CN101962639A - 一种广谱高效提取植物rna的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种广谱、高效从各种植物组织中提取RNA的方法，属生物化学技术领域。以硼酸缓冲液为缓冲体系首先有效分离和富集植物组织RNA，再以三羟甲基氨基甲烷Tris-盐酸HCl-乙二胺四乙酸钠EDTA-Na2-氯化钠NaCl为提取缓冲液、十六烷基三甲基溴化铵CTAB为去污剂，并加入1mol/L异硫氰酸胍作为强变性剂迅速抑制RNase活性，提取高品质RNA。该方法不仅可以提取棉花胚珠、花药、叶片、纤维等组织中的RNA，而且可以从拟南芥、水稻、马塘以及香蕉(果皮、果肉)、马尾松、雪松等顽拗性植物中提取高品质的RNA。该方法提取RNA产率高，纯度高，没有盐类的污染。成本低，适合商品化开发，成为一种广谱、高效提取植物RNA的专用试剂盒。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种广谱、高效提取植物RNA的方法，属于生物化学技术领域，适用于从各种植物，包括富含多糖多酚及次生代谢物质的顽拗性植物组织中提取高质量的总RNA。
二、背景技术
从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或构建cDNA文库，大规模转录组和miRNA测序分析，基因芯片分析，RT-PCR及差显分析等功能基因组学和分子生物学研究，都需要高质量的完整RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的基本前提，同时也是关键步骤。
植物组织富含酚类化合物、多糖以及某些尚无法确定的次生代谢产物，而且RNase的活性较高。在完整的细胞内，这些物质与核酸因区隔化分布而在空间上彼此隔离，但当组织被研磨，细胞结构破坏之后，这些物质就会与RNA相互作用：酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。一些顽拗性植物例如棉花、马尾松、香蕉等由于缺乏成熟的商业试剂盒或者提取方法用于提取完整的、高质量、高产率的RNA是这些植物分子生物学研究中的一大挑战。
以重要的农作物棉花为例：棉花的各种组织特别是花药、胚珠、纤维细胞内常含有丰富的多糖、脂类以及多酚、色素等次生物质，而这些物质在RNA提取过程中很难去除干净。多糖、脂类的存在不仅会使RNA的溶解度降低，还可以抑制许多工具酶的活性，且多酚、色素等物质在提取过程中很容易被氧化导致RNA变褐，影响对RNA的进一步分子操作。现有的商业试剂盒Trizol(Gibco-BRL生命技术公司)、RNeasy(Qiagen)等都不能有效提取棉花组织的RNA，有的产率为零。目前国内外广泛采用CTAB法和热硼酸法提取棉花组织的RNA，其中CTAB法被认为可以用于提取棉花根、茎、叶、幼嫩胚珠等组织的RNA，热硼酸法则可以用于提取纤维中的RNA。但是在实际应用中这两种方法都有缺点：一是提取成功率只能达到60％，二是提取RNA的质量不够高，不能满足RNA表达谱测序等一些对RNA质量要求高的分析研究的需要。国内某研究机构因为没有找到合适的提取方法使有关研究停滞三年之久，而采用本方法之后，经Agilent 2100Bioanlyzer检测，即达到了规定的质量要求，使有关工作得以进行。
本方法以棉花为初始试验材料，在比较、分析、综合现有的十三种RNA提取方法的基础上，认识到缓冲系统是决定棉花组织RNA提取成功与否以及质量高低的最重要因素。筛选出硼酸缓冲液为RNA提取液的最佳缓冲体系，采用该体系可以高效提取植物组织中的RNA。用该体系提取粗RNA之后，再用使用CTAB为去污剂的Tris-HCl-EDTA-NaCl缓冲体系，溶解粗RNA，并添加异硫氰酸胍。其中的硼酸可以与棉花组织中富含的酚类化合物以氢键形成复合物，抑制酚类物质的氧化及其与RNA的结合；CTAB、异硫氰酸胍可以使蛋白质迅速变性，有利于防止RNA的降解，保持其完整性，同时，该缓冲系统可以有效地去除多糖，使RNA与多糖能有效分离，大大提高了RNA的纯度。
