CN101731286B - 一种合欢提取液及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种合欢提取液及其应用，是以合欢为原料，通过以下方法制得：将合欢叶片粉碎，然后在磷酸盐缓冲液中浸提，离心，得合欢粗提液；在合欢粗提液中加入固体硫酸铵，两次盐析，透析除盐，即得合欢提取液。将本发明的合欢提取液应用于烟草具有以下优点：(1)本发明的合欢提取液属于天然植物提取液，基本对人畜和环境无害，具有高效、低毒、无残留的特点。(2)合欢提取液对烟草花叶病毒(TMV)有较强的抗病毒活性，对TMV的抑制效率达到90％以上。(3)合欢提取液可有效用于烟草育苗阶段、移栽期、团颗期及旺长期的烟草花叶病毒病的预防与控制。(4)本发明制备方法简单、成本低，易于进行规模化生产，具有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物病害防治领域，提供一种烟草普通花叶病毒病(Tobaccomosaic virus，TMV)的防治技术方法，具体涉及一种合欢提取液的制备及该提取液在烟草病害防治上的应用。
背景技术
植物病毒病害给农业生产带来相当大的危害，几乎每种农作物都受到2-3种主要病毒病的危害。植物病毒对寄主细胞绝对寄生，植物一旦被感染就处于终生受害的状态，使得其防治较为困难，常给农业生产造成严重损失。
据报道，2006年我国烟草病毒病发生面积240.63万亩，造成产量损失2810.72万公斤，产值损失25161.85万元，占烟草病虫害总损失的37.7％(刘国顺等.中国烟草生产实用技术指南，2007，228)。目前我国已经发现的烟草病毒病有17种，主要有烟草普通花叶病毒病(TMV)、黄瓜花叶病毒病(CMV)、马铃薯Y病毒病(PYV)、烟草蚀纹病毒病(TEV)、马铃薯X病毒病(PXV)、烟草环斑病毒病(TRV)、烟草曲叶病毒病(TLCV)等。其中以TMV、CMV、PVY的危害较为严重(杨德廉等.中国烟草科学，2001，1：46-48)。TMV的寄主十分广泛，据目前统计可以侵染38个科、268种植物。受TMV侵染的烟草通常营养代谢会受到严重影响，叶片不均匀地褪绿、枯黄，光合速率下降，使植株生长矮小，干物质积累减少，不仅严重影响烟叶产量，而且对烟叶的外观质量和内在成分影响较大，降低了烟叶的可利用性，已成为烟草生产的重大障碍因素(杨松等.浙江农业科学，2005，5：409-410.)。
目前烟草病毒病的防治主要是利用化学药剂、抗性品种等技术措施。但存在化学药剂药效不佳、易对烟叶产生药害及带来环境污染、有效抗病品种少且易出现抗性缺失等问题；且烟草病毒弱毒疫苗、卫星RNA、抗病毒基因工程等在烟草上的应用尚存在争议，其抗病毒效果亦有待进一步验证。近年来越来越多的研究表明，从植物中分离抗病毒活性物质能在一定程度上抑制植物病毒的侵染和增殖，较现有植物病毒防治措施有较多优点，因而逐渐被人们所重视。目前美洲商陆(Phytolacca americana)PAPs是研究最多的广谱性抗植物病毒蛋白质，据Chen Z C等(Chen Z C et a1.Plant Patho1ogy.1991，40：612-620)研究报道，自商陆叶片中纯化的PAP能够抗5种RNA植物病毒，除了TMV、黄瓜花叶病(CMV)、苜蓿花叶病毒(AlMV)外，还对马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)具有抑制活性。在紫茉莉上存在一种属于RIP(ribosomeinactivating proteins)类的抗病毒蛋白质-MAP(Momordica anti-HIVprotein)，对靠机械传播的植物病毒如TMV、PVY、黄瓜绿斑驳病毒(CGMMV)和苜蓿花叶病毒(AlMV)有极高的抗性(Kubo S et al.Ann PhytoPath Soc Japan.1990，56：481-487)，用0.8μg/ml的MAP处理烟叶后24小时再接种TMV，几乎可完全抑制接种烟叶表面TMV的侵染。Sribash Roy(Sribash R et al.Phytochemistry，2006，67：1865-1873.)从三色苋(Amaranthus tricolor)中分离得到一种分子量为27KD蛋白，该蛋白具有RNase活性，对烟草环斑病毒(TSRV)有极高的抗性。鸡冠花(Cetosia cristata)(Balasubrahmanyama A etal.Plant Science，2000，154：13-21.)和落葵(Basella rubra L.)(BolognesiA et al.Planta.2003，4：422-429)等植物上也发现有抗植物病毒蛋白质。
