CN106282158B - 一种从沙冬青提取基因组dna的方法 - Google Patents

Abstract

一种从沙冬青提取基因组DNA的方法，包括如下步骤：(1)植物材料液氮速冻研磨成粉；(2)加DNA提取液并加蛋白酶K至20μg/mL，65℃保温；(3)离心收集上清液，加等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液抽提，再离心收集上清液；(4)加0.6～0.8倍体积异丙醇沉淀DNA；乙醇洗涤，部分干燥后溶于TE缓冲液，得DNA粗提液；(5)向DNA粗提液中加入NaCl至0.5mol/L，再加入CTAB/NaCl溶液，并加入RNase A至终浓度10μg/mL，65℃保温；(6)依次用等体积苯酚:氯仿:异戊醇混合液和等体积氯仿:异戊醇混合液抽提，收集上清液；(7)加0.6～0.8倍体积异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗涤，部分干燥后溶于TE缓冲液，得到高质量的DNA提取液。本发明可以从沙冬青提取高质量的基因组DNA。

Description

一种从沙冬青提取基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及植物DNA提取，特别是涉及一种从沙冬青提取基因组DNA的方法。

背景技术

蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.]系豆科蝶形花亚科。沙冬青属超旱生常绿灌木，在中国主要分布于西北(新疆、宁夏、甘肃)及蒙古(阿拉善戈壁区东南端)，属国家重点保护植物。沙冬青具有很强的抗旱、抗寒及耐盐碱特性，也具有药用价值。沙冬青抗逆性的分子机制研究成为近年来的研究热点。沙冬青为超旱生灌木，体内多糖、酚类和其他次级代谢产物含量高。前人研究已经表明，蒙古沙冬青的叶片可溶性糖含量达到16％，多糖含量达到5.6％。目前常用的方法提取沙冬青基因组DNA，所得DNA质量不高、浓度较低，难以满足高通量测序实验中DNA文库构建的质量要求。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种从沙冬青提取基因组DNA的方法。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种从沙冬青提取基因组DNA的方法，包括如下步骤：

(1)将植物材料经过液氮速冻后，研磨成粉末；

(2)往所述粉末中加DNA提取液分散均匀，然后加入蛋白酶K至所述蛋白酶K的终浓度20μg/mL，在65℃下保温1～2h，在保温期间，间歇摇动反应液，其中，所述DNA提取液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为15mL:2～5g；

(3)离心除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提2～3次，然后再次离心后收集抽提后的上清液；

(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA充分析出得到DNA沉淀；用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，部分干燥以除去残留乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；

(5)往步骤(4)中所得的DNA粗提液中加入NaCl至NaCl的终浓度为0.5mol/L，随后加入CTAB/NaCl溶液，再加入RNase A至RNase A的终浓度为10μg/mL，在65℃下保温一段时间；其中，所述CTAB/NaCl溶液的加入量为每1mL DNA粗提液加入1.5mL CTAB/NaCl溶液；

(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提后，离心之后收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提，离心之后收集上清液；

(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA析出，所得DNA沉淀使用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液中，得到高质量的DNA提取液。

本发明与现有技术对比的有益效果包括：本发明提供的提取方法克服了沙冬青植物材料中富含的多糖、多酚等次生代谢产物对完整DNA提取步骤的干扰，解决了常规DNA提取方法中常见的DNA产率低、易降解、其他代谢产物残留多的难题。采用本发明的方法得到的DNA纯度较高，DNA完整性好、无明显降解现象，适用于进行基因组文库构建、高通量DNA测序等分子生物学实验。

附图说明

图1是本发明实施例中提取的8个DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图。

图2是本发明实施例中提取的DNA样品1和2的脉冲场凝胶电泳图。

具体实施方式

下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。

基因组DNA的提取是分子生物学实验中非常重要的一个环节，基因组DNA的质量与产量，对于进行基因组DNA文库构建等分子生物学研究具有重要意义。酚类物质和多糖是影响植物基因组DNA提取的两个重要因素，常导致DNA分子降解，严重影响DNA纯度和产量。沙冬青植物组织富含糖类和酚类等物质，酚类物质容易发生氧化，与DNA结合形成黄色或褐色沉淀，难以溶解，DNA纯度较低，难以满足分子生物学研究需求，因此，有效去除多糖、蛋白质和酚类物质等，是提取高质量DNA分子的关键。本发明实施例中的提取方法，先用SDS(十二烷基硫酸钠)法粗提DNA，然后用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)进行进一步的纯化，CTAB可与核酸形成复合物，从而可把DNA从富含多酚和多糖的植物组织中分离出出来，去除多糖和酚类物质，这样不仅所得的DNA比较纯净、完整性好，而且大大减低了CTAB的用量，降低了实验成本。