由于棉花是最难提取RNA的代表性植物之一，本方法在棉花上取得满意效果之后，我们用该方法又分别尝试从拟南芥、水稻、松树、香蕉(果皮、果肉)、雪松、冬青等植物中提取RNA，成功率达到100％，OD260/OD280比值稳定在2.0左右。说明该方法适用范围广。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种广谱、高效提取植物RNA的方法和试剂盒。
技术方案
本发明总结出缓冲系统是决定植物RNA纯度、产率、品质的最主要技术因素，发明了串联使用两种缓冲系统高效提取和分离植物组织RNA的技术方法。在第二种缓冲液中添加1mol/L异硫氰酸胍，有效抑制了RNase活性，有效去除多糖物质，大大提高了RNA的完整性和纯度。
一种广谱、高效从植物中提取RNA的试剂盒，包括：
(1)提取缓冲溶液I，即硼砂-十二烷基磺酸钠SDS提取缓冲液：质量体积百分比浓度为2％的SDS，0.0125mol/L硼砂，用硼酸调节pH到8.5，加入焦炭酸二乙酯DEPC使浓度达到0.1％体积百分比，高温高压灭菌；
(2)提取缓冲溶液II，即十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取缓冲液：100mol/L pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷Tris-盐酸HCl，20mmol/LpH为8.0的乙二胺四乙酸钠EDTA-Na2，质量体积百分比浓度为2％的CTAB，1.4mol/L氯化钠NaCl，质量体积百分比浓度为2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP，体积百分比浓度为1％的β-巯基乙醇，1mol/L异硫氰酸胍；
(3)3mol/L pH为5.2的醋酸钠NaAc溶液：4.801g NaAc·3H2O或3.566g NaAc·H2O溶于8mL水，用冰醋酸调pH至5.2，加入10μL DEPC，定容至10mL，高温高压灭菌；
(4)8mol/L氯化锂LiCl：33.91g LiCl溶于100mL水，加入100μL DEPC，高温高压灭菌；
(5)异丙醇：纯度100％；
(6)DEPC水或称无RNase水：体积百分比浓度0.1％DPEC的双蒸水溶液，高温高压灭菌。所述试剂盒用于从植物中提取RNA的方法，其特征在于：以硼酸缓冲液为缓冲体系首先有效分离和富集植物组织RNA，再以Tris-HCl-EDTA-NaCl为缓冲液、CTAB为去污剂并加入1mol/L异硫氰酸胍抑制RNase活性，提取纯品RNA。其特征在于：
(1)向10mL离心管中加入3.0mL提取缓冲溶液I、0.25mLβ-巯基乙醇、2.0mL pH为8.0的Tris饱和酚，1.5mL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇；
(2)取0.1g新鲜植物组织，加入0.1g交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP，在液氮中充分研磨成粉状，将冻粉迅速转入上述10mL离心管中，旋涡剧烈震荡3min，冰上放置5min；
(3)4℃，10,000g离心15min；
(4)将上清液转至离心管中，加入等体积预冷异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，-20℃静置1～2h，4℃，10,000g离心20min，弃上清；
(5)沉淀中加3mL提取缓冲溶液II，65℃水浴15min；中途翻转混匀；
(6)加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置10min；
(7)4℃，10,000g离心20min；
(8)上清加1/3体积8mol/1LiCl混匀，-70℃，30min或-20℃，1-2h冰浴；
(9)4℃，10,000g离心20min，弃上清，沉淀即为粗RNA，用70％体积百分比的乙醇洗涤两次后溶解于50μL DEPC水；
(10)加入10U无RNase活性的DNase，和25U RNase抑制剂(RNasin Plus，Promega，N2611)，DEPC水补足体积到100μL，消化其中的DNA；
(11)直接补加：500μL DEPC水和600μL体积比为1∶1的Tris-酚∶氯仿，4℃9,600g离心20min，上清转移至另一新的2mL管中；
