CN102140521B

CN102140521B - 一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法

Info

Publication number: CN102140521B
Application number: CN 201110028117
Authority: CN
Inventors: 濮存海; 王云灵
Original assignee: NANJING ZHONGSHAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: NANJING ZHONGSHAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN102140521A

Abstract

本发明属于中药复方制剂鉴定领域，公开了一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法。该方法包括(1)土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤；(2)PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤；(3)扩增产物电泳鉴定步骤。通过该方法能够成功提取土鳖虫基因组DNA，并扩增出土鳖虫线粒体16S rRNA片段，从而准确鉴定土鳖虫的真伪、种类、产地以及胶囊中是否含有土鳖虫。

Description

一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法

技术领域

本发明属于中药复方制剂鉴定领域，涉及一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法。

背景技术

目前市售的中成药中，有许多含有中药粉末原料。由于粉末类中药的组成成分复杂，干扰因素多，用粉末鉴别和化学分析，有些中药极难检出。近年来超微粉碎制成的中药制剂，由于破坏了细胞组织的特征，增加了检验的难度，传统鉴别技术更是束手无策，不利于中药鉴别和质量标准化。而传统剂型如散剂、丸剂及现代剂型袋泡茶、片剂、胶囊等中成药仍含部分或微量生药，由于中成药的组成及成分复杂性，干扰因素多，用传统生药学方法鉴定上述含生药中药制剂或鉴定全原生药制剂的真伪及纯度存有较大的难度。

活血止痛胶囊是活血止痛散改剂型的原国家四类新药，该处方最早见报道于《赵炳南临床经验集》，是当代中医学治疗跌打损伤、瘀血肿痛的经典方剂之一。其处方由当归、土鳖虫、自然铜(煅)、三七、乳香(醋)、冰片6味药组成。土鳖虫，又名地鳖虫、土元等，在我国有悠久的药用历史。土鳖虫含多种氨基酸，挥发油，脂肪醛和芳香醛，生物碱，β-谷甾醇，鲨肝醇，尿嘧啶和尿囊素，尚含多种微量元素。方中土鳖虫为臣药，现有质量标准采用显微鉴定的方法鉴定其刚毛。该方法的鉴定标识在生物学上为物种的遗传表现型，不仅受到遗传因素的影响，而且与生物体的生长发育阶段、环境条件等有着密切的关系，具有很大的变异性和可塑性，且受鉴定者主观判断影响较大，在复方药味复杂、药材显微形态多被破坏的情况下，显微鉴定多受限制。因此，需要探索一种更客观的检测方法。

中药分子鉴定技术的发展，为中成药鉴定提供了一种新的方法。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素、生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每个个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息，因此，用分子生物学遗传标记对中药材进行鉴别更为准确可靠。目前随机扩增多态性DNA(RAPD)已成功应用于多种中药鉴定中。

发明人也曾尝试采用随机扩增多态性(RAPD)技术对活血止痛胶囊中的土鳖虫进行鉴定，实验发现，对于不同厂家、不同批号的活血止痛胶囊，无法获得与其对应的缺土鳖虫的阴性对照品，因为不同产地的同种药材基因组各有差异，表现在RAPD图谱中为扩增条带的区别，难以获得土鳖虫的特有条带。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种土鳖虫药材的分子鉴定方法。

本发明的另一目的是提供活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种土鳖虫药材的分子鉴定方法，包括(1)土鳖虫药材中基因组DNA的提取纯化步骤；(2)PCR扩增土鳖虫16S rRNA步骤；(3)扩增产物电泳鉴定和/或测序鉴定步骤；其中：

(1)土鳖虫药材中基因组DNA的提取纯化步骤采用改良蛋白酶K结合吸附柱法：先利用传统的蛋白酶K法初步提取土鳖虫药材中基因组DNA，然后加等体积的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的三氯甲烷∶异戊醇抽提，所得上清转移至胶回收试剂盒的吸附柱中按照传统的吸附柱法纯化DNA；

(2)所述的PCR扩增土鳖虫16S rRNA步骤是利用引物16Sra：SEQ ID NO.1和16Srb：SEQID NO.2对步骤(1)提取纯化的土鳖虫药材中基因组DNA进行扩增；

(3)所述的扩增产物电泳鉴定步骤是将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果能扩增出420bp左右的条带则表示土鳖虫药材含有土鳖虫成分；或者对PCR扩增产物进行测序鉴定，通过序列比对，鉴定土鳖虫药材的真伪、土鳖虫的种类或产地。

