CN104975083B

CN104975083B - 一种快速鉴定烟粉虱meam1、med两隐种的引物及其鉴定方法

Info

Publication number: CN104975083B
Application number: CN201510311511.XA
Authority: CN
Inventors: 郑宇�; 何玉仙; 姚凤銮; 赵建伟; 丁雪玲; 翁启勇
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2017-11-17
Anticipated expiration: 2035-06-09
Also published as: CN104975083A

Abstract

本发明公开了快速鉴定烟粉虱MEAM1、MED两隐种的引物及鉴定方法。主要针对烟粉虱MEAM1、MED两隐种线粒体COI基因序列分别设计一对特异引物：MEAM1隐种为：5’‑CACTATAATTATTGCTGTTCCC‑3’；5’‑ACCTAAGATTAGTGGAAATC‑3’；MED隐种为5’‑TTAATTAGCAGCGAGGCTGG‑3’，5’‑AGGAAC GGCAATAATCATAGTAGC‑3’；同时针对样品DNA提取进行改进，提供了一套大量单只烟粉虱样品DNA的快速提取方法，能短时间稳定获取适用于两隐种鉴别的大量单只样品DNA。构建了一个分子鉴别烟粉虱MEAM1、MED隐种的双引物PCR扩增体系。本发明可应用于田间外来入侵烟粉虱大量MEAM1、MED隐种间的快速鉴定、田间分布、风险评估，为烟粉虱防治策略的制定提供科学依据。

Description

一种快速鉴定烟粉虱MEAM1、MED两隐种的引物及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及农作物害虫检测、鉴定及防治技术的领域，具体地说，涉及一种快速鉴定烟粉虱MEAM1、MED两隐种的引物及其鉴定方法，专用于外来入侵生物烟粉虱MEAM1、MED隐种间的快速、灵敏、准确的分子鉴定，同时可用于田间烟粉虱大量群体中入侵隐种的监测和预报工作。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)广泛分布于除南极洲以外的全球各大洲，是热带、亚热带及相邻温带地区的一种重要害虫(Brown et al.,1995)。烟粉虱是一个不断进化过程的一个复合群体，根据不同地理种群在寄主范围、危害习性、传毒能力和生殖隔离等生物学的差异，烟粉虱可分为不同的隐种，目前报道已有30多隐种。其中MEAM1隐种在全世界范围内分布最广、危害最严重，被冠以“超级害虫”的恶名(Costa and Brown,1991；Culotta,1991)。目前研究表明，随之而来是烟粉虱MED隐种的进一步危害。

随着人类社会的活动、交流日益频繁，及时掌握外来入侵生物烟粉虱在我国或本地区不同分布状况，特别是MEAM1、MED两个危害性极强的隐种的入侵情况，对于评估烟粉虱对农业生产威胁和潜在风险，及时制定害虫防范措施是非常有意义的。由于烟粉虱复合种内的隐种在形态上难以区分，因此一些传统形态学分类的方法很难胜任。近来随着科学技术的发展，许多新的技术方法不断引入该领域，其中PCR技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于烟粉虱分类和隐种研究。研究表明烟粉虱不同隐种在DNA水平上具有较为明显的遗传分化，这就为从分子水平上快速鉴定烟粉虱隐种成为可能。目前，用于烟粉虱隐种遗传分析的分子标记包括酯酶标记、RAPD、AFLP、核糖体ITS1(rDNA ITS1)、线粒体16SrDNA、线粒体COI(mtDNA COI)等DNA分子标记。但这些方法还存在费时费力的问题，难以满足生产中鉴定的实际需要。因此，建立一套结果可靠、易于操作、灵敏度高的烟粉虱隐种快速检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术中烟粉虱隐种鉴定方法无法适应大量单只样品鉴别，且周期长、费用高等问题，提供了快速鉴定烟粉虱MEAM1、MED两隐种的引物，构建了一个用于鉴定烟粉虱MEAM1、MED隐种的双引物PCR扩增体系，结果可靠。