(12)加入等体积的体积比24∶1的氯仿∶异戊醇，抽提一次；
(13)上清液转移到新管中，加入1/10体积的3mol/L pH5.2的NaAc-HAc，2.5倍体积无水乙醇，-70℃冰浴沉淀1.5h；
(1)4℃9,600g离心20min，沉淀即为纯化的RNA。
有益效果：
本发明操作步骤比较简单、成本低、稳定性好、成功率高。本方法提取RNA产率高(表1)，达到174.3μg·100mgFW-1，OD260/OD280＝2.01，纯度高，没有盐类的污染，解决了多糖、多酚等植物富含的干扰物质的清除问题，适用性广，尤其适用于从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取高质量总RNA。该方法可以很方便地开发出商业化试剂盒，广泛用于植物样品的RNA提取。
四、附图说明
图1采用本方法提取的RNA
图2 DNase I消化后的RNA
图3 RNA进行反转录合成的第一链cDNA
图4 RNA进行RT-PCR扩增
图5 3’-RACE
图6 5’-RACE
图7从香蕉果肉、果皮、马尾松、雪松提取的RNA
五、具体实施方式
有关溶液的配方如下：
(1)DEPC水：体积百分比浓度为0.1％的DEPC双蒸水溶液，高温高压灭菌。以下所有的水溶液需要用DEPC水配制；
(2)1mol/L pH8.0的Tris-HCl储备液：1mol/L Tris，溶解于水，用HCl调节pH值到8.0，高温高压灭菌，该储备液用于含有Tris-HCl的缓冲液的配制；
(3)0.5mol/L pH8.0的EDTA-Na2储备液：0.5mol/L EDTA-Na2，溶解于水，用NaOH调节pH值到8.0，该储备液用于含有EDTA-Na2的缓冲液的配制，高温高压灭菌；
(4)提取缓冲溶液I：即硼砂-SDS提取缓冲液：质量体积百分比浓度为2％的SDS，0.0125mol/L硼砂，用硼酸调节pH到8.5，加入DEPC使体积百分比浓度达到0.1％，高温高压灭菌；
(5)pH为8.0的Tris缓冲液饱和酚，购自Sunshine公司，4℃避光保存；
(6)4mol/L NaCl，体积百分比浓度为0.1％DEPC，高温高压灭菌；
(7)提取缓冲液II：即CTAB提取缓冲液：100mmol/L pH8.0Tris-HCl，20mmol/L pH8.0EDTA-Na2，质量体积百分比浓度为2％的CTAB，1.4mol/LNaCl，质量体积百分比浓度2％PVP，体积百分比浓度1％B-巯基乙醇，1mol/L异硫氰酸胍。
(8)3mol/L NaAc，pH5.2：4.801g NaAc·3H2O或3.566gNaAc·H2O溶于8mL水，加用冰醋酸调pH至5.2，定容至10mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
(9)氯仿∶异戊醇(24∶1)∶24mL氯仿和1mL异戊醇混合。
(10)8mol/L LiCl：33.91g LiCl溶于100mL水，体积百分比0.1％DEPC，高温高压灭菌。
实施例1：本发明方法提取棉花胚珠总RNA
1.向10mL离心管中加入3.0mL提取缓冲溶液I、0.25mL β-巯基乙醇、2.0mLpH为8.0的Tris饱和酚，1.5mL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇；
2.取0.1g棉花胚珠，加入0.1g交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP，在液氮中充分研磨成粉状，将冻粉迅速转入上述10mL离心管中，旋涡剧烈震荡3min，冰上放置5min；
3.4℃，10,000g离心15min；
4.将上清液转至离心管中，加入等体积预冷异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，-20℃静置1～2h，4℃，10,000g离心20min，弃上清；
5.沉淀中加3mL提取缓冲溶液II，65℃水浴15min；中途翻转混匀；
6.加3mL氯仿充分混匀，冰浴静置10min；
7.4℃，10,000g离心20min；
8.上清加1/3体积8mol/l LiCl混匀，-70℃，30min或-20℃，1-2h冰浴；