所述的土鳖虫药材中基因组DNA的提取纯化具体步骤为：取粉碎至80目目的土鳖虫药材粉末加匀浆缓冲液，50～60℃水浴4～6h，水浴结束后，冷至室温，加等体积的体积比为25∶24∶1的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇抽提一次，上清转移至常规胶回收试剂盒的吸附柱中，按照说明书记载的方法获得纯化的土鳖虫药材基因组DNA溶液。

所述的匀浆缓冲液组成：由8份A液，1份B液，1份C液组成，其中A液：pH8.0的Tris 0.05mol·L^-1，NaCl 0.1mol·L^-1，pH8.0的EDTA 0.1mol·L^-1；B液：5％SDS；C液：2mg/mL蛋白酶K。

所述的PCR扩增体系为：总体积25μL，10mmol/L dNTPs 2μL，10×Taq buffer 2.5μL，Taq酶0.6U，5μmol/L引物16Sra和16Srb各1μL，步骤(1)提取纯化的土鳖虫药材基因组DNA溶液1μL，双蒸水补足体积至25μL，最后加10μL矿物油；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃复性1min，72℃延伸90s，35个循环后再72℃延伸10min。

土鳖虫药材是经以95％乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干。

一种活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法，包括(1)活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤；(2)PCR扩增土鳖虫16S rRNA步骤；(3)扩增产物电泳鉴定和/或测序鉴定步骤；其中：

(1)所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取步骤采用改良蛋白酶K结合吸附柱法：先利用传统的蛋白酶K法初步提取活血止痛胶囊基因组DNA，然后加等体积的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的三氯甲烷∶异戊醇抽提，所得上清转移至胶回收试剂盒的吸附柱中按照传统的吸附柱法纯化DNA；

(2)所述的PCR扩增土鳖虫16S rRNA步骤是利用引物16Sra：SEQ ID NO.1和16Srb：SEQID NO.2对步骤(1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA进行扩增；

(3)所述的扩增产物电泳鉴定步骤是将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果能扩增出420bp左右的条带则表示活血止痛胶囊中含有土鳖虫组分。

所述的活血止痛胶囊制备方法见中国药典2005版第一部，其中的土鳖虫是经95％乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干后入药。DNA质量优劣是分子生物学研究的基础，发明人曾提取市售三个厂家的活血止痛胶囊基因组DNA，结果均不能获得完整的高质量DNA，无法进行下一步扩增。目前市售的活血止痛胶囊中所用土鳖虫多为热水烫死后晒干或烘干处理，经实验证实，经该法处理后土鳖虫放置半年DNA已严重降解，无法进行后续分子实验。本发明中所述的活血止痛胶囊中的土鳖虫是经95％乙醇处理放置半年后入药，实验显示，本发明中所述的活血止痛胶囊基因组DNA保存完整，无降解，可以满足分子实验的要求。

所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取具体步骤为：取活血止痛胶囊内容物加匀浆缓冲液，50～60℃水浴4～6h，水浴结束后，冷至室温，加等体积的体积比为25∶24∶1的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇抽提一次，上清转移至常规胶回收试剂盒的吸附柱中，按照说明书记载的方法获得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液。

所述的匀浆缓冲液组成：由8份A液，1份B液，1份C液组成，其中A液：pH8.0的Tris0.05mol·L^-1，NaCl 0.1mol·L^-1，pH8.0的EDTA0.1mol·L^-1；B液：5％SDS；C液：2mg/mL蛋白酶K。

发明人曾考察采用传统蛋白酶K法^[1]、蛋白酶K^[1]结合吸附柱法^[2]与改良蛋白酶K结合吸附柱法提取活血止痛胶囊基因组DNA，结果表明，传统蛋白酶K法可以提取土鳖虫单味药材中的基因组DNA，但对活血止痛胶囊基因组DNA提取不成功；蛋白酶K结合吸附柱法为采用蛋白酶K匀浆缓冲液释放核酸后直接用吸附柱对DNA纯化，未抽提蛋白，结果无法提取出DNA，电泳检测没有DNA条带；采用本发明改良蛋白酶K结合吸附柱法可获得清晰明亮的DNA条带(图5)。

所述的PCR扩增体系为：总体积25μL，10mmol/L dNTPs 2μL，10×Taq buffer(含Mg²⁺)2.5μL，Taq酶0.6U，5μmol/L引物16Sra和16Srb各1μL，步骤(1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA溶液1μL，双蒸水补足25μL，最后加10μL矿物油；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃复性1min，72℃延伸90s，35个循环后再72℃延伸10min。