我们利用已有的烟粉虱线粒体COI(mtDNA COI)数据库进行序列比较，分别筛选设计出烟粉虱MEAM1、MED隐种的特异引物，包括2对引物对，其中，1对引物对为烟粉虱MEAM1隐种的特异引物，序列为：

上游引物SEQ ID NO.1：5’-CACTATAATTATTGCTGTTCCC-3’；

下游引物SEQ ID NO.2：5’-ACCTAAGATTAGTGGAAATC-3’；

另一对引物对为烟粉虱MED隐种的特异引物，序列为：

上游引物SEQ ID NO.3：5’-TTAATTAGCAGCGAGGCTGG-3’；

下游引物SEQ ID NO.4：5’-AGGAACGGCAATAATCATAGTAGC-3’。

本发明还包括上述引物在鉴定烟粉虱MEAM1、MED隐种的应用。

筛选设计出的烟粉虱MEAM1、MED隐种特异引物，用于构建烟粉虱MEAM1、MED隐种快速、简便、可靠的鉴定体系。

利用上述引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳后特异性地扩增出291bp条带时，判断烟粉虱为MEAM1隐种，扩增出173bp条带时，判断烟粉虱为MED隐种。

应用烟粉虱MEAM1、MED隐种特异引物，鉴定烟粉虱MEAM1、MED隐种的PCR扩增体系的构建，具体包括：

(1)样品DNA提取；

(2)PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl10×PCR反应缓冲液，各0.5μl 10μmol/L所述引物，和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；其中，PCR反应缓冲液含2.0mmol/L Mg²⁺，0.5μl10μmol/L 4×dNTPs，0.2μl 5U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min。

将3μl PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产物的有无和片段大小判定结果，如果能特异性地扩增出291bp条带时，即判断烟粉虱为MEAM1型，如能扩增出173bp条带时，判断烟粉虱为MED型。

其中，所述样品DNA提取优选为一种大量单个样品的DNA提取方法，包括下述步骤：

1)根据样品数量，取PCR管若干，置于PCR黄板上。将单只烟粉虱样品小心置入PCR管底部。研磨棒头粘少许DNA提取液(质量分数为1％的SDS，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，25mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA)，置于PCR管底部与样品接触后利用电动研磨器代替手工研磨，研磨均匀后，每管加入40ulDNA提取液和2ul蛋白酶K液(proteinase K)，混匀备用；

2)将混匀的所述样品在58℃下水浴20min，然后加入预冷的无水乙醇80u1，轻轻混匀，-20℃沉淀10min；

3)将所述沉淀样品在12000r/min离心3min，弃上清液，自然或通风晾干，加入TE溶液(20-40ul)，保存备用即可。

本发明的关键性技术是大量烟粉虱单个样品DNA快速提取方法和MEAM1、MED两隐种的特异引物序列及PCR扩增体系。对现有DNA提取方式进行优化改进，适当提高水浴温度，省去酚或氯仿提取步骤，直接用无水乙醇沉淀DNA用于PCR扩增。优化流程，省去转换离心管过程，快速高效。为了获得特异引物序列，本发明在烟粉虱MEAM1、MED两隐种多个样品的线粒体COI(mtDNA COI)基因片段序列的基础上应用ClustalX软件比对，发现不同的保守和变异碱基序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异引物，并通过Oligo 6.0软件和primer-Blast进行验证分析，并以2014年福建省八个地市采集烟粉虱50份样品为供试材料，按上述PCR体系和鉴定方法，特异性地扩增出291bp条带时，即可判断隐种MEAM1型，扩增出173bp条带时，可判断为隐种MED型，同时以线粒体COI测序结果为对照，证实该方法可用于生产中烟粉虱MEAM1、MED两隐种快速可靠的检测和鉴定。

本发明还提供了含有SEQ ID NO.1-4引物的试剂盒，以及该试剂盒在鉴别烟粉虱MEAM1、MED隐种中的应用。优选的，所述试剂盒包括1.3μl 2.0mmol/L Mg²⁺、0.5μl 10μmol/L4×dNTPs，0.2μl 5U Taq DNA聚合酶，2μl所述引物，2μl模板DNA。