9.4℃，10,000g离心20min，弃上清，沉淀即为粗RNA，用70％体积百分比的乙醇洗涤两次后溶解于30μL DEPC水；
10.快速电泳检测：用1％含溴化乙锭EB的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳时间15分钟，电泳后用紫外成像仪观察。结果显示电泳带有5S、18S、28S三条RNA带。5S亮度较浅，28S∶18S的亮度比接近2∶1(见图1左)。这说明所提取的RNA达到要求，与常规CTAB法为对照(图1右)，对照样品降解明显。
11.紫外法检测：样品的浓度取1ulRNA稀释100倍用紫外分光光度计测定分别测定OD260、OD280、OD320、OD230(表1)。OD260/OD280越接近2.0说明RNA纯度较高，OD260/OD230＞2.0这表示RNA没有盐类的污染，此方法提取RNA产率较高，达到174.3μg·100mgFW-1，OD260/OD280＝2.01，纯度高。
表1采用本方法提取的棉花胚珠RNA的OD值测定和定量分析
需要特殊说明的是：棉花花药的RNA提取极为困难，一般方法中提取的RNA的中胨状污染物难以去除，我们的方法可以有效提取的RNA，而且没有提胨状污染物。
12.加入10U无RNase活性的DNase，和25U RNase抑制剂(RNasin Plus，Promega，N2611)，DEPC水补足体积到100μL，消化其中的DNA；
13.直接补加：500μL DEPC水和600μL体积比为1∶1的Tris-酚∶氯仿，4℃9,600g离心20min，上清转移至另一新的2mL管中；
14.加入等体积的体积比24∶1的氯仿∶异戊醇，抽提一次；
15.上清液转移到新管中，加入1/10体积的3mol/L pH5.2的NaAc-HAc，2.5倍体积无水乙醇，-70℃冰浴沉淀1.5h；70％
16.4℃9,600g离心20min，沉淀用70％体积百分比的乙醇洗涤两次，沉淀即为纯化的RNA；
17.反转录：取5μg RNA，加入反转录反应缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂，37℃温育4min使引物退火；再加入M-MLV反转录酶，混匀，37℃温育60min，70℃温育15min灭活反转录酶，立即将反应管置于冰上，合成的第一链cDNA可以直接用于PCR扩增或保存于-20℃备用(图3)，第一链cDNA长度在100bp到5000bp，大多数在500～3000bp，说明RNA完整性好。
18.RT-PCR：用组成性表达的EF1α-对特异引物，作为内标进行平行PCR扩增。反应体系为，10×PCR buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl2 1.2μL，10mmol/L dNTP Mix 0.4μL，10μmol/L正向引物和反向引物各1μL，cDNA第一链模板1μL，rTaq酶(5U/μL，TakaRa)0.1μL，加无菌超纯水至20μL；扩增条件为：95℃预变性2min；94℃变性45s，55℃～60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min，以熔解曲线结束。内标检测EF1α(Hong-Ping Dong，Jianling Peng，Zhilong Bao，et al，Downstream Divergence of the Ethylene Signaling Pathway for Harpin-Stimulated Arabidopsis Growth and Insect Defense，Plant Physiology，2004，136(3)：3628-3638.)，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(图4)，全部样品都扩增出分子量约为500bp的预期条，说明RNA容易进行反转录。
19.5’-RACE和3’-RACE：用本发明方法提取棉花RNA，分别进行3’-RACE和5’-RACE扩增全长cDNA基因，都取得了成功，说明RNA质量高，完整性好(图5、图6)。
实施例2：香蕉果肉、果皮、马尾松、雪松RNA的提取。实验方法步骤与实施例1完全相同。结果见图7。
