CN107227367A - 基于its2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法 - Google Patents

基于its2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，包括对药用甘草及其近缘种样品亲缘关系的鉴定。本发明能对甘草属内甘草物种进行鉴定，使得各种甘草物种容易被区分，为甘草药用情况混乱的情况，保证甘草临床用药的有效性和安全性提供了支撑。

Description

基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种药用甘草亲缘关系鉴定方法，特别是一种基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法(基于ITS2序列的药用甘草鉴定方法)。
背景技术
甘草属Glycyrrhiza Linn.全球约20个物种。我国有8个种，分别为甘草(G.uralensis)、光果甘草(G.glabra)，又名洋甘草、胀果甘草(G.inflata)、无腺毛甘草(G.eglandulosa X.Y.Li.)、粗毛甘草(G.aspera Pall.)，以及刺果甘草(G.pallidifloraMaxim.)、云南甘草(G.yunnanensis Cheng f.et L.K.Dai ex P.C.Li)和圆果甘草(G.squamulosaFranch.)。2015版《中华人民共和国药典》中明确指出我国药用甘草为甘草、光果甘草及胀果甘草的干燥根及根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。但是，有些地区将其他一些品种作为甘草收购和使用，如在新疆石河子等地，因为无腺毛甘草根和根茎有甜味，在当地将其作为甘草收购和使用；此外，还有云南甘草、粗毛甘草在当地也有作药用甘草使用的习惯。李学禹也指出民间将刺果甘草作为药用。虽然他同时指出刺果甘草并非商品药材，但甘草作为根茎类药材，属内各物种外形相似，不易区分，故混用现象也屡见不鲜，药用情况混乱，严重影响了临床用药的有效性和安全性。
甘草的临床需求量很大，有“十方九草”之称，除此之外，甘草还作为添加剂用于生活和化工业的多个方面。广泛的用途导致甘草需求量逐年增加，野生甘草资源急剧下降。为了保护甘草资源，国家在提倡人工种植和资源保护的同时，还制定了相关制度进行规范化的管理和控制。然而，申请人在进行甘草资源调查过程中还发现人工种植甘草中存在诸多变异、杂交现象，很难界定它的分类以及明确是否为药用甘草，使甘草用药的安全性和有效性受到了很大质疑。除人工种植外，目前从国外引进甘草也是解决国内甘草市场资源短缺的常用方法，但全球甘草属下物种较多，国外甘草种属是否可以作为我国药用甘草也是我们需要亟待解决的一个问题。
甘草的传统鉴定方法主要有形态学鉴定、显微鉴定和理化鉴定等。但这些方法的检测结果受样品植株生长环境、发育阶段以及各种加工使用情况的影响较大。加之各甘草物种作为根茎类药材，外形相似，不易区分，使得甘草市场存在药用情况混乱的现象，严重影响了临床用药的有效性和安全性。药用甘草如何鉴定是我们需要亟待解决的另一个问题。
因此，现有技术中，甘草属内甘草物种不易区分，使得甘草市场存在药用情况混乱的现象，严重影响了临床用药的有效性和安全性。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法。本发明能对甘草属内药用甘草物种与其近缘种进行区分鉴定，使得药用甘草物种与其近缘种容易被区分，避免了甘草药用情况混乱，确保了甘草临床用药的有效性和安全性。
本发明的技术方案：基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，包括对药用甘草及其近缘种样品亲缘关系的鉴定。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的对药用甘草及其近缘种样品亲缘关系的鉴定；包括DNA提取、PCR扩增、测序和确定甘草亲缘关系。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的DNA提取；是取甘草样本组织，用酒精擦拭表面后晾干，用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取过程中水浴时间为50-70min，将总DNA稀释至8-12ng·μL-1，-22℃--18℃下保存。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的PCR扩增；是以正向引物和反向引物进行扩增反应，得扩增产物；所述的测序；是将扩增产物纯化后，对其进行双向测序。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的正向引物；是ATG CGATAC TTG GTG TGA AT。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的反向引物；是GAC GCTTCT CCA GAC TAC AAT。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的扩增反应；是扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles；72℃10min；扩增反应体系为：2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL，正、反向引物各1.0μL，总DNA3.0μL，加ddH2O至25.0μL。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的正向引物浓度均为2.5μmol·L-1；所述的反向引物浓度均为2.5μmol·L-1。