本发明方法适用于大量烟粉虱MEAM1、MED两隐种快速检测，对于农业生产中烟粉虱防治具有重要的实用价值。可应用于田间外来入侵生物烟粉虱MEAM1、MED隐种快速鉴定、分布状况调查，为防治策略的制定提供科学依据。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、简便快速，可靠性高：本发明所设计出的烟粉虱大量样品DNA提取方法，通过适合PCR管的电动研磨器，大大提高研磨效率，省时省力。同时优化了提取步骤，100只烟粉虱样品DNA的单人提取时间可控制在2个小时内，大大提高DNA提取效率。整个过程没有更换PCR管，样品DNA含量稳定(5ng左右)。而构建的双引物PCR扩增体系，可用于烟粉虱生物MEAM1、MED两隐种大量样品的检测鉴定，因此本方法可满足大量样品快速检测的需要。

2、特异性强，灵敏度高：本发明分子PCR检测方法是通过对烟粉虱MEAM1、MED隐种间线粒体COI(mtDNA COI)基因片段序列的进行比对而设计出两对特异引物。已经对来自我国福建省11地理种群50个样本以及外群白粉虱进行鉴定验证，结果证实所设计的两对引物特异性强，灵敏度高，样品DNA含量1pg以上即可检测出。

3、实用性强、费用不高：应用本发明方法对烟粉虱DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物再进行限制性内切酶酶切试验。一般100个样品整个检测过程可在4小时内完成。

4、本发明也可应用于烟粉虱其它分子标记等领域。

附图说明：

图1为24个烟粉虱MEAM1、MED隐种样品DNA提取后，扩增出mtDNA COI基因片段在1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2为本发明所检测的烟粉虱两隐种特异引物PCR扩增图；其中：M为100bp DNAmarker；B为烟粉虱MEAM1隐种；Q烟粉虱MED隐种；

图3为采用系列浓度检测的烟粉虱PCR扩增图；其中1-6分别表示DNA系列浓度每微升分别为10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001ng；

图4为9个烟粉虱MEAM1、MED两隐种混合样品DNA双引物扩增的特异条带。

具体实施方式：

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明技术内容包括烟粉虱MEAM1、MED两隐种的特异引物设计，其序列为:

隐种MEAM1：

上游引物MEAM1₁：5’-CACTATAATTATTGCTGTTCCC-3’，记为SEQ ID NO.1。

下游引物MEAM1₂：5’-ACCTAAGATTAGTGGAAATC-3’，记为SEQ ID NO.2。

隐种MED：

上游引物MED₁：5’-TTAATTAGCAGCGAGGCTGG-3’，记为SEQ ID NO.3。

下游引物MED₂：5’-AGGAACGGCAATAATCATAGTAGC-3’，记为SEQ ID NO.4。

利用双引物体系进行PCR扩增，琼脂糖电泳后特异性地扩增出两个条带时，291bp条带即可判断烟粉虱为MEAM1型，173bp条带可判断烟粉虱为MED型。

实施例1：引物对烟粉虱不同隐种的特异性扩增

材料：为2014年采自福建八个地市不同烟粉虱50份样品，每个样品都以mtDNACOI基因测序结果为对照。

1.单只DNA提取

将单头烟粉虱样品小心置入PCR管底部，利用自制电动研磨器具(自制研磨棒+小型电转)，研磨棒头粘少许DNA提取液(1％SDS，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，25mmol/LNaCl，5mmol/L EDTA)，置于PCR管底部与样品接触，研磨15秒后，每管中加入40ul提取液和2ul蛋白酶K液，混匀备用；将研磨混匀后的样品在58℃下水浴20min，然后加入预冷的无水乙醇80u1，轻轻混匀，-20℃沉淀10min；沉淀后的样品在12000r/min离心3min，弃上清液，自然或通风晾干，加入TE溶液(40ul)，保存备用即可。

2.烟粉虱MEAM1、MED隐种的特异引物检测

PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl 10×PCR反应缓冲液(含2.0mmol/L Mg²⁺、0.5μl 10μmol/L 4×dNTPs，0.2μl 5U Taq DNA聚合酶)，10μmol/L各0.5μl SEQ ID NO.1-4所示的引物和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min。