我国地域辽阔、植物资源丰富，现有研究发现部分植物中含有多种抗病毒活性物质，如何充分利用丰富的植物资源、筛选获得抗病毒活性物质，进一步研究开发出高效、低毒、高选择性的植物抗病毒制剂具有重要的应用价值和研究意义。合欢(Albizzia julibrissin)为多年生豆科木本植物，是我国原产树种，耐寒、耐热、耐旱，生长迅速，是一种优良的绿化树种，在我国广泛分布。人们对合欢在医药、保健方面研究较多，比如合欢具有安神解郁、活血止痛、开胃利气的功效，但在植物病害防治尤其是烟叶病害防治发明却没有报道。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术的状况而专门研制的一种合欢提取液及其应用，将本发明的合欢提取液应用于烟草，对烟草花叶病毒的抑制率可达到90％以上，为防治烟草花叶病毒病提供了一种有效的方法，本发明对人类和环境无公害、无污染，具有高效、低毒、无残留的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的合欢提取液通过以下方法制的：将合欢叶片粉碎，然后在磷酸盐缓冲液中浸提，接着离心，得合欢粗提液；在合欢粗提液中加入固体硫酸铵，两次盐析，透析除盐，即得合欢提取液。
其具体步骤如下：
(1)将粉碎的合欢叶片，按照重量体积比为1∶2-5的比例与磷酸盐缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液为50-200mmol/L，pH6.5-7.5；振荡混匀后在2-6℃浸提8-12h，再在4℃条件下离心，弃沉淀，收集上清液，得到合欢粗提液；
(2)向步骤(1)所得的合欢粗提液中加入固体硫酸铵，达到40％饱和度，静置1-3h，然后在4℃条件下离心，弃沉淀，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得的上清液中加入固体硫酸铵，达到80％饱和度，静置1-3h，然后在4℃条件下离心，弃上清液，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解后装入透析袋中，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析12h-24h，即得合欢提取液。
所述磷酸盐缓冲液配方：61ml 0.02mol/L磷酸氢二钠+31ml 0.02mol/L磷酸二氢钠+0.85％固体氯化钠。
本发明的合欢提取液在防治烟草花叶病上的应用：将合欢提取液以1∶10-40的比例稀释后，喷施在烟草叶片上，可有效防治烟草花叶病毒病。
本发明与现有烟草花叶病毒病的防治方法相比，其优点为：(1)本发明的合欢提取液属于天然植物提取液，基本对人畜和环境无害，具有高效、低毒、无残留的特点。(2)合欢提取液对TMV有较强的抗病毒活性，对TMV的抑制效率达到90％以上。(3)本发明提供的合欢提取液可有效用于烟草育苗阶段、移栽期、团颗期及旺长期的烟草花叶病毒病的预防与控制。(4)本发明制备方法简单、成本低，易于进行规模化生产，具有较大的应用价值。
附图说明
附图为本发明的制备方法工艺流程图。
具体实施方式
本发明以下将结合实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
制备实施例1：合欢提取液的制备方式1
(1)将合欢叶片粉碎后，按照重量体积比为10g/20ml的比例与磷酸盐缓冲液混合，振荡混匀后在3℃浸提12h，再在4℃/10000g条件下离心25min，弃沉淀，收集上清液，得到合欢粗提液。所述磷酸盐缓冲液(配方：61ml 0.02mol/L磷酸氢二钠+31ml 0.02mol/L磷酸二氢钠+0.85％固体氯化钠)为150mmol/L，PH7.0；