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述的确定甘草亲缘关系；是根据测序的结果统计其单倍型序列变异位点，然后与下表进行比对，确定亲缘关系；
前述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法中，所述确定亲缘关系；是确定甘草为药用甘草物种，还是其属下非药用近缘物种。
申请人对本发明进行了大量的试验研究，部分如下：
1材料
实验涉及材料收集自我国黑龙江、吉林、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、新疆、云南、四川、河北10个省以及中亚5个国家的共181个甘草样品。实验样本经贵阳中医学院刘育辰副教授鉴定，其中117个样本可分为5个种(甘草G.uralensis、光果甘草G.glabra、胀果甘草G.inflata、刺果甘草G.pallidiflora和云南甘草G.yunnanensis)。另外23个样本表观判定为变异植株，41个样本来自国外，均为甘草属植物，但无法鉴定到种。所有样本均保存在贵阳中医学院。对照药材(甘草和胀果甘草，以‘FDC’为编号)来自中国食品药品检定研究院。共计183个样本。
2方法
2.1 DNA提取
取甘草样本组织约100mg，用体积分数为75％的酒精擦拭表面后晾干，用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech公司，China)提取总DNA，65℃水浴1h，其余步骤按照试剂盒说明进行。Multiskan GO酶标仪(Thermo Scientific公司,USA)初步测定总DNA浓度和OD260/OD280值，将总DNA浓度稀释为10ng·μL-1，-20℃保存备用。
2.2 PCR扩增及测序
扩增所用引物为通用引物，由Sangon Biotech公司合成，引物序列及扩增条件见表1。扩增反应在T100 PCR仪(Bio-Rad公司，USA)上进行。ITS2序列的PCR反应体系为：2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke公司，China)12.5μL，正、反向引物(2.5μmol·L-1)各1.0μL，总DNA(10ng·μL-1)3.0μL，加ddH2O至25.0μL。扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。纯化后，采用3730DNA测序仪(ABI公司，USA)进行双向测序(Sangon Biotech公司，China)。
表1 PCR引物序列及扩增程序
3数据处理
使用CodonCode Aligner软件对序列进行校对拼接，去除引物及低质量区。利用隐马尔可夫模型(HMMer)去除所有ITS2序列两端的5.8S和28S区域。将所获得的ITS2间隔区序列用软件MUSCLE3.6进行序列分析比对，人工统计单倍型信息，建立单倍型数据集，使用MEGA 7.0软件计算序列间的K2P遗传距离，并采用K2P碱基替代模型构建邻接法系统发育树，Bootstrap重复1000次检验节点支持率。
4结果与分析
4.1 DNA提取和PCR扩增
提取的甘草属样本DNA经Multiskan GO酶标仪(Thermo Scientific公司,USA)测定，质量浓度均在10ng·μL-1以上，OD260/OD280值均在1.7-2.0之间。使用ITS2通用引物进行PCR扩增，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，发现所有样品在450bp左右均能显示单一的亮条带，ITS2基因片段扩增成功率为100％。经双向测序均能得到质量较高的ITS2基因片段。
4.2药用甘草的种内和种间序列分析
117个经初步鉴定到种的甘草属植物样本和2个标准药材样本的ITS2序列比对后的长度均为223bp。其中药用甘草103个样本，其种内和种间序列分析如下：
甘草(G.uralensis)(66+1个样)的GC含量为52.9％～53.3％，平均GC含量为53.3％；有1个变异位点，获得2个单倍型；ITS2序列种内K2P距离为0.0000～0.0045，种内平均K2P距离为0.0001。
光果甘草(G.glabra)(21个样)的GC含量为52.9％，平均GC含量为52.9％；单个单倍型；ITS2序列种内K2P距离为0.0000，种内平均K2P距离为0.0000。
胀果甘草(G.inflata)(14+1个样)的GC含量为52.9％，平均GC含量为52.9％；单个单倍型；ITS2序列种内K2P距离为0.0000，种内平均K2P距离为0.0000(同光果甘草)。
药用甘草的种内和种间遗传距离见表2。
表2药用甘草的种内和种间K2P距离
以上结果表明，G.uralensis和G.glabra的种内最大K2P距离(0.0045)和(0.0000)均明显小于其种间最小K2P距离(0.0136)，故ITS2能够有效区分G.uralensis和G.glabra；同理，G.uralensis和G.glabra的种内最大K2P距离(0.0045)和(0.0000)均明显小于其种间最小K2P距离(0.0136)，故ITS2也能够有效区分G.uralensis和G.inflata。但G.glabra和G.inflata的种内和种间K2P距离均为0.0000，说明ITS2无法有效区分G.glabra和G.inflata，陈士林《中国药典中药材DNA条形码标准序列》也显示出ITS2序列这一现象。综上所述，ITS2能有效区分药用甘草基原物种中的G.uralensis和G.glabra，G.uralensis和G.glabra；但不能有效区分G.glabra和G.inflata。
