CN1970751B - 一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法。该方法是将罗布麻属植物叶片磨碎，加入裂解液裂解，在裂解的同时，向裂解液中加入还原剂与蛋白水解酶处理适当时间，用氯仿/异戊醇溶液去除蛋白，用醋酸钠溶液除去多糖，用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，用TE溶液溶解DNA。该方法可有效地从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA。

Description

一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法。

背景技术

罗布麻亦称野麻、茶叶花、泽漆麻等，是夹竹桃科(Apocynaceae)罗布麻属(Apocynum)的一种多年生宿根草本植物，虽然东部沿海有少量分布，但多分布于内蒙、新疆、甘肃气候干燥、含盐量高的地区。它不仅是入载《中华人民共和国药典》等的中国传统的中药材，还是典型的沙生、盐生植物，在药学、生态学等方面具有很大的研究和应用价值。随着研究与应用的深入，对罗布麻及其相关属种的研究已逐渐深入到分子水平。但由于罗布麻属植物的叶片含有较多的乳汁、多糖、黄酮类及蛋白质等多种物质；我国优良的罗布麻资源又多分布在新疆、甘肃等气候条件恶劣的边远地区，采集时很难有冷冻等较好的保存条件，获得的材料也很难都是幼嫩的叶片；我国的罗布麻资源正在急剧减小，像原先分布于新疆、甘肃的紫斑罗布麻已难觅其踪迹，很多研究必须依赖于保存在各标本馆中的标本；药用、茶用、烟用等的罗布麻叶片又经过各种处理再干燥的方法保存。要从以上这些材料中获得完整的基因DNA并进行分子生物学研究有一定的技术难度。据现有的文献可见，人们只能从种子萌发的黄化幼苗中提取基因组DNA。

由于罗布麻等植物长期生长于干旱或盐碱等缺水地区，植物叶片中含有大量的次生代谢物，而且处理后的叶片由于经过长期的干燥处理，组蛋白与基因组DNA发生严重的交链，致使罗布麻等生长于干旱或盐碱等缺水地区的植物以及各种经过各种加工处理的中药材、饮品等的DNA提取相当困难。现行市售的试剂盒和实验室常用方法都无法从除去黄化幼苗以外的罗布麻等植物叶片中提取中完整基因组DNA。

发明内容

本发明的目的是提供一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法。

本发明的技术方案是：用液氮充分磨碎植物，用SDS等裂解植物细胞，用还原剂(DTT)防止酚类物质氧化，用蛋白水解酶12～24小时温浴振荡处理以酶解去除与基因组DNA交链的组蛋白，用醋酸钠溶液去除多糖，用氯仿/异戊醇去除蛋白，用4℃预冷无水乙醇或异丙醇沉淀DNA的同时去除次生代谢物质，用TE溶液溶解DNA。

本发明的目的可以通过以下措施来实现：

一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法，该方法是将罗布麻属植物叶片磨碎，加入裂解液裂解，在裂解的同时，向裂解液中加入还原剂与蛋白水解酶处理适当时间，用氯仿/异戊醇溶液去除蛋白，用醋酸钠溶液除去多糖，用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，用TE溶液溶解DNA。

所述从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法，其中磨碎罗布麻属植物叶片时需加液氮充分研磨。

所述从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法，其中裂解液的主要成分为浓度按重量体积百分比(mg/mL，下同)计均为2％的CTAB和SDS，此外还含有1.4mol/LNaCl、1％PVP、0.02mol/LEDTA、0.1mol/LTris·HCl(pH 8.0)。

所述从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法，其中还原剂为DTT，终浓度为40mg/mL。

所述从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法，其中在裂解液中同时需加入10mg/mL的RNaseA和终浓度为40～60mg/mL的蛋白水解酶，35～45℃条件下振荡温浴12～24h植物组织。

所述从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法，该方法具体步骤为：

称取罗布麻属植物干燥叶片15mg或新鲜叶片100mg于研钵中，加液氮充分研磨；在液氮未挥发干前连同液氮将材料转移至50mL离心管中，待液氮挥发后，加入0.5～1mL裂解液，该裂解液主要成分为浓度均为2％的CTAB和SDS，同时还含有1.4mol/LNaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、0.1mol/L Tris·HCl(pH 8.0)，裂解时裂解液中还要加入DTT至终浓度为40mg/mL、10mg/mL RNaseA 4～6μL、木瓜蛋白酶至终浓度40～60mg/mL，35～45℃条件下振荡温浴12～24h；

