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Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及落叶松高质量总RNA的快速提取方法，配制l RNA提取液；往RNase-free离心管中加入的RNA提取液，同时加入PVP、M/ml DTT、β-巯基乙醇和蛋白酶K；取植物材料于液氮中研磨成粉末，震荡混匀；孵育；加入氯仿/异戊醇，涡旋振荡；加入无水乙醇，冰上放置以上；再用75％酒精清洗一次再次离心5min，加入TE；去除总RNA中的DNA；分别用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提；抽提后的溶液加入1/10体积NaAc和2倍体积无水乙醇，沉淀用75％乙醇清洗；吸出剩余乙醇；加入适量RNase-free水溶解，得到落叶松总RNA；本发明方法具有较大的实际应用价值。

Description

一种提取落叶松总RNA的方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及从落叶松组织材料中提取总RNA的方法，特别涉及一种利用新的提取液配方快速、简便地从落叶松的叶、根、茎、花、种子中提取总RNA的新方法。
技术背景
RNA提取是现代分子生物学试验中非常重要的一个环节，RNA质量的好坏直接影响到后续试验的成败，如RT-PCR，cDNA文库构建等。为了获得高质量的RNA，很多学者做了大量研究，并不断有获得高质量RNA方法的报道，如：异硫氰酸胍法，热酚法，CTAB-PVP法等。但是，不同植物所含有糖份、酚类和次生代谢物均不同，因此，针对不同植物RNA提取，要采用不同提取液配方，才能有效的提取高质量RNA。落叶松富含多糖、多酚和次生物质，其RNA提取十分困难，尤其是多年生材料。因此，找到一种十分适合落叶松RNA提取的方法，其特点是所得RNA质量高，成本低且操作简便具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供落叶松高质量总RNA的快速提取方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一种落叶松总RNA提取方法，落叶松为落叶松根、茎、叶、花或种子中的任何一种原料，其步骤为：
(1)配制100mlRNA提取液：其中包含：于无RNA酶的水溶液中含终浓度100mM Tris-HCl(pH＝8.0)、2％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、30mMEDTA、2M NaCl、0.3％-0.8％(w/v)亚精胺，磁力搅拌器上搅匀，高压灭菌后待用；
(2)在离心管中加入RNA提取液500μl，同时加入终浓度2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、10μl的200mM/ml DTT(二硫苏糖醇)、终浓度2％(v/v)β-巯基乙醇和20mg/ml蛋白酶K至终浓度1.8-2.2mg/ml，将离心管放入恒温孵育器中以41-43℃孵育10min；
(3)取200-300mg落叶松原料，液氮研磨至粉末状；
(4)将研磨好的落叶松原料加入上述孵育的离心管中，振荡器上2500-3000rpm/min涡旋振荡25-30s后，42℃孵育80-100min；
(5)于离心管中加入步骤(4)得到的溶液的1倍体积氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，振荡器上2500-3000rpm/min涡旋振荡20-30s，4℃，13000rpm离心15-20min；
(6)转移离心管中上层水相至第二支离心管中，加入转移水相等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；
(7)转移第二支离心管中上层水相至第三支离心管中，加入转移水相等体积4MLiCl和转移水相1/2体积的无水乙醇，冰上放置2.5-3h以上；
(8)涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15-20min，弃去上清，得到固态总RNA；
(9)将固态总RNA添加800μl 2M LiCl清洗，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心5min后还弃上层清液；再用500ml毫升体积浓度75％酒精清洗一次，4℃，13000rpm离心5min；
(10)弃去上清，加入30μl 0.1×TE缓冲液；得到含有DNA的总RNA；
(11)去除总RNA中的DNA，具体如下：
以上混合溶液在37℃水浴30min降解DNA；
(12)分别用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提：转移上层水相至另一支新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(三者体积比为25:24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；转移上层水相至另一支新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；
