CN114902959B - 一种甘松根组织的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及本发明涉及植物组织培养方法，具体为一种甘松根组织的培养方法，步骤包括：(1)诱导愈伤组织：将甘松叶柄及叶片外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，得到甘松的愈伤组织；(2)诱导不定根：甘松的愈伤组织切割后接种到根诱导培养基中，诱导产生不定根；(3)甘松根组织液体培养：步骤(2)诱导得到的不定根在液体培养基中培养；(4)甘松根的增值：步骤(3)培养的根组织接种到增值培养液中培养增值。本方法可以在短时间内获取大量含有活性物质成分的甘松根组织，而且培养方法安全无毒、生产周期短、操作简单、成本低，既能够充分利用甘松资源，又避免了采集珍稀野生植物所造成的植物资源和环境破坏。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养方法，具体为一种甘松根组织的培养方法。
背景技术
甘松(Nardostachys jatamansi DC.)是败酱科(Valerianaceae)甘松属(Nardostachys)多年生草本植物，生长在海拔2500-5000米的高山草地、灌丛或石砾地上，分布于甘肃，青海，四川，西藏以及云南等地区，印度、尼泊尔、不丹也有分布，是喜马拉雅典型植物。甘松不仅是西藏著名的香料植物，也是中药、藏药和印度草药的重要的药源植物。以其根及根茎入药，其性温，味辛、甘，其化学成分有萜类、黄酮类、多糖类、多酚类、木质素以及挥发油等，具有理气止痛、开郁醒脾的功能，用于脘腹胀痛、呕吐、食欲不振的治疗，外治牙痛、脚痛。国内外研究报道甘松具有降压、镇静、抗抑郁、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗心血管损伤及对人神经母细胞瘤细胞损伤的保护等作用。甘松属植物主要用根茎或种子繁殖，大多为野生，印度和中国偶有栽培。甘松由于具有很大的药用价值及芳香价值，人们过度开发使其资源受到了严重的破坏，已被列入世界濒危植物名录。
甘松主要药用位置为根部，目前国内外对甘松的化学成分、药理作用及质量标准等研究比较多，但暂未看到有关甘松植物根组织培养的研究报道。如果能采用组织培养的方法快速获得大量甘松根组织，就可以减少对于甘松植物资源的破坏。
本方法先使用甘松(Nardostachys jatamansi DC.)植物叶片及叶柄作为外植体诱导愈伤组织，然后在愈伤组织基础上诱导出不定根，最后使不定根在液体培养基中悬浮培养及继代增值，获得含有活性成分高的根组织。该方法能在短时间内能获得大量含有活性物的甘松根组织，具有安全无毒，周期短，繁殖快，操作简单及成本低的特点，克服了由于地理环境、气候、土壤等生长条件不同造成的植物化学成分差异大而直接影响药材质量的缺点。另一方面也保护珍稀野生植物资源免遭破坏，促进资源的合理利用和可持续发展。
发明内容
本发明旨在提供一种甘松根组织的培养方法。
技术方案如下，一种甘松根组织的培养方法，包括以下步骤：
(1)诱导愈伤组织：将甘松叶柄及叶片外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，得到甘松的愈伤组织；
培养条件为：温度15-25℃，湿度50％-80％，光照强度为1200Lx-2500Lx，每天光照10-16小时，培养15-25天。
所述的愈伤组织诱导培养基为含有NAA(萘乙酸)、6-BA(6-苄氨基嘌呤)和蔗糖的MS培养基。
优选的，所述的愈伤组织诱导培养基含有0.3-0.8mg/L NAA、0.8-1.5mg/L 6-BA和25-35g/L蔗糖。在优选的技术方案中，所述的愈伤组织诱导培养基含有0.5mg/L NAA、1.0mg/L 6-BA和30g/L蔗糖。
所述的愈伤组织诱导培养基还含有5-10g/L琼脂；优选的，琼脂含量为6-8g/L，在优选的技术方案中，琼脂含量为7g/L。
优选的，步骤(1)培养条件为：温度18-24℃，湿度60％-70％，光照强度为1500Lx～2000Lx，每天光照10-14小时条件，培养18-24天。
(2)诱导不定根：甘松的愈伤组织切割后接种到根诱导培养基中，培养条件为：温度15-25℃，湿度50％-80％，光照强度为1200Lx～2500Lx，每天光照10-16小时，培养24-32天；
优选的，步骤(2)培养条件为：在温度18-24℃，湿度60％-70％，光照强度为1500Lx～2000Lx，每天光照10-14小时条件，培养25-30天。
所述的根诱导培养基为含有蔗糖的WPM培养基，且含有NAA和IBA(吲哚丁酸)中的至少一种；蔗糖含量为25-35g/L；更优选的，蔗糖含量为30g/L；
优选的，所述的根诱导培养基含有0.2-8.0mg/L NAA，或者含有1.0-8.0mg/L IBA，或者含有0.2-0.4mg/L NAA和0.1-0.2mg/L IBA；
