CN107349349A - 一种异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂,属于禽用中药制剂技术领域。其由中药成分与菌液混合经异步发酵制成,所述菌液为枯草芽孢杆菌菌液与嗜酸乳杆菌菌液。中药组分为生石膏60~100份、水牛角10~20份、生地黄9~15份、玄参10~20份、白茅根10~20份、知母10~20份、黄连8~12份、莲子心8~12份、栀子8~12份、丹皮8~12份、赤芍8~12份、连翘8~12份、桔梗8~12份、金银花10~20份、野菊花6~10份、淡竹叶3~8份、甘草6~10份。本发明的中药组分结构合理、比例适当,在嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌的作用下,提高了原有药物的药效,使用该药物可以提高家禽的抗病毒能力。
Description
技术领域
本发明属于禽用中药制剂技术领域,具体涉及一种异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂、其制备方法和应用。
背景技术
伴随着养禽业的快速发展,家禽的饲养场集约化程度愈来愈高,外来品种的引进、商品活禽及其产品的销售运输范围大幅扩展,使得病毒传播变得越来越复杂。由于病毒病对养殖业造成的巨大伤害,防治越来越受到养殖业的重视,也给防治工作人员,提出了更高、更新的要求。目前我们主要采取的措施是以预防为主,控制病毒的传入并加强有效的免疫接种来预防感染。平时加强对禽舍的卫生及饲养管理,保障家禽健康的生长,增强鸡群自身的抵抗力也是减少疾病传播的有效手段。我国传统的动物医学一直同畜禽类疾病进行着长期的斗争,具有独特的理论基础以及防治技术。国内运用中草药作为免疫增强剂,预防并抑制畜禽类病毒的研究已成为一个热点。
现代微生物发酵多为纯种发酵,即用纯的单一菌落进行的发酵过程。纯培养技术使得研究者摆脱了面对多种微生物共存的复杂局面,能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究,从而丰富了人们对微生物形态结构、生理生化和遗传特性的认识。但是,在长期的实验和生产实践中,人们不断地发现很多重要生化过程仅靠单株微生物不能完成或只能微弱地进行,必须依靠两种或多种微生物共同培养来完成,即混菌培养或称为混菌发酵。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种天然安全的中药制剂以及制备该制剂的方法,同时,提供一种含有该异步发酵法制备的中药制剂的具有提高家禽抗病毒能力和免疫力的饲料。
为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案予以实现:
一种禽用抗病毒中药组合物,是由以下组分按重量份数制备而成:生石膏60~100份、水牛角10~20份、生地黄9~15份、玄参10~20份、白茅根10~20份、知母10~20份、黄连8~12份、莲子心8~12份、栀子8~12份、丹皮8~12份、赤芍8~12份、连翘8~12份、桔梗8~12份、金银花10~20份、野菊花6~10份、淡竹叶3~8份、甘草6~10份。
在上述方案的基础上,所述禽用抗病毒中药组合物,是由以下组分按重量份数制备而成:生石膏80份、水牛角15份、生地黄12份、玄参15份、白茅根15份、知母15份、黄连10份、莲子心10份、栀子10份、丹皮10份、赤芍10份、连翘10份、桔梗10份、金银花15份、野菊花8份、淡竹叶6份、甘草8份。
一种异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂,是由中药成分与菌液混合后经异步发酵制成,所述菌液为枯草芽孢杆菌菌液与嗜酸乳杆菌菌液。
在上述方案的基础上,所述异步发酵为先接入枯草芽孢杆菌菌液进行有氧发酵,再接入嗜酸乳杆菌进行厌氧发酵。
在上述方案的基础上,所述枯草芽孢杆菌菌液中菌含量≥108CFU/mL,嗜酸乳杆菌菌液中菌含量≥107CFU/mL。
在上述方案的基础上,所述中药组分由以下组分按重量份数制备而成:生石膏60~100份、水牛角10~20份、生地黄9~15份、玄参10~20份、白茅根10~20份、知母10~20份、黄连8~12份、莲子心8~12份、栀子8~12份、丹皮8~12份、赤芍8~12份、连翘8~12份、桔梗8~12份、金银花10~20份、野菊花6~10份、淡竹叶3~8份、甘草6~10份。