4.3药用甘草与其近缘种的种内和种间序列分析
117个经初步鉴定到种的甘草属植物样本中，药用甘草的近缘物种有2种，其中：
刺果甘草(G.pallidiflora)(3个样本)平均GC含量为53.8％；ITS2序列种内K2P距离0.0000，种内平均K2P距离为0.0000。
云南甘草(G.yunnanensis)(13个样本)的平均GC含量为54.2％；ITS2序列种内K2P距离0.0000，种内平均K2P距离为0.0000。
药用甘草与其近缘种的种内和种间K2P距离可见表3。
表3药用甘草及其近缘种的种内和种间K2P距离
以上结果表明：药用甘草物种G.uralensis和非药用甘草物种G.pallidiflora的种内最大K2P距离(0.0045)和(0.0000)均明显小于其种间最小K2P距离(0.0228)，故ITS2能够有效区分G.uralensis和G.pallidiflora；同理，ITS2也能够有效区分G.uralensis和G.yunnanensis。
药用甘草G.glabra/G.inflate和非药用甘草物种G.pallidiflora的种内K2P距离(0.0000)和(0.0000)均明显小于其种间K2P距离(0.0369)，故ITS2能够有效区分G.glabra/G.inflate和G.pallidiflora；同理，ITS2也能够有效区分G.glabra/G.inflate和G.yunnanensis。
非药用甘草G.pallidiflora和G.yunnanensis的种内K2P距离(0.0000)和(0.0000)均小于其种间K2P距离(0.0045)，故ITS2能够有效区分G.pallidiflora和G.yunnanensis。
以上结果表明，ITS2基因能够较好的将三种药用甘草(G.uralensis、G.glabra和G.inflata)和其近缘物种(G.pallidiflora和G.yunnanensis)区分开。
4.4药用甘草与其近缘种的亲缘关系鉴定
药用甘草及其近缘种的单倍型信息，见表4。
表4药用甘草及其近缘种ITS2序列变异位点信息
基于药用甘草及其近缘种的ITS2序列单倍型数据集构建的NJ树(图1)显示，药用甘草物种G.glabra和G.inflata的单倍型相同，聚为一支，支持率95％，再与G.uralensis的两个单倍型聚为更大一支。非药用甘草G.pallidiflora和G.yunnanensis构成一个单系分支，Bootstrap支持率为98％。
由此可看出，三种药用甘草G.uralensis、G.glabra和G.inflata与非药用甘草G.pallidiflora和G.yunnanensis亲缘关系较远，为这两种非药用甘草不作为药用提供了理论支撑。
4.5国内疑似变异株和国外甘草样本鉴别
对国内变异植株和国外甘草样本的单倍型进行统计，发现其单倍型仅有2种，且与药用甘草共享，即上面统计的单倍型A1和B。
基于药用甘草及其近缘种，以及国内疑似变异株和国外甘草ITS2序列单倍型数据集构建NJ树(图2)。结果显示，国内疑似变异株和国外甘草样本单倍型均能与药用甘草单倍型聚为一支，且与非药用甘草G.pallidiflora和G.yunnanensis的单倍型能有效区分。
有益效果：申请以采集的181个鉴定到种的甘草样本、疑似变异株和国外未鉴定到种的甘草样本为研究对象，通过ITS2序列遗传距离和NJ树分析，证明了ITS2序列可以有效的区分药用甘草和其它2种国内常见甘草属近缘物种；并确定了变异植株和国外未鉴定到种的甘草样本与我国药用甘草的亲缘关系。说明本发明方法不仅可用于我国药用与其近缘种甘草的物种鉴定，解决药用混乱的问题，也可用于未鉴定基原物种的甘草属植物与我国药用甘草的亲缘关系评判。为规范利用国内外甘草原材料，解决我国甘草市场资源短缺的问题，提供了理论依据和技术支持。因此，本发明能对甘草属内各种甘草物种进行鉴定，使得各种甘草物种容易被区分，避免了甘草药用情况混乱，确保了甘草临床用药的有效性和安全性。
附图说明
图1是基于定名甘草物种样本ITS2单倍型数据集构建的邻接(NJ)树(Bootstrap重复1000次)；
图2是基于ITS2序列构建的药用单倍型与变异植株和国外未鉴定甘草的邻接(NJ)树(Bootstrap 1000次重复)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1。
基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法；包括DNA提取、PCR扩增、测序和确定甘草亲缘关系；
所述的DNA提取；是取甘草样本组织，用酒精擦拭表面后晾干，用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取过程中水浴时间为60min，将其稀释至8-12ng·μL-1，-22--18℃保存；
所述的PCR扩增；是以正向引物和反向引物进行扩增反应，得扩增产物；所述的测序；是将扩增产物纯化后，对其进行双向测序；
所述的正向引物；是ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT；浓度为2.5μmol·L-1；