在本发明中，所述的常温是指20～25℃，低温离心是指在4℃条件下离心。

基于以上考虑，本发明提供的从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法，在具体实施方式中，包括如下步骤：

(1)将植物材料经过液氮速冻后，研磨成粉末；

(2)往所述粉末中加DNA提取液分散均匀，然后加入蛋白酶K至所述蛋白酶K的终浓度20μg/mL，在65℃下保温1～2h，在保温期间，间歇(每隔5～10min)摇动反应液，其中，所述DNA提取液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为15mL:2～5g；

(3)离心除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提2～3次，然后再次离心后收集抽提后的上清液；

优选地，步骤(3)具体为：在常温4000×g下离心10min除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液，抽提2～3次，然后在常温12000×g下离心10min，收集抽提后的上清液；

(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA充分析出得到DNA沉淀；用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，部分干燥以除去残留乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；

优选地，步骤(4)具体为：(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的在0℃以下预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，于-20℃下静置1～2h，使DNA充分析出，然后在12000×g下低温离心10min使DNA沉淀；用在0℃以下预冷的体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，然后在12000×g下低温离心10min，倒掉乙醇，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；

(5)往步骤(4)中所得的DNA粗提液中加入NaCl至NaCl的终浓度为0.5mol/L，随后加入CTAB/NaCl溶液，再加入RNase A至RNase A的终浓度为10μg/mL，在65℃下保温一段时间，其中，所述CTAB/NaCl溶液的加入量为每1mL DNA粗提液加入1.5mL CTAB/NaCl溶液；

优选地，所述保温时间为15min；

(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提后，离心之后收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提，离心之后收集抽提后的上清液；

优选地，步骤(6)具体为：(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液，充分混匀，在12000×g下常温离心10min，收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提一次，在12000×g下常温离心10min，收集抽提后的清液；

(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA析出，所得DNA沉淀使用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，部分干燥去除残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液中，得到高质量的DNA提取液。

优选地，步骤(7)具体为：(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6-0.8倍体积在0℃以下预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，置于-20℃下放置1～2h，使DNA析出，然后在12000×g下低温离心得到DNA沉淀，所得DNA沉淀使用0℃以下预冷的体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，然后在12000×g下低温离心10min，倒掉乙醇，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于200μL的TE缓冲液中，至此得到高质量的DNA提取液。

在另一些优选的实施方式中，还可以优选以下方案中的一者或任意组合：

步骤(2)中的DNA提取液的成分包含：100mmol/L pH为8.0的Tris-HCl，150mmol/LNaCl，1％(w/v)的SDS，100mmol/L EDTA，2％(w/v)的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

步骤(3)和步骤(6)中，苯酚:氯仿:异戊醇的混合液中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比均为25:24:1。

步骤(6)中，所述氯仿:异戊醇混合液中氯仿:异戊醇的体积比为24:1。

步骤(4)和步骤(7)中，所述TE缓冲液的成分均包含：10mmol/L pH为8.0的Tris-HCl以及1mmol/L EDTA。

步骤(5)中，CTAB/NaCl溶液是将CTAB以10％(w/v)的浓度溶于0.7mol/LNaCl溶液中形成。

步骤(5)中，所述RNase A在加入前，经过以下预处理：将RNase A溶液在100℃下处理5min，使其中的DNase失活。

以下，具体以蒙古沙冬青为材料，通过更具体的实施例对本发明进行详细阐述。

从沙冬青提取高质量基因组DNA的方法，包括如下步骤：

(1)2～5g(本例中为3g)植物材料经过液氮速冻后，在研钵中迅速研磨植物组织成粉末，然后将粉末转移到50mL离心管。

(2)加入15mL 65℃预热的DNA提取液并分散均匀，然后加入蛋白酶K至终浓度20μg/mL；在65℃水浴保温1.5h，间歇摇动离心管；其中，DNA提取液的成分为：100mmol/L pH为8.0的Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1％(w/v)的SDS，100mmol/L EDTA，2％(w/v)的PVP。

(3)常温4000×g离心10min除去组织碎片，转移上清液到新的50mL离心管，加入与上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液(三者体积比为25:24:1)，充分混匀，抽提2次，常温12000×g离心10min，将抽提后的上清液转移到新的50mL离心管。

(4)往步骤(3)所得的上清液中，加入0.8倍体积-20℃预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，于-20℃冰柜中静置1.5h，使DNA充分析出，然后在12000×g下低温离心10min使DNA沉淀；用-20℃预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000×g低温离心10min，倒掉乙醇，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于9mL TE缓冲液(包含10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)和1mmol/LEDTA)，至此得到DNA粗提液约9mL。