将溶液转入dolph管中，加入0.6～1mL体积比为25∶24∶1的酚-氯酚-异戊醇混合溶液，抽提5～10min后，7000g离心5min；上清再次用体积比为25∶1的氯仿-异戊醇混合溶液多次抽提直至两相界面没有白色物质为止，取上清；

向上清中加入上清体积1/10的1～3mol/L醋酸钠以去除多糖，再在此基础上加入4℃预冷的无水乙醇使乙醇终浓度达70％，或加入异丙醇使异丙醇终浓度达50％，-20℃冰箱中2～12h；

15000g离心1min所得沉淀即为基因组DNA，加50～100μL的TE溶解备用。

本方法的有益效果：

本方法通过对常规植物基因组DNA提取方法的改进，尤其是在加入裂解液裂解植物组织的同时，加入了木瓜蛋白酶，并经长时间裂解植物组织(一般植物组织基因组DNA提取时裂解时间为0.5～1小时，而本方法需要12～24小时)，以充分去除包裹着基因组DNA的组蛋白，从而得以使得基因组DNA提取成功。

应用本方法不仅可以从新疆、内蒙、宁夏等干燥地区取材的自然干燥的罗布麻属植物叶片中提取出基因组DNA，还可从市售的罗布麻茶、保存多年的紫斑罗布麻标本叶片中提取出基因组DNA(具体见下面实施例)。应用该方法提取的基因组DNA不仅包括了完整的核基因组，还包括了叶绿体和线粒体等的细胞器基因组(证明见下面实施例)。

本方法可以从幼年期直至成熟期(如每年十月份取材的)罗布麻的新鲜叶片、硅胶干燥、自然干燥叶片以及可从在标本馆中保存了18年的标本叶片中提取出琼脂糖凝胶电泳显示呈清晰的单条带的完整基因组DNA。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

2005年10月采集于内蒙通辽扎旌地区的罗布麻叶片，经自然晒干保存.称取15mg该叶片经液氮充分研磨后，在液氮未挥发干前连同液氮将材料转移至50mL带盖塑料离心管中，待液氮挥发后，加入0.5～1mL裂解液(2％CTAB，并加入1.4mol/LNaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、pH 8.00.1mol/L Tris·HCl和2％SDS)，再向其中加入DTT至终浓度为40mg/mL、4～6μLRNaseA(10mg/mL)、木瓜蛋白酶(至终浓度40～60mg/mL)，35～45℃条件下振荡温浴12～24h；

将溶液转入dolph管中，加入0.6～1mL的酚-氯酚-异戊醇(体积比：25/24/1)，抽提5～10min后，7000g离心5min；上清再次通过氯仿-异戊醇(体积比：25/1)的多次抽提直至两相界面没有白色物质为止，取上清；

向上清中加入上清体积1/10的1～3mol/L醋酸钠以去除多糖，再在此基础上加入4℃预冷的无水乙醇使乙醇终浓度达70％，或加入异丙醇使异丙醇终浓度达50％，-20℃冰箱中静置2～12h；

15000g离心1min所得沉淀即为基因组DNA，加50～100μL的TE溶解备用。

经过以上提取过程，最后所得DNA提取液的OD_260/280＝1.7～1.9，琼脂糖凝胶电泳后呈现清晰的单条带，显示提取的基因组DNA是完整的基因组DNA。

验证：利用该基因组DNA作为PCR模板，应用核基因组ITS的通用引物ITS4(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，即SEQ ID No.1)和ITS5(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，即SEQ ID No.2)和叶绿体基因组trnL内含子和trnL-F间隔区的通用引物“c”(5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’，即SEQ ID No.3)和“e”(5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’，即SEQ ID No.4)进行PCR反应，可以得到单条带的PCR产物。经测序后所得序列已提交GenBank。其ITS、trnL内含子和trnL-F间隔区的序列号分别为DQ449485、DQ463213和DQ463212。