在上述方案的基础上,所述中药组分由以下组分按重量份数制备而成:生石膏80份、水牛角15份、生地黄12份、玄参15份、白茅根15份、知母15份、黄连10份、莲子心10份、栀子10份、丹皮10份、赤芍10份、连翘10份、桔梗10份、金银花15份、野菊花8份、淡竹叶6份、甘草8份。
在上述方案的基础上,所述异步发酵法的制备禽用抗病毒中药制剂的制备方法,步骤如下:
(1)按量取中药组分,粉碎,过60目筛网,备用;
(2)将中药各成分依次加入液体发酵罐后,加入占物料总重量10倍的水,4%葡萄糖,4%酵母和2%大豆蛋白胨;搅拌均匀,100℃蒸汽灭菌30min后,冷却至30℃~37℃;
(3)将枯草芽孢杆菌菌种进行活化并扩大培养制备发酵液;接种枯草芽孢杆菌发酵液,接种量为8%~10%,调初始pH值6.5,控制发酵温度30℃~37℃,转速200~300rpm,通气量15~20L/min;发酵时间为24h;
(4)将嗜酸乳杆菌菌种进行活化并扩大培养制备发酵液;接种嗜酸乳杆菌菌液,接种量8%~10%,厌氧发酵36h;
(5)对发酵后液体进行过滤,过滤所得液体即为本发明中药发酵制剂。
所述枯草芽孢杆菌活化培养基和所述发酵所用培养基为:PBY培养基,成分为(g/L):蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、酵母膏5.0、葡萄糖5.0、氯化钠5.0,调pH 7.0-7.2。
所述嗜酸乳杆菌活化培养基和所述发酵所用培养基为:MRS培养基,成分为(g/L):蛋白胨10.0、肉膏10.0、酵母浸粉5.0、葡萄糖20.0、磷酸氢二钾2.0、柠檬酸氢二铵2.0、乙酸钠5.0、硫酸镁0.58、硫酸锰0.28、半胱氨酸0.5、吐温80 1.0,调pH6.2-6.4。
在上述方案的基础上,所述异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂用于提高禽类的抗病毒能力和免疫力。
一种提高禽类的抗病毒能力和免疫力的方法,给禽类饲喂含有上述方法制备的中药制剂的水,添加量为每500mL兑水500kg。
本发明禽用抗病毒中药组合物,各中药的药性药效如下:
生石膏:为矿物单斜晶系含水硫酸钙矿石,主要成分为含水硫酸钙,具有清热泻火、解渴除烦等功效。
水牛角:牛科动物水牛的角,含甾醇类、氨基酸类、肽类、胍基衍生物、蛋白质等主要成分,具有清热、凉血、解毒等功效。
生地黄:玄参科植物地黄的块根,含梓醇、氨基酸类、糖、甘露醇、β-谷甾醇及菜油甾醇等主要成分,具有清热生津、止血等功效。
玄参:别名元参,为玄参科多年生草本植物玄参(浙玄参)及其同属北玄参的干燥根。多为栽培,含玄武甙、植物甾醇、亚麻油酸、生物碱等主要成分,具有滋阴降火、在体外中和白喉毒素等功效。
白茅根:为禾本科多年生草本植物白茅的根茎,野生。主要含大量钾盐,并有芦竹素、白茅素、木蜜糖、果糖、葡萄糖、柠檬酸、草酸等成分。具有清热凉血,止血,利尿之功效。
知母:为百合科植物知母的根茎,主要含皂苷类成分,具有抗菌解热等功效。
黄连:为毛莨科多年生草本植物黄连或同属植物的干燥地下根茎,栽培或野生。主要含黄连素(小蘖硷)、黄连硷、巴马亭、黄连宁等成分。具有清热燥湿,解毒之功效。
野菊花:为菊科多年生草本植物,野生。含菊醇、野菊花内酯、氨基酸、微量元素等多种活性成分。具有清热解毒,疏风平肝之功效。
莲子心:睡莲科植物莲的成熟种子中间的绿色胚根(莲心),取出,晒干。含莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、荷叶碱、前荷叶碱、牛角花素、甲基紫堇杷灵、去甲基乌药碱,又含水犀草甙、金丝桃甙、芸香甙等黄酮类成分。具有清心去热、涩精、止血、止渴等功效。
栀子:为茜草科常绿灌木栀子树的干燥成熟果实,多野生,现已大量栽培,含栀子甙、番红花甙、栀子黄色素等主要成分,具有解热、利胆、止血、抗菌、镇静、降压等功效。
丹皮:为毛莨科落叶小灌木牡丹的干燥根皮,栽培或野生,含丹皮酚(即芍药醇)、牡丹皮原甙、苯甲酸、植物甾醇、鞣质等主要成分,具有抗菌、降压等功效。
赤芍:为毛茛科多年生草本植物芍药及同属草芍药、川赤芍、毛叶芍药、毛叶草芍药、美丽芍药等的干燥根。均为野生。主要含苯甲酸、鞣质、芍药甙等成分。具有清泄肝火,散瘀活血,止痛之功效。