(5)用CTAB进一步纯化：往步骤(4)所得的DNA粗提液中加入1mL，5mol/L的NaCl至终浓度为0.5mol/L(NaCl浓度低于0.5mol/L时核酸会发生沉淀)，随后加入1.5mL的CTAB/NaCl溶液(将CTAB以10％(w/v)的浓度溶于0.7mol/L NaCl溶液中形成)，再加入RNase A(使用RNase A之前将其进行沸水浴预处理，即将RNase A溶液在100℃水浴5min，使其中的DNase失活)至RNase A的终浓度10μg/mL，65℃下水浴保温15min。

(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(三者的体积比为25:24:1)混合液，充分混匀，12000×g常温离心10min，转移上清液到新的50mL离心管；再用等体积氯仿:异戊醇混合液(二者的体积比为24:1)抽提一次，在12000×g下常温离心10min，转移上清液到新的50mL离心管。

(7)往步骤(6)最后得到的上清液加入0.8倍体积-20℃预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀。置于-20℃冰柜中放置1.5h，使DNA析出，然后在12000×g下低温离心10min得到DNA沉淀。所得DNA沉淀使用-20℃预冷的70％(体积分数)的乙醇洗涤，12000×g低温离心10min，倒掉乙醇，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于200μL TE缓冲液(包含10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)和1mmol/LEDTA)，得到高质量的DNA提取液。

以上步骤中用的70％乙醇是指70mL纯乙醇用无菌去离子水定容到100mL的乙醇溶液。

以上实施例中的提取方法的工作原理如下：

SDS是一种表面活性剂，可以裂解细胞，并使蛋白质变性后与DNA分开。在使用SDS时辅以蛋白酶K，使SDS与蛋白酶K在EDTA的存在下共同破碎细胞。蛋白酶K是从霉菌中制备的蛋白酶，具有很强的水解蛋白质的能力，在SDS及EDTA溶液中仍然具有活性，故可以与SDS合用。在DNA提取液加入PVP，PVP可以与多酚类物质结合形成复合物，再经离心而除去这些多酚类物质。通过以上粗提取后，得到的DNA粗提液仍然含有较多的糖类等杂质，而后用CTAB能很好地去除糖类等杂质。CTAB是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(≥0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(如0.3mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，因此在高盐浓度下核酸与CTAB的复合物溶解在液相中，与其他杂质得以分离。经过沸水浴预处理的RNase A能够降解RNA，但不会影响DNA。DNA提取液经RNase A处理后，再用苯酚:氯仿:异戊醇抽提去除RNase A的影响。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在于溶液中，从而可达到去多糖的作用。CTAB在乙醇洗涤过程中能溶于乙醇随之被除去。乙醇洗涤之后的DNA产物部分干燥之后透明无色，易溶于水，完全满足基因组文库构建和高通量测序等分子生物学实验对DNA浓度和质量的要求。

采用以上实施例的方法，提取了8个DNA样品，对样品做了如下检测：

图1是8个DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以清晰观察到提取得到的DNA条带位于20kb上方，条带清晰且没有拖尾，说明DNA完整度高。

选取8个DNA样品中的两个进行脉冲场凝胶电泳(图2是DNA样品1和2的脉冲场凝胶电泳图)，可观察到DNA分子分布在40kb左右，其中，M1是用HindⅢ酶切的λ-DNA(Takara公司产品)，M2是1kb DNA Extension Ladder(Invitrogen公司产品)。

表1是使用NanoDrop 2000仪器对8个DNA样品进行质量检测的结果。A260/280位于1.85-2.02之间，表明DNA中蛋白和酚类污染残留很少。A260/230大于2，表明DNA纯度较高，基本没有糖类、盐类或有机溶剂污染。所得DNA浓度在495～1877.5ng/μL之间，说明DNA产量也较高。

表1.使用NanoDrop 2000仪器对DNA样品进行质量检测的结果

通过以上实施例，可知，与现有技术相比，本实施例具有如下优点：

(1)DNA提取液使用SDS、蛋白酶K和PVP等多重组分，能有效裂解细胞，抑制和水解核酸酶，并去除部分酚类物质的干扰。

(2)针对DNA粗提物仍含有大量多糖及酚类杂质的问题，采用CTAB进行进一步纯化，有效去除多糖和酚类物质的干扰。

(3)本实施例对DNA先进行粗提，然后用CTAB进行纯化，可以使CTAB用量大为减少(1mL DNA粗提液只需加0.15mL，约为常规方法的1/10)，既经济又方便。

(4)本方法提取得到的DNA分子量较大，具有较高的完整度。通过琼脂糖凝胶电泳(图1)，可观察到DNA条带清晰，无挂孔、无拖尾、无RNA带，说明DNA比较纯净；通过脉冲场凝胶电泳(图2)，可观察到DNA分子分布在40kb左右，说明DNA完整度高。