实施例2

1988年采集于宁夏中巴县的紫斑罗布麻，经常规压制成干叶标本。2005年12月称取15mg该标本上的叶片，经液氮充分研磨后，在液氮未挥发干前连同液氮将材料转移至50mL带盖塑料离心管中，待液氮挥发后，加入0.5～1mL裂解液(2％CTAB，内含1.4mol/L NaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、pH 8.00.1mol/L Tris·HCl和2％SDS)，再向其中加入DTT至终浓度为40mg/mL、4～6μL RNaseA(10mg/mL)、木瓜蛋白酶(至终浓度40～60mg/mL)，35～45℃条件下振荡温浴12～24h；

将溶液转入dolph管中，加入0.6～1mL的酚-氯酚-异戊醇(体积比：25/24/1)，抽提5～10min后，7000g离心5min；上清再次通过氯仿-异戊醇(体积比：25/1)的多次抽提直至两相界面没有白色物质为止，取上清；

向上清中加入上清体积1/10的1～3mol/L醋酸钠以去除多糖，再在此基础上加入2.5倍体积4℃预冷的无水乙醇使乙醇终浓度达70％，或加入等体积的异丙醇使异丙醇终浓度达50％。-20℃冰箱中2～12h；

15000g离心1min所得沉淀即为基因组DNA，加50～100μL的TE溶解备用。

经过以上提取过程，最后所得DNA提取液的OD_260/280＝1.82，琼脂糖凝胶电泳后呈现清晰的单条带，显示提取的基因组DNA为完整的基因组DNA。

验证：利用该基因组DNA作为PCR模板，应用核基因组ITS的通用引物ITS4(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，即SEQ ID No.1)和ITS5(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，即SEQ ID No.2)和叶绿体基因组trnL内含子和trnL-F间隔区的通用引物“c”(5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’，即SEQ ID No.3)和“e”(5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’，即SEQ ID No.4)进行PCR反应，可以得到单条带的PCR产物。经测序后所得序列已提交GenBank。其ITS、trnL内含子和trnL-F间隔区的序列号分别为DQ451830、DQ463216和DQ463217。

序列表

<110>南京师范大学生命科学学院

<120>一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法

<160>4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物

<400>

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物

<400>

tcctccgctt attgatatgc   20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物

<400>

cgaaatcggt agacgctacg   20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工引物

<400>

atttgaactg gtgacacgag  20

Claims (3)

1.一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组DNA的方法，其特征在于该方法是将罗布麻属植物叶片磨碎，加入裂解液裂解，该裂解液主要成分为浓度均为2％的CTAB和SDS，同时还含有1.4mol/L NaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、0.1mol/L Tris.HCl.pH 8.0；在裂解的同时，裂解液中还要加入DTT至终浓度为40mg/mL、10mg/mL RNaseA4～6μL、木瓜蛋白酶至终浓度40～60mg/mL，35～45℃条件下振荡温浴12～24h，用氯仿/异戊醇溶液去除蛋白，用醋酸钠溶液除去多糖，用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，用TE溶液溶解DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于磨碎罗布麻属植物叶片时需加液氮充分研磨。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法具体步骤为：

称取罗布麻属植物干燥叶片15mg或新鲜叶片100mg于研钵中，加液氮充分研磨；在液氮未挥发干前连同液氮将材料转移至50mL离心管中，待液氮挥发后，加入0.5～1mL裂解液，该裂解液主要成分为浓度均为2％的CTAB和SDS，同时还含有1.4mol/LNaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、0.1mol/L Tris·HCl，pH 8.0；裂解时裂解液中还要加入DTT至终浓度为40mg/mL、10mg/mL RNaseA 4～6μL、木瓜蛋白酶至终浓度40～60mg/mL，35～45℃条件下振荡温浴12～24h；

将溶液转入dolph管中，加入0.6～1mL体积比为25∶24∶1的酚-氯酚-异戊醇混合溶液，抽提5～10min后，7000g离心5min；上清再次用体积比为25∶1的氯仿-异戊醇混合溶液多次抽提直至两相界面没有白色物质为止，取上清；

向上清中加入上清体积1/10的1～3mol/L醋酸钠以去除多糖，再在此基础上加入4℃预冷的无水乙醇使乙醇终浓度达70％，或加入异丙醇使异丙醇终浓度达50％，-20℃冰箱中2～12h；

15000g离心1min所得沉淀即为基因组DNA，加50～100μL的TE溶解备用。