连翘:为木犀科多年生落叶灌木连翘的干燥近成熟果实(青壳)和成熟后的果壳(老翘),野生或栽培,含连翘酚、齐墩果酸,一种甾醇化合物和维生素P等主要成分,具有抗菌抗病毒和强心利尿等功效。
桔梗:为桔梗科植物桔梗的根,含皂甙、菠菜甾醇、α-菠菜甾莳-β-D-葡萄糖甙、Δ7-豆甾烯醇、白桦脂醇,并含菊糖、桔梗聚糖、三萜烯类物质:桔梗酸A、B、及C等主要成分,具有开宣肺气,祛痰排脓等功效。
金银花:为忍冬科多年生常绿缠绕灌木忍冬山银花以及同属多种植物忍冬的干燥花蕾。多为栽培,也有野生。主要含肌醇、木犀草素、绿原酸。鞣质等成分。主要功效为清热解毒。
淡竹叶:别名竹叶,含芦竹萜、白茅萜等主要成分,性甘淡寒,具有解热利尿等功效。
甘草:别名甜甘草,为豆科多年生草本植物甘草和光果甘草等的干燥根和根状茎(芦头),多为野生,含甘草甜素、甘草黄素、葡萄糖、甘露醇、苹果酸、天门冬酰胺等主要成分,具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳等功效。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为产淀粉酶、蛋白酶和果胶酶的菌种,编号为AS1.942,来源于中国科学院微生物研究所。
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为嗜酸乳杆菌ATCC 4356,购自上海北诺生物科技有限公司。
本发明的技术原理:
本方重用生石膏为君,直清胃热,清肺泻胃火;水牛角配以丹皮、生地、赤芍专于凉血解毒化瘀;白茅根、知母、玄参滋肾水、补阴液、退虚热;黄连、莲子心、栀子三药合用能泻三焦实火;共为臣;连翘、桔梗清热透邪利咽;金银花、野菊花清热解毒、疏散风热;淡竹叶清心利尿,导热下行,共为佐药。甘草以清阳明之热、调和诸药,补益脾气。以上诸药并用,清热之中兼以养阴,凉血之中兼以散瘀。
本发明复合中药制剂具有以下特点:(1)该中药组方清热泻火,凉血解毒益阴,可有效提高家禽抗病毒能力。(2)本发明选用的枯草芽孢杆菌在代谢过程中可分泌蛋白酶、果胶酶、淀粉酶等胞外酶进入培养基,分解蛋白质、果胶、淀粉等物质成分,破坏细胞壁,加强细胞内容物溶出。(3)本发明选用的嗜酸乳杆菌通过酸化作用,进一步强化细胞壁的破坏与溶出。(4)在本发明选用的枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的作用下,促使本发明药物活性成分最大限度的释放,增强了原有药物的功能;且发酵后细菌的代谢产生了新的活性物质,进一步补充了本发明药物的功能。(5)嗜酸乳杆菌可产生乳酸、乙酸和抗生物素类物质(嗜酸乳菌素(acidolin)、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(1aetocidon),对肠道致病菌产生的拮抗作用,使肠道内的菌群恢复正常平衡。
本发明方法选取的中药组分结构合理、比例适当,选用的嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌具有活性高、抗逆性强、可调节肠道菌群等优势,在本发明所选取的嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌的作用下,显著地提高了原有药物的药效,提高了家禽血清免疫指标,使用本发明的发酵药物可以提高家禽的抗病毒能力。
具体实施方式
以下结合较佳实施例,对依据本发明提供的具体实施方式详述如下:
实施例1
菌液的制备:
将嗜酸乳杆菌菌种接种于活化培养基进行培养,培养温度为37℃,时间24h;将活化好的菌种接种于发酵罐中,控制温度37℃~43℃,时间24h~36h,制备发酵液。
所述活化培养基为:MRS培养基,成分为(g/L):蛋白胨10.0、肉膏10.0、酵母浸粉5.0、葡萄糖20.0、磷酸氢二钾2.0、柠檬酸氢二铵2.0、乙酸钠5.0、硫酸镁0.58、硫酸锰0.28、半胱氨酸0.5、吐温80 1.0,调pH 6.2-6.4。
发酵所用培养基为:MRS培养基,成分同上。
发酵完成后,菌液中嗜酸乳杆菌的含量≥107CFU/mL。
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为嗜酸乳杆菌ATCC 4356,购自上海北诺生物科技有限公司。