Claims (3)
1.一种广谱、高效从植物中提取RNA的试剂盒，包括：
(1)提取缓冲溶液I，即硼砂-十二烷基磺酸钠SDS提取缓冲液：质量体积百分比浓度为2％的SDS，0.0125mol/L硼砂，用硼酸调节pH到8.5，加入焦炭酸二乙酯DEPC使浓度达到0.1％体积百分比，高温高压灭菌；
(2)提取缓冲溶液II，即十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取缓冲液：100mol/L pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷Tris-盐酸HCl，20mmol/L pH为8.0的乙二胺四乙酸钠EDTA-Na2，质量体积百分比浓度为2％的CTAB，1.4mol/L氯化钠NaCl，质量体积百分比浓度为2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP，体积百分比浓度为1％的β-巯基乙醇，1mol/L异硫氰酸胍；
(3)3mol/L pH为5.2的醋酸钠NaAc溶液：4.801g NaAc·3H2O或3.566g NaAc·H2O溶于8mL水，用冰醋酸调pH至5.2，加入10μL DEPC，定容至10mL，高温高压灭菌；
(4)8mol/L氯化锂LiCl：33.91g LiCl溶于100mL水，加入100μL DEPC，高温高压灭菌；
(5)异丙醇：纯度100％；
(6)DEPC水或称无RNase水：体积百分比浓度0.1％DPEC的双蒸水溶液，高温高压灭菌。
2.权利要求1所述试剂盒用于从植物中提取RNA的方法，其特征在于：以硼酸缓冲液为缓冲体系首先有效分离和富集植物组织RNA，再以Tris-HCl-EDTA-NaCl为缓冲液、CTAB为去污剂并加入1mol/L异硫氰酸胍抑制RNase活性，提取纯品RNA。
3.根据权利要求2所述一种从植物中提取RNA的方法，其特征在于：
(1)向10mL离心管中加入3.0mL提取缓冲溶液I、0.25mL β-巯基乙醇、2.0mL pH为8.0的Tris饱和酚，1.5mL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇；
(2)取0.1g新鲜植物组织，加入0.1g交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP，在液氮中充分研磨成粉状，将冻粉迅速转入上述10mL离心管中，旋涡剧烈震荡3min，冰上放置5min；
(3)4℃，10,000g离心15min；
(4)将上清液转至离心管中，加入等体积预冷异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，-20℃静置1～2h，4℃，10,000g离心20min，弃上清；
(5)沉淀中加3mL提取缓冲溶液II，65℃水浴15min；中途翻转混匀；
(6)加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置10min；
(7)4℃，10,000g离心20min；
(8)上清加1/3体积8mol/l LiCl混匀，-70℃，30min或-20℃，1-2h冰浴；
(9)4℃，10,000g离心20min，弃上清，沉淀即为粗RNA，用70％体积百分比的乙醇洗涤两次后溶解于50μL DEPC水；
(10)加入10U无RNase活性的DNase，和25U RNase抑制剂(RNasin Plus，Promega，N2611)，DEPC水补足体积到100μL，消化其中的DNA；
(11)直接补加：500μL DEPC水和600μL体积比为1∶1的Tris-酚∶氯仿，4℃9,600g离心20min，上清转移至另一新的2mL管中；
(12)加入等体积的体积比24∶1的氯仿∶异戊醇，抽提一次；
(13)上清液转移到新管中，加入1/10体积的3mol/L pH5.2的NaAc-HAc，2.5倍体积无水乙醇，-70℃冰浴沉淀1.5h；
(14)4℃9,600g离心20min，沉淀即为纯化的RNA。
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