将3μl PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产物的有无和片段大小判定结果。

3.检测结果

检测的特异性：烟粉虱隐种MEAM1可特异扩增出291bp条带；隐种MED可特异扩增出173bp条带，而白粉虱无特异条带，具有很强的特异性。

实施例2：引物的灵敏性检测

1.DNA浓度稀释：提取的烟粉虱(隐种MED，由中国农科院植保所提供)基因组DNA，经Thermo紫外分光光度计测定浓度后，六个样品采用系列浓度(10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001ng/μl)稀释。

2.检测结果：如图3所示，在20μl反应体系中，六个样品烟粉虱基因组DNA除第6样品无明显扩增目的带外，其余样品均扩增出明显的目的条带，检测灵敏度可达1pg。

实施例3：双引物对烟粉虱两隐种的特异性扩增

1.样品DNA提取

将烟粉虱两隐种混合样品置入离心管底部，利用自制电动研磨器具(自制研磨棒+小型电转)，研磨棒头粘少许DNA提取液(1％SDS，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，25mmol/LNaCl，5mmol/L EDTA)，置于PCR管底部与样品接触，研磨15秒后，每管中加入100ul提取液和5ul蛋白酶液，混匀备用；58℃水浴20min，然后加入预冷的无水乙醇80u1，轻轻混匀，-20℃沉淀10min；12000r/min离心3min，弃上清液，自然或通风晾干，加入TE溶液(100ul)，保存备用即可。

2.烟粉虱MEAM1、MED隐种的双引物检测

双引物PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl 10×PCR反应缓冲液，含2.0mmol/LMg²⁺、0.5μl 10μmol/L 4×dNTPs，0.2μl 5U Taq DNA聚合酶，各0.5μl10μmol/L双引物和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min。

3.检测结果

烟粉虱隐种(MEAM1+MED)混合DNA，都可特异扩增出291bp和173bp条带(见图4)，具有很强的特异性、灵敏度。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种快速鉴定烟粉虱MEAM1、MED隐种的方法，其特征在于，利用快速鉴定烟粉虱MEAM1、MED两隐种的引物对烟粉虱DNA进行PCR扩增，琼脂糖电泳后，特异性地扩增出291bp条带时，判断烟粉虱为MEAM1隐种，能扩增出173bp条带时，判断烟粉虱为MED隐种；

所述快速鉴定烟粉虱MEAM1、MED两隐种的引物包括2对引物对，其中，1对引物对为烟粉虱MEAM1隐种的特异引物，序列为：

上游引物SEQ ID NO.1：5’-CACTATAATTATTGCTGTTCCC-3’；

下游引物SEQ ID NO.2：5’-ACCTAAGATTAGTGGAAATC-3’；

另一对引物对为烟粉虱MED隐种的特异引物，序列为：

上游引物SEQ ID NO.3：5’-TTAATTAGCAGCGAGGCTGG-3’；

下游引物SEQ ID NO.4：5’-AGGAACGGCAATAATCATAGTAGC-3’；

所述PCR扩增体系构建具体包括下列步骤：

(1)样品DNA提取；

(2)PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl 10×PCR反应缓冲液，各0.5μl 10μmol/L所述引物，和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min；

所述样品DNA提取包括如下步骤：

1)将烟粉虱样品置入PCR管底部，研磨棒头粘DNA提取液置于PCR管底部与样品接触后利用电动研磨器研磨均匀后，每管加入40ulDNA提取液和2ul蛋白酶K液，混匀备用；

2)将所述步骤1)得到的样品在58℃下水浴20min，然后加入预冷的无水乙醇80u1，混匀，-20℃下沉淀10min；

3)将所述步骤2)得到的沉淀样品在12000r/min的速度下离心3min，弃上清液，自然或通风晾干，加入20-40ulTE溶液，得到DNA样品。

所述DNA提取液包括1％SDS，10mmol/L Tris-HCl，25mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA。