠(PH＝5.2)和等体积异丙醇，室温静置3min，13000rpm、4℃离心5min，获得沉淀；
6)沉淀经75％乙醇洗涤，13000rpm，4℃离心5min，室温干燥后加入30～40uLRNAasefree水溶解，-80℃保存。
2、拟南芥种子总RNA质量检测
1)利用上述方法，对拟南芥成熟种子(6个样品)进行RNA提取，获得RNA样品。
2)将上述制得的拟南芥种子总RNA样品，以灭菌的0.1％DEPC水为空白对照，利用Nanodrop测得A260/280和A230/260值，结果如表3所示。
表3.拟南芥种子RNA纯度及产率检测
由表3数据分析可知，对比例1的方法中在低温条件下离心，其RNA的产率较室温条件离心的方法低。

Claims (10)

1.一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在液氮冷却条件下研磨拟南芥种子，得拟南芥种子冻干粉；
(2)将拟南芥种子冻干粉加入到预热的提取缓冲液中，再加入β-巯基乙醇，涡旋混合，离心，吸取上清液，得第一离心上清液；
(3)第一离心上清液中加入氯仿和水饱和酚，涡旋混匀，18～25℃条件下离心，吸取上清液，得第二离心上清液；
(4)第二离心上清液中加入氯化锂，静置，离心，得第一离心沉淀；
(5)用DEPC水溶解第一离心沉淀，加乙酸钠和异丙醇，静置，离心，得第二离心沉淀；
(6)将第二离心沉淀经醇洗，干燥，复溶即得所述拟南芥种子总RNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取缓冲液的成分为：100mMTris-HCl，10mMEDTA，2％十二烷基硫酸锂，0.6MNaCl，0.4M柠檬酸三钠。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，每百毫克拟南芥种子冻干粉中加入提取缓冲液1～3mL，β-巯基乙醇50～150μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，提取缓冲液的预热温度为40～60℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，涡旋振荡1～2min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，氯仿添加量为1倍体积的第一离心上清液，水饱和酚添加量为1倍体积的第一离心上清液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述氯化锂的终浓度为2～3M。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，-80℃条件下静置15min～2h。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乙酸钠的终浓度为0.15～0.3M。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(5)中，离心的条件为18～25℃。
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