在优选的技术方案中，所述的根诱导培养基含有0.3-7.0mg/L NAA，或者含有1.0-7.0mg/L IBA，或者含有0.3mg/L NAA和0.1-0.2mg/L IBA；1.0-8.0mg/L IBA，或者含有0.3mg/L NAA和0.1mg/L IBA；更进一步的，所述的根诱导培养基含有0.3-1.0mg/L或4.0-7.0mg/L NAA，或者含有1.0或7.0mg/L IBA，或者含有0.3mg/L NAA和0.1mg/L IBA。
所述的根诱导培养基还含有5-10g/L琼脂；优选的，琼脂含量为6-8g/L，在优选的技术方案中，琼脂含量为7g/L。
(3)甘松根组织液体培养：步骤(2)诱导得到的根在液体培养基中培养；
培养条件为：温度20-28℃，转速100-150rpm，培养12-18天。
优选的，步骤(3)培养条件为：温度23-28℃，转速100-120rpm，培养14-16天。
所述的液体培养基为含有蔗糖和IBA的WPM或B5培养基；
优选的，液体培养基中蔗糖含量为20-30g/L，IBA的含量为0.5-1.5mg/L。更优选的，IBA的含量为1.0mg/L。
接种量20-50g/L；优选的接种量为30-40g/L。
(4)甘松根的增值：步骤(3)培养的根组织接种到增值培养基中；
培养条件为：温度20-28℃，转速100-150rpm，培养30-42天。
优选的，步骤(4)培养条件为：在温度23-28℃，转速100-120rpm条件下培养32-38天。
所述的增值培养基为含有蔗糖的WPM或B5培养基，且含有IBA；蔗糖的含量为30-40g/L。优选的，增值培养基为液体培养基。
优选的，增值培养基中IBA的含量为1.0mg/L。
更优选的，增值培养基为含有40g/L蔗糖和1.0mg/L IBA的WPM培养基或者含有30g/L蔗糖和1.0mg/L IBA的B5培养基。
优选的，步骤(1)中，甘松叶柄及叶片外植体长度为0.5-0.8cm。
步骤(1)-(4)中的培养基，pH为5.7-6.0，优选为5.8。
步骤(1)-(4)均在无菌条件下进行。
在本发明的优选实施例中，步骤(1)的诱导培养基为含有0.5mg/L NAA、1.0mg/L6-BA和30g/L蔗糖的MS培养基。
步骤(1)的培养条件为：温度20±1℃，湿度60％-70％，光照强度为1500Lx-2000Lx，每天光照12小时，培养20天。
步骤(2)所述的根诱导培养基为含有30g/L蔗糖的WPM培养基；并且含有0.3-7.0mg/L NAA，或者含有1.0-7.0mg/L IBA，或者含有0.3mg/L NAA和0.1-0.2mg/L IBA；更优选的，含有2.0-7.0mg/L IBA，或者含有0.3mg/L NAA和0.1mg/L IBA。
步骤(2)培养条件为：温度20±1℃，湿度60％-70％，光照强度为1500Lx-2000Lx，每天光照12小时，培养28天。
步骤(3)所述的液体培养基为含有20g/L蔗糖和1.0mg/L IBA的WPM培养基，或者含有30g/L蔗糖和1.0mg/L IBA的B5培养基。
步骤(3)培养条件为：温度25℃、转速110rpm条件下培养15天。
步骤(4)所述的增值培养基为含有40g/L蔗糖和1.0mg/L IBA的WPM培养基，或者含有30g/L蔗糖和1.0mg/L IBA的B5培养基。
步骤(4)培养条件为：温度25℃、转速110rpm条件下培养35天。
通过本方法所获得的甘松根组织，含有大量活性成分，总多酚含量高。
本方法先使用甘松(Nardostachys jatamansi DC.)植物的叶片及叶柄作为外植体诱导愈伤组织，然后在愈伤组织基础上诱导出不定根，最后使不定根在液体培养基中悬浮培养及继代增值，获得含有活性成分高的根组织。通过上述方法可以在短时间内获取大量含有活性物质成分的甘松根组织，且所获得的甘松根组织中活性成分含量高，总多酚含量超过1.2％，甚至可以达到1.5％以上。而且培养方法安全无毒、生产周期短、操作简单、成本低，既能够充分利用甘松资源，又避免了采集珍稀野生植物所造成的植物资源和环境破坏，使得资源获得合理利用及可持续发展。
同时，组织培养方法所获得的甘松根质量稳定，克服了由于地理环境、气候、土壤等生长条件不同造成的植物化学成分差异大、各批次活性成分含量不稳定而直接影响药材质量的缺点。
附图说明
为了更好的理解本发明的实质，下面将结合附图来说明本发明方案和效果。
图1为实施例2诱导不定根时初期阶段分化出的根组织；
图2为实施例2诱导不定根，生长28天后的根组织生长情况；
图3为图2的A部分的局部放大图；
图4为实施例3甘松根组织在液体培养基培养15天后的状态；
图5为实施例4甘松根在增值35天后的状态。
具体实施方式