(13)于抽提后的水相溶液中加入其1/10体积的3M NaAc和2倍体积无水乙醇，混均后在－20℃下沉淀30min，4℃，13000rpm离心20min；
(14)去除上清液，沉淀用体积浓度75％乙醇清洗2次；
(15)去除上清液，沉淀在空气中干燥5min，加入RNase-free水溶解后得到的所述总RNA。
步骤(7)中，无水乙醇沉淀选择在-20℃冰箱中静置半小时。
本发明技术方案与现有技术相比较，具有以下有益效果：
(1)采用蛋白酶K，并且在42℃孵育90min，有效的去除落叶松组织中的RNase。另外，使用酚/氯仿抽提会对poly(A)+-RNA有损害，由于蛋白酶K的使用，省略了酚/氯仿抽提步骤，有利于获得高质量poly(A)+-RNA。
(2)β-巯基乙醇可以去除多糖多酚类物质因氧化而对RNA分离产生的干扰和破坏作用，与PVP结合的多糖多酚类物质，可以直接通过离心去除掉，或在氯仿/异戊醇抽提时除去。
(3)无RNase的DNase I处理RNA溶液，可以有效去除RNA中的基因组DNA的污染，得到高纯度RNA。
本发明有效的克服了多糖多酚类次生代谢物质含量高对落叶松总RNA提取所带来的不利影响，能从其中提取得到高质量的总RNA，得到的总RNA纯度高，有效去除了蛋白、盐类以及多糖和多酚类次生代谢物质的污染。因此，本发明方法具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1为落叶松不同组织中总RNA琼脂糖电泳图；
图中，上样量为3μl；1泳道为嫩茎；2泳道为老根；3泳道为韧皮部；4泳道为老茎；5、6泳道为嫩叶。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
实施例1
本实施例为落叶松嫩茎总RNA提取方法，包括以下步骤：
(1)配制100mlRNA提取液：其中包含：于无RNA酶的水溶液中含终浓度100mM Tris-HCl(pH 8.0)、2％(w/v)CTAB、30mM EDTA、2M NaCl、0.5％(w/v)亚精胺，磁力搅拌器上搅匀，高压灭菌；
(2)在1.5ml离心管中加入提取缓冲液500μl，同时加入终浓度2％PVP、10μl的200mM/ml DTT、终浓度2％(v/v)β-巯基乙醇和20mg/ml蛋白酶K至终浓度2.0mg/ml，42℃孵育10min；
(3)取200mg材料，液氮中充分研磨至粉末状；
(4)将研磨好的材料加入上述孵育的离心管中，振荡器上2500-3000rpm/min涡旋振荡25-30s后，42℃孵育90min；
(5)于离心管中加入步骤(4)得到的溶液的1倍体积氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，涡旋振荡，4℃，2500-3000r pm离心15min；
(6)转移离心管中上层水相至另一支离心管中，加入转移水相等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；
(7)转移第二支离心管中上层水相至另一支离心管中，加入转移水相等体积4MLiCl和转移水相1/2体积的无水乙醇，冰上放置3h以上，其中的无水乙醇在-20℃冰箱中静置半小时后使用；
(8)4℃，13000rpm离心15min，弃去上清；
(9)将固态总RNA添加800μl 2M LiCl清洗，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心5min后还弃上层清液；再用500ml毫升体积浓度75％酒精清洗一次，4℃，13000rpm离心5min；
800μl 2M LiCl清洗，4℃，13000rpm离心5min；再用75％酒精清洗一次，4℃，13000rpm离心5min；
(10)弃去上清，加入30μl 0.1×TE；
(11)去除总RNA中的DNA。具体如下：
以上混合溶液在37℃水浴30min降解DNA；
(12)分别用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提，转移上层水相至另一支新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(三者体积比为25:24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；转移上层水相至另一支新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；
(13)于抽提后的水相溶液中加入其1/10体积的3M NaAc和2倍体积无水乙醇，混均后－20℃沉淀30min，4℃，13000rpm离心20min；
(14)去除上清液，沉淀用体积浓度75％乙醇清洗2次；
(15)去除上清液，沉淀在空气中干燥5min，加入适量(20-50μl)RNase-free(无RNA酶)水溶解后得到的所述总RNA。
以上提取方法中所用到的试剂和实验器材均不含核酸酶，提取获得的RNA电泳结果如图1所示。
实施例2