将枯草芽孢杆菌菌种接种于活化培养基进行活化培养,培养温度为30℃,时间24h;将活化好的菌种接种于发酵罐中,控制温度30℃~35℃,转速80~150rpm,搅拌培养,通无菌风,通气比为0.8~1.2,时间24h~36h。
所述活化培养基和所述发酵所用培养基为:PBY培养基,成分为(g/L):蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、酵母膏5.0、葡萄糖5.0、氯化钠5.0,调pH 7.0-7.2。
发酵所用培养基为:PBY培养基,成分同上。
发酵完成后,菌液中枯草芽孢杆菌的含量≥108CFU/mL。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为产淀粉酶、蛋白酶和果胶酶的菌种,编号为AS1.942,来源于中国科学院微生物研究所。
实施例2
一种禽用抗病毒中药制剂,其各组分的重量份数为:
生石膏80份、水牛角15份、生地黄12份、玄参15份、白茅根15份、知母15份、黄连10份、莲子心10份、栀子10份、丹皮10份、赤芍10份、连翘10份、桔梗10份、金银花15份、野菊花8份、淡竹叶6份、甘草8份。
具体制备方法如下:
(1)按量取中药组分,粉碎,过60目筛网,备用;
(2)将中药各成分依次加入液体发酵罐后,加入占物料总重量10倍的水,4%葡萄糖,4%酵母和2%大豆蛋白胨;搅拌均匀,100℃蒸汽灭菌30min后,冷却至30℃~37℃。
(3)将枯草芽孢杆菌菌种进行活化并扩大培养制备发酵液;接种枯草芽孢杆菌发酵液,接种量为8%~10%,调初始pH值6.5,控制发酵温度30℃~37℃,转速200~300rpm,通气量15~20L/min;发酵时间为24h。
(4)将嗜酸乳杆菌菌种进行活化并扩大培养制备发酵液;接种嗜酸乳杆菌菌液,接种量8%~10%,厌氧发酵36h。
(5)对发酵后液体进行120目过滤,过滤所得液体即为本发明中药发酵制剂。
实施例3
一种禽用抗病毒中药制剂,其各组分的重量份数为:
生石膏60份、水牛角10份、生地黄9份、玄参10份、白茅根10份、知母10份、黄连8份、莲子心8份、栀子8份、丹皮8份、赤芍8份、连翘8份、桔梗8份、金银花10份、野菊花6份、淡竹叶3份、甘草6份。
制备方法与实施例2相同。
实施例4
一种禽用抗病毒中药制剂,其各组分的重量份数为:
生石膏100份、水牛角20份、生地黄15份、玄参20份、白茅根20份、知母20份、黄连12份、莲子心12份、栀子12份、丹皮12份、赤芍12份、连翘12份、桔梗12份、金银花20份、野菊花10份、淡竹叶8份、甘草10份。
制备方法与实施例2相同。
一、本发明中药发酵制剂对禽类免疫力的影响
1.1试验组方
1.1.1传统工艺制备的非发酵中药制剂组(将本发明实施例2所选取的药物进行超微粉碎,粉碎至700目,加入占物料总重量10倍的水,4%葡萄糖,4%酵母和2%大豆蛋白胨;搅拌均匀后浸泡0.5h,煎煮3次,煎煮时间1.5h,120目过滤得到滤液)
1.1.2实施例2的中药发酵制剂;
1.1.3实施例3的中药发酵制剂;
1.1.4实施例4的中药发酵制剂;
1.1.5实施例2不含生石膏的中药发酵制剂,记为对照组1;
1.1.6实施例2不含水牛角、生地黄、丹皮、赤芍、白茅根、知母、玄参、黄连、莲子心、栀子的中药发酵制剂,记为对照组2;
1.1.7实施例2不含连翘、桔梗、金银花、野菊花、淡竹叶的中药发酵制剂,记为对照组3;
1.1.8实施例2不含甘草的中药发酵制剂,记为对照组4;
1.1.9实施例2不含金银花、野菊花、白茅根的中药发酵制剂,记为对照组5;
1.1.10空白对照组
1.2试验设计
选用1d健康的樱桃谷肉鸭1000只,随机分为10组,每组5个重复,每个重复20只。各试验组均饲喂基础日粮。对照组饮水中不添加任何制剂,超微粉组饮水中添加非发酵制剂的超微粉蒸煮滤液,发酵中药试验组分别于饮水中添加实施例2的中药发酵制剂、实施例3的中药发酵制剂和实施例4的中药发酵制剂,对照组1~5分别于饮水中添加1.1.5~1.1.9的中药发酵制剂,添加量均为每500mL兑水500kg,自由饮水;其他试验条件完全一致。日粮组成及营养水平见表1。
表1基础日粮组成及营养水平(风干基础)
预混料为每千克饲粮提供VA 10 000IU,VD 2 000IU,VE 20IU,VK 0.5IU,Mn 80mg,Fe 80mg,Cu 8.0mg,I 0.4mg,Zn 60mg,Se 0.2mg,烟酸60mg,泛酸11mg,吡哆醇2.5mg,核黄素4.0mg,生物素0.2mg,叶酸0.6mg,硫胺素3.0mg。