本发明提供了一种甘松根组织的培养方法，应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本实验用到的试剂包括MS培养基、WPM培养基、B5培养基、植物生长调节剂6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)均采购于美国PhytoTechnologyLaboratories公司，蔗糖及琼脂采购于国药集团。
表1-表3为MS培养基、WPM培养基、B5培养基的成分：
表1 MS培养基的组成
表2 B5培养基的组成
| 组分 | 含量(mg/L) | 组分 | 含量(mg/L) |
| KNO3 | 2500 | Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| 无水MnSO4 | 122.09 | CoCl2·6H2O | 0.025 |
| NAH2PO4 | 150 | CuSO4·5H2O | 0.025 |
| 无水CaCl2 | 113.24 | Na2-EDTA·2H2O | 37.26 |
| (NH4)2SO4 | 134 | FeSO4·7H2O | 27.8 |
| KI | 0.75 | 肌醇 | 100 |
| H3BO3 | 3.0 | 烟酸 | 1.0 |
| MnSO4·H2O | 10 | 盐酸吡哆醇(维生素B6) | 1.0 |
| ZnSO4·7H2O | 2.0 | 盐酸硫胺素(维生素B1) | 10 |
表3 WPM培养基的组成
实施例1愈伤组织的诱导
在超净台中，用无菌解剖刀，将消毒好的甘松叶柄及叶片切割成0.5-0.8cm长的外植体，接种到MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L的诱导培养基(pH＝5.8)中，培养条件为温度20±1℃，湿度60％-70％，光照强度为1500Lx-2000Lx，每天光照12小时。培养20天后，得到甘松的愈伤组织。
实施例2不定根的诱导
在无菌条件下，取上述诱导的生长良好形态均一的愈伤组织，切割成小块，分别接种到含有MS、WPM、B5的基础培养基中，每种培养基配方添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，以及不同浓度的植物生长调节剂NAA，IBA或6-BA中的一种或两种，调节pH＝5.8，每种培养基配方接种50份愈伤组织，在温度20±1℃，湿度60％-70％，光照强度为1500Lx-2000Lx，每天光照12小时的条件下，培养28天，观察每份愈伤组织生根的情况，并计算其诱导率，诱导率＝(生根的愈伤组织总数/接种的愈伤组织总数)*100％
结果如下表4所示：
表4不同的培养基对愈伤组织诱导分化成根的情况
由表4结果可知，WPM+NAA及WPM+IBA，WPM+NAA+IBA这个几个组合比较适合甘松根的诱导，即甘松根诱导培养基为：
WPM+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+NAA 0.3mg/L-7.0mg/L，或
WPM+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+IBA 1.0mg/L-7.0mg/L，或
WPM+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+NAA0.3mg/L+IBA 0.1mg/L。
以WPM+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+NAA0.3mg/L培养基进行诱导，初期阶段刚分化出的根组织如图1所示，生长28天后如图2和图3所示。图2为根组织生长情况，图3为图2的局部放大图，显示根组织的生长状态。
实施例3甘松根在液体培养基中的生长
在无菌条件下，从实施例2诱导分化的根中取出1.0g，放入到含有30mL培养液中，每种培养液含有WPM或B5培养基，在培养基中添加10-40g/L的蔗糖及植物生长调节剂IBA，调节pH＝5.8，在转速110r/min，温度25℃的摇床中培养15天，并选出适合甘松根培养的液体培养基。培养基如下表5：
表5.根在不同配方的液体培养基中的生长情况
由表5的结果可知，低浓度的IBA比较适合在根在液体培养基的生长，为了使根在下一步骤的液体培养基中更多地增值，故选择能使根分叉较多且生长良好的培养基配方：WPM+IBA1.0mg/L+蔗糖20g/L及B5+IBA1.0mg/L+蔗糖30g/L。
采用B5+IBA1.0mg/L+蔗糖30g/L培养基，根在液体培养基培养后的状态如图4。
实施例4甘松根在增值培养基中的增值
在无菌条件下，从实施例3诱导分化的根中取出生长良好的2.0g，放入到含有40mL培养液培养，即按照50g/L的量接种到培养瓶中，每种培养液含有WPM或B5培养基，20-30g/L的蔗糖以及不同浓度的植物生长调节剂IBA，调节pH＝5.8，在转速110r/min，温度25℃的摇床中培养，35天后收获，称量其湿重，计算增值倍数并选出适合甘松根增值的液体培养基。结果如下表6：