(2)向步骤(1)所得的合欢粗提液中加入固体硫酸铵，达到40％饱和度，静置3h，然后在4℃、10000g条件下离心15min，弃沉淀，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得的上清液中加入固体硫酸铵，达到80％饱和度，静置2h，然后在4℃、10000g条件下离心15min，弃上清液，将沉淀用磷酸盐缓冲液(与步骤1中所用相同)溶解后装入透析袋中，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析12h，即得合欢提取液。
制备实施例2：合欢提取液的制备方式2
(1)将合欢叶片粉碎后，按照重量体积比为10g/20ml的比例与磷酸盐缓冲液混合，振荡混匀后在6℃浸提8h，再在4℃/10000g条件下离心15min，弃沉淀，收集上清液，得到合欢粗提液。所述磷酸盐缓冲液为150mmol/L，PH7.0；
(2)向步骤(1)所得的合欢粗提液中加入固体硫酸铵，达到40％饱和度，静置1h，然后在4℃、10000g条件下离心25min，弃沉淀，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得的上清液中加入固体硫酸铵，达到80％饱和度，静置2h，然后在4℃、10000g条件下离心20min，弃上清液，将沉淀用磷酸盐缓冲液(与步骤1中所用相同)溶解后装入透析袋中，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析24h，即得合欢提取液。
应用实施例1 合欢提取液抗烟草花叶病毒活性试验1
将合欢提取液对5-6片真叶期的心叶烟进行整株喷雾，每株3-4片叶，重复三次；同时用清水喷施5-6片真叶期的心叶烟作为对照，每株3-4片叶，重复三次。半小时后在心叶烟上喷洒金刚砂(500目)，将10μg/ml TMV病毒液摩擦接种在心叶烟上，每片叶50μl，接种后于光照培养箱中培养，培养条件为光照16h/d，湿度70％。待出现明显枯斑且数目稳定后，调查枯斑数，按下式计算合欢提取液对TMV的抑制效果。
抑制效果(％)＝(对照的枯斑数-处理的枯斑数)/对照的枯斑数×100。
结果表明：本例所使用的合欢提取液对TMV的抑制率达到97.47％。
表1合欢提取液抗烟草花叶病毒实验结果作用
| 重复一 | 重复二 | 重复三 | 平均值 | |
| 平均枯斑个数 | 平均枯斑个数 | 平均枯斑个数 | 平均枯斑个数 | |
| 处理 | 1 | 1.5 | 2.5 | 1.67 |
| 对照 | 64.5 | 74 | 71.5 | 70 |
| 抑制率(％) | 98.45％ | 97.31％ | 96.5％ | 97.47％ |
实施例4合欢提取液抗烟草花叶病毒活性试验2
将合欢提取液稀释10倍、40倍后，按照实例3中的方法进行活性检测，每株3-4片叶，重复三次。
表2 不同浓度合欢提取液抗烟草花叶病毒实验结果作用
结果表明：本例所使用的稀释10倍、40倍合欢提取液对TMV的抑制率分别达到83.5％、69.3％。
Claims (2)
1.一种合欢提取物，其特征在于：以合欢为原料，通过以下方法制得：将合欢叶片粉碎，然后在磷酸盐缓冲液中浸提，离心，得合欢粗提液；在合欢粗提液中加入固体硫酸铵，两次盐析，透析除盐，即得合欢提取物，具体步骤如下：
(1)将粉碎的合欢叶片，按照重量体积比为1∶2-5的比例与磷酸盐缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液为50-200mmol/L，pH6.5-7.5；振荡混匀后在2-6℃浸提8-12h，再在4℃条件下离心，弃沉淀，收集上清液，得到合欢粗提液；
(2)向步骤(1)所得的合欢粗提液中加入固体硫酸铵，达到40％饱和度，静置1-3h，然后在4℃条件下离心，弃沉淀，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得的上清液中加入固体硫酸铵，达到80％饱和度，静置1-3h，然后在4℃条件下离心，弃上清液，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解后装入透析袋中，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析12h-24h，即得合欢提取物。
2.一种如权利要求1所述的合欢提取液在防治烟草花叶病上的应用，将合欢提取液以1∶10-40的比例稀释后，喷施在烟草叶片上。
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