1.3饲养管理
试验鸭采用网上平养,自由采食和饮水,24h光照,按常规免疫程序进行免疫,每天于上午8:00与下午16:00饲喂两次。试验期为42d。
1.4指标测定
1.4.1中药发酵制剂对免疫器官指数的影响
于试验的第21d和42d在每个重复组中随机抽取平均体重相近的肉鸭2只用于免疫器官测定。颈动脉放血,采集血液制备血清,血清样品于-20℃保存待测。摘取胸腺、脾脏和法氏囊,剔除脂肪后称鲜重。用所得的免疫器官重量与体重的比值计算免疫器官指数。计算公式为:免疫器官指数(g/kg)=免疫器官重(g)/体重(kg)。
1.4.2血清免疫指标
血清中的免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、补体3(C3)补体4(C4)含量采用ELISA进行测定;免疫球蛋白M(IgM)采用免疫比浊法进行测定。所用试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
1.5数据处理
所有采集数据采用Excel软件进行前期处理,然后用SPSS19.0进行统计分析,LSD进行多重比较,结果采用平均值±标准差表示。
1.6结果与分析
1.6.1中药发酵制剂对樱桃谷肉鸭免疫器官指数的影响
表2中药发酵制剂对樱桃谷肉鸭免疫器官指数的影响
注:同列肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
由表2可知,21d试验结果:胸腺指数和法氏囊指数实施例2组极显著高于空白对照组、对照组1和对照组2(P<0.01);脾脏指数实施例2组显著高于空白对照组、对照组1和对照组2(P<0.05)。42d试验结果:胸腺指数指数实施例2组显著高于空白对照组、对照组1和对照组2(P<0.05);脾脏指数实施例2组极显著高于空白对照组、对照组1、对照组2、对照组3、对照组5和超微粉组(P<0.01),实施例3组、实施例4组和对照组4极显著高于空白对照组、对照组1和对照组2;法氏囊指数各组之间无显著性差异(P>0.05)。
1.6.2中药发酵制剂对樱桃谷肉鸭血清免疫指标的影响
表3中药发酵制剂对樱桃谷肉鸭血清免疫指标的影响
注:同列肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
由表3可知,21d试验结果:IgM含量空白对照组、对照组1和对照组2极显著低于其他组(P<0.01),超微粉组、对照组3和对照组5极显著低于实施例2组和实施例4组(P<0.01),实施例3组和对照组4与超微粉组、对照组3、对照组5和实施例4组无显著性差异(P>0.05)但极显著低于实施例2组;IgG含量实施例2组显著高于空白对照组、对照组1和对照组2(P<0.05),与其他各组无显著性差异(P>0.05);IgA、C3和C4含量各组之间无显著性差异(P>0.05);
42d试验结果:IgM含量空白对照组、对照组1和对照组2极显著低于实施例2组、实施例3组、实施例4组和对照组4(P<0.01),超微粉组、对照组3和对照组5极显著低于实施例2组(P<0.01);IgG含量实施例2组显著高于空白对照组、对照组1和对照组2(P<0.05),与其他各组无显著性差异(P>0.05);IgA含量各组之间无显著性差异(P>0.05);C3含量空白对照组、对照组1、对照组2和对照组3极显著低于其他各组(P<0.01);C4含量实施例2组、实施例3组和对照组4极显著高于空白对照组、对照组1和对照组2(P<0.01),与其他各组无显著性差异(P>0.05)。
二、本发明中药发酵制剂对禽类抗病毒能力的影响
2.1试验组方
2.1.1传统工艺制备的非发酵中药制剂组(将本发明实施例2所选取的药物进行超微粉碎,粉碎至700目,加入占物料总重量10倍的水,4%葡萄糖,4%酵母和2%大豆蛋白胨;搅拌均匀后浸泡0.5h,煎煮3次,煎煮时间1.5h,120目过滤得到滤液。)
2.1.2实施例2的中药发酵制剂
2.1.3抗病毒中药复方制剂:双黄连口服液(购自上海浦发动物药业有限公司)。
2.1.4空白对照
2.2试验设计
选择14d龄青脚麻羽雏鸡,450只,随机分为5组,每组6个重复,每个重复15只,试验动物其他处理条件一致,对每组的处理如下:
阴性对照组:按0.5mL/只颈部皮下注射灭菌生理盐水,常规饲喂,正常饮水,水中不添加任何物质;