有益效果：

(1)本发明自创的改良蛋白酶K结合吸附柱法能够从活血止痛胶囊中提取出完整性好，纯度高的土鳖虫基因组DNA，有利于后续分子实验：而传统的蛋白酶K法提取活血止痛胶囊基因组DNA，所得DNA片段降解严重，且为褐色冻胶状，含有大量的多糖等杂质，无法进行下一步实验。采用多种方法去除杂质，效果不佳。采用本实验所创方法，除杂效果好，DNA提取完整性好，纯度高，易于进行后续实验。

(2)本发明通过检测土鳖虫16SrRNA进行活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定，本方法能微量、快速、准确地鉴别活血止痛胶囊中的土鳖虫成分，具有专属性强、特异性高、灵敏度高的优点，更好地解决粉末中药(中成药)鉴定的技术难题，以确保中成药质量，防止掺伪与掺假。

(3)RAPD技术受许多因素影响，实验稳定性和重复性差。RAPD对反应条件相当敏感，包括模板的质量与浓度、Mg²⁺浓度，短的引物序列，仪器设备，实验室环境等均可能造成实验结果重复性差。且对于不同厂家、不同批号的活血止痛胶囊，无法获得与其对应的缺土鳖虫的阴性对照品，因为不同产地的同种药材基因组各有差异，导致无法做出其标准的遗传图谱，难以确定土鳖虫的特有遗传标记。基于16SrRNA测序技术的土鳖虫分子鉴定方法，在昆虫进化及分类学中应用较多。由于土鳖虫隶属于昆虫纲鳖蠊科地鳖属，应用16SrRNA测序技术，可以获得其16SrRNA序列，由其序列可得知其种属，因此，利用16SrRNA进行鉴定具有专属性，且稳定性、重现性良好。

(4)土鳖虫的传统鉴定方法有性状鉴定、显微鉴定和薄层色谱鉴定，这些方法虽然简便、快速，但对破碎药材、粉末药材的鉴定有一定的局限性。现代分子生物学研究发现，中药材(不含矿物药)物种的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性可在分子水平上检测，它比在形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记。由于DNA分子标记直接分析的是生物的基因型而非表现型，鉴别结果不受环境因素、样品形态(原品、粉状或片状)和材料来源的影响，因此可为中药品种鉴别提供更加准确可靠的手段。采用分子生物学方法对土鳖虫16SrRNA进行鉴定，可以直观清楚的由其序列得出所需鉴定的土鳖虫种类。如若构建出土鳖虫的各个产地的序列图谱，则可以根据鉴定的样本16SrRNA序列得出其产地。

(5)现有的土鳖虫处理方法如下：

1、净制法：取原药材，拣去杂质，用清水洗净或筛去灰屑，干燥即得。

2、烘焙法：置沸水中烫死，除去杂质，晒干或烘干。(中国药典)

或取净土鳖虫在铁筛或新瓦上慢火焙至干脆，研粉即可。

3、酒制法

3.1取净土鳖虫，用白酒浸洗洁净，置炒锅内按清炒法用文火微炒至焦脆，取出，筛去脱落的头皮及灰屑，达到洁净无污染，即得。每土鳖虫100kg，用白酒10kg。

3.2取土鳖虫，用酒洗净，文火焙干。如系活土鳖虫，置沸水中烫死，或用酒焖死，取出，文火焙干。

4、盐水烫制法：用50％盐开水烫，快速翻动数次，让盐水充分吸收，烫后不宜曝晒，最好放于阴凉通风处阴干。

5、酥油制法取酥油，置锅内，用文火加热化开，将净土鳖虫倒入，拌匀，用文火加热，炒至表面色泽加深时，出锅，筛去屑，放凉。每净土鳖虫100kg，用酥油5kg。

6、炒制法将净土鳖虫置锅内，文火炒至色泽加深时，取出，放凉。

7、土制法：取原药材，用细土拌匀加文火慢炒至微黄为度，筛去土及杂质即可。

以上处理方法凡是用到炒制的，全部需用到热水烫死后晒干的土鳖虫原药材；另有酒制法，因对酒的要求未注明，故酒精浓度不确定，且后期依旧用炒制法，故不可取。而本发明土鳖虫以95％乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干即可。高浓度的乙醇可以快速固定DNA，且使药材干燥变迅速，故该种处理方法能够确保DNA保存完整，无降解，可以满足分子实验的要求。

附图说明

图1、土鳖虫基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，

M：15kb DNAMarker；1：土鳖虫；2：活血止痛胶囊；3：缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照。