(5)得到的DNA经过NanoDrop 2000检测，A260/A280的值在1.85～2.02之间(表1)，说明DNA没有明显的蛋白质污染；A260/A230的值大于2，说明没有明显碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染；所得DNA浓度在495～1877.5ng/μL之间，说明DNA产量也较高。

本发明的实施例从多糖、多酚含量较高的蒙古沙冬青植株提取高质量的基因组DNA，在实践中，可以直接应用到新疆沙冬青，并推广到其他糖类酚类含量较高的各类植物的高质量DNA的提取。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种从沙冬青提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将植物材料经过液氮速冻后，研磨成粉末；

(2)往所述粉末中加DNA提取液分散均匀，然后加入蛋白酶K至所述蛋白酶K的终浓度20μg/mL，在65℃下保温1～2h，在保温期间，间歇摇动反应液，其中，所述DNA提取液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为15mL:2～5g，所述DNA提取液的成分包含：100mmol/L pH为8.0的Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1％(w/v)的SDS，100mmol/L EDTA，2％(w/v)的PVP；

(3)离心除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提2～3次，然后再次离心后收集抽提后的上清液；

(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA充分析出得到DNA沉淀；用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，部分干燥以除去残留乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；

(5)往步骤(4)中所得的DNA粗提液中加入NaCl至NaCl的终浓度为0.5mol/L，随后加入CTAB/NaCl溶液，再加入RNase A至RNase A的终浓度为10μg/mL，在65℃下保温一段时间；其中，所述CTAB/NaCl溶液的加入量为每1mL DNA粗提液加入1.5mL CTAB/NaCl溶液；

(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液抽提后，离心之后收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提，离心之后收集上清液；

(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6～0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，使DNA析出，所得DNA沉淀使用体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液中，得到高质量的DNA提取液。

2.如权利要求1所述的从沙冬青提取基因组DNA的方法，其特征在于：

所述步骤(3)具体为：(3)在常温4000×g下离心10min除去组织碎片，收集上清液，加入与所述上清液等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液，抽提2～3次，然后在常温12000×g下离心10min，收集抽提后的上清液；

所述步骤(4)具体为：(4)往步骤(3)中所述抽提后的上清液中，加入0.6～0.8倍体积的在0℃以下预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，于-20℃下静置1～2h，使DNA充分析出，然后在12000×g下低温离心10min使DNA沉淀；用在0℃以下预冷的体积分数为70％～75％的乙醇洗涤DNA沉淀，然后在12000×g下低温离心10min，倒掉乙醇，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于TE缓冲液，得到DNA粗提液，其中，所述TE缓冲液的体积与所述植物材料的质量之间的比值为9mL:2～5g；

所述步骤(5)中的保温时间为15min；

所述步骤(6)具体为：(6)往步骤(5)所得的溶液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合液，充分混匀，在12000×g下常温离心10min，收集上清液；再用与所述上清液等体积的氯仿:异戊醇混合液抽提一次，在12000×g下常温离心10min，收集抽提后的清液；

所述步骤(7)具体为：(7)往步骤(6)中得到的抽提后的上清液中加入0.6～0.8倍体积在0℃以下预冷的异丙醇，轻微颠倒混匀，置于-20℃下放置1～2h，使DNA析出，然后在12000×g下低温离心得到DNA沉淀，所得DNA沉淀使用0℃以下预冷的体积分数为70％～75％的乙醇洗涤，然后在12000×g下低温离心10min，倒掉乙醇，部分干燥以除去残留乙醇后，将沉淀溶于200μL的TE缓冲液中，至此得到高质量的DNA提取液。

3.如权利要求1或2所述的从沙冬青提取基因组DNA的方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(6)中，苯酚:氯仿:异戊醇的混合液中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比均为25:24:1。

4.如权利要求1或2所述的从沙冬青提取基因组DNA的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所述氯仿:异戊醇混合液中氯仿:异戊醇的体积比为24:1。

5.如权利要求1或2所述的从沙冬青提取基因组DNA的方法，其特征在于：所述步骤(4)和步骤(7)中，所述TE缓冲液的成分均包含：10mmol/L pH为8.0的Tris-HCl以及1mmol/LEDTA。

6.如权利要求1或2所述的从沙冬青提取基因组DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，CTAB/NaCl溶液是将CTAB以10％(w/v)的浓度溶于0.7mol/L NaCl溶液中形成。

7.如权利要求1或2所述的从沙冬青提取基因组DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，所述RNase A在加入前，经过以下预处理：将RNase A溶液在100℃下处理5min，使其中的DNase失活。