增值倍数＝增值的重量/原来接种的重量
表6在不同配方的增值培养基中的增值情况
由表6的结果可知，较适合甘松根增值的液体培养基配方为WPM+IBA 1.0mg/mL+蔗糖40g/L和B5+IBA 1.0mg/mL+蔗糖30g/L，在培养35天内，其增值倍数分可分别达到3.1和3.7。
图5为采用WPM+IBA 1.0mg/mL+蔗糖40g/L的培养基，第35天时甘松根的增值状况。
实施例5甘松根的提取及活性物检测
提取方法：称取上述培养的湿重50g的甘松根组织放入烧杯中，按照料液比1:10加入纯水500mL，用破壁机破碎组织后，500W超声提取30min。然后离心机10000r/min离心40min，再利用0.45μm水相滤膜过滤，取滤液，冻干成粉末。:
显色法测定多酚：
标准曲线：没食子酸0.33mg/mL溶液，依次稀释成0、0.0052、0.0103、0.0206、0.0413、0.0825、0.1650、0.3300mg/mL浓度梯度。用甘松根的冻干粉末溶于水，制成浓度为5mg/ml的溶液，取100μL样品，加入500μL 10％Folin-Ciocalteu试剂，充分混合，放置5min(不要超过8min)，再加入400μL7.5％Na2CO3，充分混合，室温60min，最后取100μL在酶标仪上测765nm OD值。根据标准曲线计算甘松根组织总多酚的百分含量，如表7所示。
表7甘松根组织总多酚含量
Claims (7)
1.甘松根组织的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 诱导愈伤组织：将甘松叶柄及叶片外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，得到甘松的愈伤组织；培养条件为：温度15-25℃，湿度50%-80%，光照强度为1200 Lx - 2500 Lx，每天光照10-14小时，培养15-25天；
所述的愈伤组织诱导培养基为含有0.3-0.8 mg/L NAA、0.8-1.5 mg/L 6-BA和25-35g/L 蔗糖的MS培养基；
（2）诱导不定根：甘松的愈伤组织切割后接种到根诱导培养基中，诱导产生不定根；培养条件为：温度15-25℃，湿度50%-70%，光照强度为1200 Lx ~ 2500Lx，每天光照10-14小时，培养24-32天；
所述的根诱导培养基为含有25-35 g/L蔗糖的WPM培养基，且含有0.2-8.0 mg/L NAA，或者1.0-8.0 mg/L IBA，或者 0.2-0.4 mg/L NAA +0.1-0.2 mg/L IBA；
（3） 甘松根组织液体培养：步骤（2）诱导得到的不定根在液体培养基中培养；
培养条件为：温度20-28℃，转速100-150rpm，培养12-18天；
所述的液体培养基为含有20-30 g/L蔗糖、0.5-1.5 mg/L IBA的WPM或B5培养基；
（4） 甘松根的增殖：步骤（3）培养的根组织接种到增殖培养液中培养增殖；
培养条件为：温度20-28℃，转速100-150rpm，培养30-42天；
所述的增殖培养液为含有30-40 g/L蔗糖和1.0 mg/L IBA的WPM或B5培养基。
2.权利要求1所述甘松根组织的培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的根诱导培养基含有0.3-1.0 mg/L NAA，或者4.0-7.0 mg/L NAA，或者1.0 mg/L IBA，或者7.0 mg/L IBA，或者0.3 mg/L NAA +0.1 mg/L IBA。
3.权利要求1所述甘松根组织的培养方法，其特征在于，步骤（3）所述的液体培养基中IBA的含量为1.0 mg/L。
4. 权利要求1所述甘松根组织的培养方法，其特征在于，步骤（4）所述的增殖培养液为含有40 g/L 蔗糖+1.0 mg/L IBA的WPM培养基或者含有30 g/L 蔗糖+1.0 mg/L IBA的B5培养基。
5.权利要求1所述甘松根组织的培养方法，其特征在于，步骤（1）-（4）中的培养基或培养液pH为5.7-6.0。
6.权利要求1所述甘松根组织的培养方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养基和根诱导培养基的培养基含有5-10 g/L琼脂。
7.权利要求1所述甘松根组织的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的愈伤组织诱导培养基含有0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA和30 g/L 蔗糖。
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