图2、实施例1中各样品16SrRNA扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，

M：2kb DNAMarker；1：土鳖虫；2：活血止痛胶囊；3：缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照。

图3、实施例2各样品16SrRNA扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，

M：2kb DNAMarker；1：野生土鳖虫药材；2：养殖土鳖虫药材；3：野生土鳖虫制活血止痛胶囊；：4：养殖土鳖虫制活血止痛胶囊；4：缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照；5：空白对照。

图4、实施例2中野生(PY)和养殖(DY)土鳖虫16SrRNA与GENBANK中的土鳖虫(GB)16SrRNA序列的比对结果图，

GB：GENBANK收录土鳖虫；DY：江苏丹阳养殖土鳖虫；PY：山东平邑野生土鳖虫。

图5、三种方法提取基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，

a1：传统蛋白酶K法提取土鳖虫基因组DNA；a2：传统蛋白酶K法提取活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA；b1：蛋白酶K结合吸附柱法提取土鳖虫基因组DNA；b2：蛋白酶K结合吸附柱法提取活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA；c1：改良蛋白酶K结合吸附柱法提取土鳖虫基因组DNA；c2：改良蛋白酶K结合吸附柱法提取活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA。

具体实施方式

实施例1

土鳖虫药材中土鳖虫基因组DNA提取方法：活体土鳖虫是以95％乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干后粉碎至80目。取适量(约0.1g，研磨移入2mL离心管中不超过0.5刻度)土鳖虫药材粉末，放入研钵，加匀浆缓冲液研磨至成糊状，转入2mL离心管，补加匀浆缓冲液至1mL，混匀。58℃水浴5h，期间每隔半小时轻轻颠倒混匀。水浴结束后，冷至室温。加等体积的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，缓慢颠倒混匀，8000r/min离心10min，上清转移至新离心管中。重复该步抽提至水层与酚层中间无蛋白层。上清加等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒混匀，8000r/min离心10min。上清转移至胶回收试剂盒(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，爱思进生物技术(杭州)有限公司)的吸附柱中，静置3min使充分吸附，12000r/min离心1min，弃滤液。按试剂盒说明书，依次用buffer W1、W2洗涤DNA。将吸附柱置37℃烘箱挥干乙醇，置1.5mL离心管中，加20μL无菌水，静置1min，充分洗脱DNA，12000r/min离心1min，弃吸附柱，即得纯化的土鳖虫药材基因组DNA溶液。-20℃保存。

活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA提取方法：取活血止痛胶囊内容物适量(约0.1g，研磨移入2mL离心管中不超过0.5刻度)，放入研钵，加匀浆缓冲液研磨至成糊状，转入2mL离心管，补加匀浆缓冲液至1mL，混匀。58℃水浴5h，期间每隔半小时轻轻颠倒混匀。水浴结束后，冷至室温。加等体积的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，缓慢颠倒混匀，8000r/min离心10min，上清转移至新离心管中。重复该步抽提至水层与酚层中间无蛋白层。上清加等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒混匀，8000r/min离心10min。上清转移至胶回收试剂盒(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，爱思进生物技术(杭州)有限公司)的吸附柱中，静置3min使充分吸附，12000r/min离心1min，弃滤液。按试剂盒说明书，依次用buffer W1、W2洗涤DNA。将吸附柱置37℃烘箱挥干乙醇，置1.5mL离心管中，加20μL无菌水，静置1min，充分洗脱DNA，12000r/min离心1min，弃吸附柱，即得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液。-20℃保存。

上述活血止痛胶囊的制备方法见中国药典2005版第一部，其中土鳖虫是以95％乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干后入药。

匀浆缓冲液组成：由8份A液，1份B液，1份C液组成(用时新鲜配制)。A液：Tris(pH8.0)0.05mol·L^-1，NaCl 0.1mol·L^-1，EDTA(pH8.0)0.1mol·L^-1；B液：5％SDS；C液：2mg/mL蛋白酶K。

取土鳖虫药材、活血止痛胶囊及缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照按照上述方法提取土鳖虫基因组DNA，所得土鳖虫基因组DNA溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。由图1可见：本发明基因组DNA提取方法可从土鳖虫药材与活血止痛胶囊中成功提取到土鳖虫基因组DNA。

以16Sra(SEQ ID NO.1)和16Srb(SEQ ID NO.2)为引物，分别以上述从土鳖虫药材、活血止痛胶囊及缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照中提取的土鳖虫基因组DNA为模板，PCR扩增土鳖虫的16S rRNA。PCR扩增体系为：总体积25μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，10*Taqbuffer(含Mg²⁺)2.5μL，Taq酶0.6U，引物(5μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补足体积，最后加10μL矿物油。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃复性1min，72℃延伸90s，35个循环后再72℃延伸10min。