所述的反向引物；是GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT；浓度为2.5μmol·L-1；
所述的扩增反应；是扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles；72℃10min；扩增反应体系为：2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL，正、反向引物各1.0μL，总DNA3.0μL，加ddH2O至25.0μL。
所述的确定甘草亲缘关系：是根据的测序的结果统计其单倍型序列变异位点，然后与下表进行比对，确定亲缘关系；
即：将统计的单倍型序列变异位点与上表中的信息进行比对，如果检测结果显示10bp处为G，16bp为T，17bp为G，18bp为C，55bp为T，79bp为T，82bp为G，121bp为T，214bp为G，符合单倍型(甘草)G.uralensis-A1，则认为样本为甘草(G.uralensis)，鉴定结束；如果检测结果为10bp处为A，其余位点均与(甘草)G.uralensis-A1相同，即序列符合单倍型(甘草)G.uralensis-A2，则样本也认为为甘草(G.uralensis)，鉴定结束；如果检测结果为16bp为C，17bp为A，18bp为A，其余位点均与(甘草)G.uralensis-A1相同，即样本序列符合(光果甘草)G.glabra/(胀果甘草)G.inflate-B，则认为样本为光果甘草(G.glabra)或胀果甘草(G.inflate)，鉴定结束；如果检测结果显示55bp为C，79bp为C，82bp为T，121bp为G，214bp为A，即样本序列符合单倍型(刺果甘草)G.pallidiflora-C，则认为样本为刺果甘草(G.pallidiflora)，鉴定结束；如果检测结果为55bp为C，79bp为C，82bp为T，121bp为G，即样本序列符合单倍型(云南甘草)G.yunnanensis-D，则认为样本为云南甘草)G.yunnanensis，鉴定结束。
实施例2。
基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法；包括DNA提取、PCR扩增、测序和确定甘草亲缘关系；
所述的DNA提取；是取甘草样本组织，用酒精擦拭表面后晾干，用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取过程中水浴时间为70min，将其稀释至12ng·μL-1，-22--18℃保存；
所述的PCR扩增；是以正向引物和反向引物进行扩增反应，得扩增产物；所述的测序；是将扩增产物纯化后，对其进行双向测序，即可；
所述的正向引物；是ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT；浓度为3.0μmol·L-1；
所述的反向引物；是GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT；浓度为3.0μmol·L-1；
所述的扩增反应；是扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles；72℃10min；扩增反应体系为：2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL，正、反向引物各1.0μL，总DNA3.0μL，加ddH2O至25.0μL；
所述的确定甘草亲缘关系：是根据的测序的结果统计其单倍型序列变异位点，然后与下表进行比对，确定亲缘关系；
即：将统计的单倍型序列变异位点与上表中的信息进行比对，如果检测结果显示10bp处为G，16bp为T，17bp为G，18bp为C，55bp为T，79bp为T，82bp为G，121bp为T，214bp为G，符合单倍型(甘草)G.uralensis-A1，则认为样本为甘草(G.uralensis)，鉴定结束；如果检测结果为10bp处为A，其余位点均与(甘草)G.uralensis-A1相同，即序列符合单倍型(甘草)G.uralensis-A2，则样本也认为为甘草(G.uralensis)，鉴定结束；如果检测结果为16bp为C，17bp为A，18bp为A，其余位点均与(甘草)G.uralensis-A1相同，即样本序列符合(光果甘草)G.glabra/(胀果甘草)G.inflate-B，则认为样本为光果甘草(G.glabra)或胀果甘草(G.inflate)，鉴定结束；如果检测结果显示55bp为C，79bp为C，82bp为T，121bp为G，214bp为A，即样本序列符合单倍型(刺果甘草)G.pallidiflora-C，则认为样本为刺果甘草(G.pallidiflora)，鉴定结束；如果检测结果为55bp为C，79bp为C，82bp为T，121bp为G，即样本序列符合单倍型(云南甘草)G.yunnanensis-D，则认为样本为云南甘草)G.yunnanensis，鉴定结束。
实施例3。
基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法；包括DNA提取、PCR扩增、测序和确定甘草亲缘关系；
所述的DNA提取；是取甘草样本组织，用酒精擦拭表面后晾干，用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取过程中水浴时间为50min，将其稀释至8ng·μL-1，-22--18℃保存；
所述的PCR扩增；是以正向引物和反向引物进行扩增反应，得扩增产物；所述的测序；是将扩增产物纯化后，对其进行双向测序，即可；