本实施例为落叶松老根的总RNA提取方法，取落叶松老根200mg，剪碎，其它步骤同实施例1，提取获得的总RNA电泳结果如图1所示。
实施例3
本实施例为落叶松韧皮部的总RNA提取方法，取落叶松韧皮部200mg，其它步骤同实施例1，提取获得的总RNA电泳结果如图1所示。
实施例4
本实施例为落叶松老茎的总RNA提取方法，取落叶松老茎200mg，剪碎，其它步骤同实施例1，提取获得的总RNA电泳结果如图1所示。
实施例5
本实施例为落叶松嫩叶的总RNA提取方法，取落叶松嫩叶200mg，剪碎，其它步骤同实施例1，重复2次，提取获得的总RNA电泳结果如图1所示。
通过核酸定量仪检测实施例1～5提取的落叶松总RNA的A260/280值和RNA提取率，结果如下表1所示：
表1：落叶松总RNA的A260/280值和提取率的测定结果
检测结果表明，所有样品的D260/D280值均在1.8～2.1(表1)，表明总RNA样品含酚类物质和蛋白质等杂质少，该方法所提取的RNA样品纯度均较好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种落叶松总RNA提取方法，其特征在于：将经过液氮研磨后的落叶松原料加入经孵育后的RNA提取液，经过孵育、抽提、沉淀后得到含有DNA的总RNA，再经过DNA去除，抽提，沉淀和溶解后，得到高纯度总RNA。
2.根据权利要求1所述的落叶松总RNA提取方法，其特征在于：具体操作步骤为：
(1)配制RNA提取液：于无RNA酶的水溶液中含终浓度100mM Tris-HCl(pH＝8.0)、2％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、30mM EDTA、2M NaCl、0.3％-0.8％(w/v)亚精胺，磁力搅拌器上搅匀，高压灭菌后待用；
(2)在离心管中加入RNA提取液500μl，同时加入终浓度2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、10μl的200mM/ml DTT(二硫苏糖醇)、终浓度2％(v/v)β-巯基乙醇和20mg/ml蛋白酶K至终浓度1.8-2.2mg/ml，将离心管放入恒温孵育器中以41-43℃孵育10min；
(3)取200-300mg落叶松原料，液氮研磨至粉末状；
(4)将研磨好的落叶松原料加入上述孵育的离心管中，振荡器上2500-3000rpm/min涡旋振荡25-30s后，42℃孵育80-100min；
(5)于离心管中加入步骤(4)得到的溶液的1倍体积氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，振荡器上2500-3000rpm/min涡旋振荡20-30s，4℃，13000rpm离心15-20min；
(6)转移离心管中上层水相至第二支离心管中，加入转移水相等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；
(7)转移第二支离心管中上层水相至第三支离心管中，加入转移水相等体积4MLiCl和转移水相1/2体积的无水乙醇，冰上放置2.5-3h以上；
(8)涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15-20min，弃去上清，得到固态总RNA；
(9)将固态总RNA添加800μl 2M LiCl清洗，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心5min后还弃上层清液；再用500ml毫升体积浓度75％酒精清洗一次，4℃，13000rpm离心5min；
(10)弃去上清，加入30μl 0.1×TE缓冲液；得到含有DNA的总RNA；
(11)去除总RNA中的DNA，具体如下：
以上混合溶液在37℃水浴30min降解DNA；
(12)分别用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提：转移上层水相至另一支新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(三者体积比为25:24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；转移上层水相至另一支新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，涡旋振荡，4℃，13000rpm离心15min；
(13)于抽提后的水相溶液中加入其1/10体积的3M NaAc和2倍体积无水乙醇，混均后在－20℃下沉淀30min，4℃，13000rpm离心20min；
(14)去除上清液，沉淀用体积浓度75％乙醇清洗2次；
(15)去除上清液，沉淀在空气中干燥5min，加入RNase-free水溶解后得到的所述总RNA。
3.根据权利要求2所述的落叶松总RNA提取方法，其特征在于：步骤(7)中，无水乙醇在-20℃冰箱中静置半小时后使用。
4.根据权利要求1所述的落叶松总RNA提取方法，其特征在于：
所述落叶松原料为落叶松根、茎、叶、花或种子中的任何一种。
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