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。图2显示从土鳖虫药材及活血止痛胶囊中均能成功获得420bp左右的目的条带，而缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照则不能扩增出相应条带。可见本发明方法不仅可用于土鳖虫药材的鉴定，还可用于活血止痛胶囊中土鳖虫的鉴定。

实施例2

取野生(PY)和养殖(DY)土鳖虫以95％乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干，分别得到野生(PY)和养殖(DY)土鳖虫药材；取土鳖虫药材按照药典方法制成活血止痛胶囊，取按照实施例1方法分别提取土鳖虫基因组DNA。其中；野生土鳖虫(活体)，采集于山东平邑；养殖土鳖虫(活体)，购自江苏丹阳。

以16Sra(SEQ ID NO.1)和16Srb(SEQ ID NO.2)为引物，以提取的土鳖虫基因组DNA为模板，PCR扩增土鳖虫的16S rRNA。PCR扩增体系为：总体积25μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，10*Taq buffer(含Mg²⁺)2.5μL，Taq酶0.6U，引物(5μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补足体积，最后加10μL矿物油。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃复性1min，72℃延伸90s，35个循环后再72℃延伸10min。

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。由图3可见，野生(PY)和养殖(DY)土鳖虫、野生(PY)和养殖(DY)土鳖虫制成的活血止痛胶囊，均能成功获得420bp左右的目的条带，而缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照和空白对照均不能扩增出相应条带。

对目的条带切胶回收，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，回收产物送交金斯瑞生物科技有限公司测序，得到野生(PY)和养殖(DY)土鳖虫的16S rRNA序列总长度分别为374bp、378bp。所测序列已被GENBANK收录，登录号见表1，与GENBANK中的土鳖虫(GB)序列的比对结果见图4。比对结果显示：各碱基频率差异较大，其中A+T含量为67.5％，G+C含量为32.5％，土鳖虫的16SrRNA序列富含AT碱基，这与昆虫的16S序列富含AT碱基的报道一致。且变异位点全部为碱基的转换。三种土鳖虫的相似度为98.9％～99.2％，平均相似度为99.1％。种内相似度高，野生与养殖差异不大。

可见本发明提供的分子鉴定方法能够适用于活血止痛胶囊中土鳖虫的鉴定与检测。并且该鉴定方法不受土鳖虫产地的影响，因此本方法可用于鉴定不同产地的土鳖虫制备的活血止痛胶囊。

表1序列登录号

参考文献：

[1]田英芳，黄刚，郑哲民，等。一种简易的昆虫基因组DNA提取方法[J].陕西师范大学学报·自然科学版，1999，27(4)：82～84.

[2]杨同文，马利华。CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒提取食用菌DNA[J].生物技术，2009，19(1)：32～34.

Claims

1.一种活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法，包括（1）活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤；（2）PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤；（3）扩增产物电泳鉴定和/或测序鉴定步骤；其特征在于：

所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤采用改良蛋白酶K结合吸附柱法：取活血止痛胶囊内容物加匀浆缓冲液，50~60 ℃水浴4~6h，水浴结束后，冷至室温，加等体积的体积比为25∶24∶1的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷：异戊醇抽提一次，上清转移至常规胶回收试剂盒的吸附柱中，按照说明书记载的方法获得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液；其中所述的匀浆缓冲液组成：由8份A液，1份B液，1份C液组成，其中A液：pH8.0的Tris 0.05 mol·L^-1, NaCl 0.1 mol·L^-1, pH8.0的EDTA 0.1 mol·L^-1；B液：5% SDS；C液：2 mg/mL 蛋白酶K；

所述的PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤是利用引物16Sra：SEQ ID NO.1和16Srb：SEQ ID NO.2对步骤（1）提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA进行扩增；

所述的扩增产物电泳鉴定步骤是将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果能扩增出420 bp左右的条带则表示活血止痛胶囊中含有土鳖虫组分；

其中，所述的活血止痛胶囊中的土鳖虫是经以95%乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干后入药。

2.根据权利要求1所述的活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法，其特征在于所述的PCR扩增体系为：总体积25 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，10 ×Taq buffer 2.5 μL，Taq酶 0.6 U，5 μmol/L引物16Sra和16Srb各1 μL，步骤（1）提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA溶液1 μL，双蒸水补足体积至25μL，最后加10 μL矿物油；反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸90 s，35个循环后再72 ℃延伸10 min。