所述的正向引物；是ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT；浓度为2.0μmol·L-1；
所述的反向引物；是GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT；浓度为2.0μmol·L-1；
所述的扩增反应；是扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles；72℃10min；扩增反应体系为：2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL，正、反向引物各1.0μL，总DNA3.0μL，加ddH2O至25.0μL；
所述的确定甘草亲缘关系：是根据的测序的结果统计其单倍型序列变异位点，然后与下表进行比对，确定亲缘关系；
即：将统计的单倍型序列变异位点与上表中的信息进行比对，如果检测结果显示10bp处为G，16bp为T，17bp为G，18bp为C，55bp为T，79bp为T，82bp为G，121bp为T，214bp为G，符合单倍型(甘草)G.uralensis-A1，则认为样本为甘草(G.uralensis)，鉴定结束；如果检测结果为10bp处为A，其余位点均与(甘草)G.uralensis-A1相同，即序列符合单倍型(甘草)G.uralensis-A2，则样本也认为为甘草(G.uralensis)，鉴定结束；如果检测结果为16bp为C，17bp为A，18bp为A，其余位点均与(甘草)G.uralensis-A1相同，即样本序列符合(光果甘草)G.glabra/(胀果甘草)G.inflate-B，则认为样本为光果甘草(G.glabra)或胀果甘草(G.inflate)，鉴定结束；如果检测结果显示55bp为C，79bp为C，82bp为T，121bp为G，214bp为A，即样本序列符合单倍型(刺果甘草)G.pallidiflora-C，则认为样本为刺果甘草(G.pallidiflora)，鉴定结束；如果检测结果为55bp为C，79bp为C，82bp为T，121bp为G，即样本序列符合单倍型(云南甘草)G.yunnanensis-D，则认为样本为云南甘草)G.yunnanensis，鉴定结束。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵阳中医学院
<120> 基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacgcttctc cagactacaa t 21

Claims (9)

1.基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：包括对药用甘草及其近缘种样品亲缘关系的鉴定。
2.如权利要求1所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的对药用甘草及其近缘种样品亲缘关系的鉴定；包括DNA提取、PCR扩增、测序和确定甘草亲缘关系。
3.如权利要求2所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的DNA提取；是取甘草样本组织，用酒精擦拭表面后晾干，用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取过程中水浴时间为50-70min，将总DNA稀释至8-12ng·μL-1，-22℃--18℃下保存。
4.如权利要求2所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的PCR扩增；是以正向引物和反向引物进行扩增反应，得扩增产物；所述的测序；是将扩增产物纯化后，对其进行双向测序。
5.如权利要求4所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的正向引物；是ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT。
6.如权利要求4所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的反向引物；是GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT。
7.如权利要求4所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的扩增反应；是扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles；72℃10min；扩增反应体系为：2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL，正、反向引物各1.0μL，总DNA3.0μL，加ddH2O至25.0μL。
8.如权利要求4所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的正向引物浓度均为2.5μmol·L-1；所述的反向引物浓度均为2.5μmol·L-1。
9.如权利要求4所述的ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定方法，其特征在于：所述的确定甘草亲缘关系；是根据测序的结果统计其单倍型序列变异位点，然后与下表进行比对，确定亲缘关系；
。
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