阳性对照组:按0.5mL/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗(NDV-Lasota株,购自华南农业大学生物药品有限公司),常规饲喂,正常饮水,水中不添加任何物质;
超微粉组:按0.5mL/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗,常规饲喂,饮用水中添加传统工艺制备的非发酵中药制剂,添加量为每500mL兑水500kg,自由饮水;
实施例2组:按0.5mL/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗,常规饲喂,饮用水中添加本发明实施例2制备的中药发酵制剂,添加量为每500mL兑水500kg,自由饮水;
复方制剂组:按0.5mL/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗,常规饲喂,饮用水中添加双黄连口服液,添加量为每500mL兑水500kg,自由饮水。
2.3试验指标的检测
2.3.1疫苗接种及处理后的第7、14、21、28d,每组随机抽取6只雏鸡,翅静脉采血各1.5mL,血液室温自然凝固10-20min后,200-3000rpm离心20min,收集血清,参照鸡NDV-AbELISA试剂盒说明书方法测定NDV-Ab;
2.3.2疫苗接种及处理后的第7、14、21、28d,每组随机抽取6只雏鸡,翅静脉采血各2.0mL,加入柠檬酸钠抗凝后,加2mL PBS缓冲液并混匀,按照鸡外周血淋巴细胞分离、鸡CD4+和CD8+单克隆抗体试剂盒说明书及流式细胞仪操作检测CD4+、CD8+T淋巴细胞的含量,并计算比值。
2.4试验数据处理
所有采集数据采用Excel软件进行前期处理,然后用SPSS19.0进行统计分析,LSD进行多重比较,结果采用平均值±标准差表示。
2.5试验结果
2.5.1中药发酵制剂对NDV-Ab含量的影响
表4中药发酵制剂对NDV-Ab含量的影响(ng/L)
注:同列肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
由表4可知,免疫后第7d,实施例2组NDV-Ab含量显著高于其他组(P<0.05);其他各组间NDV-Ab含量无显著性差异(P>0.05)。免疫第14d,实施例2组NDV-Ab含量极显著高于其他各组(P<0.01);超微粉组NDV-Ab含量极显著高于阴性对照组和阳性对照组(P<0.01);复方制剂组NDV-Ab含量极显著高于阴性对照组(P<0.01);超微粉组与复方制剂组之间、阴性对照组与阳性对照组之间无显著性差异(P>0.05)。免疫后第21d,实施例2组NDV-Ab含量极显著高于其他组(P<0.01);其他各组间NDV-Ab含量无显著性差异(P>0.05)。免疫后第28d,实施例2组NDV-Ab含量极显著高于阴性对照组、阳性对照组及复方制剂组(P<0.01),与超微粉组无显著性差异(P>0.05);其他各组间NDV-Ab含量无显著性差异(P>0.05)。
2.5.2中药发酵制剂对CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值的影响
表5中药发酵制剂对CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值的影响
注:同列肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
由表5可知,试验第7d,阳性对照组、超微粉组、实施例2组和复方制剂组CD4+/CD8+T淋巴细胞比值无显著性差异(P>0.05),且都极显著高于阴性对照组(P<0.01)。试验第14d,超微粉组、实施例2组和复方制剂组CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值极显著高于阴性对照组(P<0.01);阳性对照组CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值与其他各组无显著性差异(P>0.05)。试验第21d,实施例2组CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值极显著高于阴性对照组、阳性对照组和复方制剂组(P<0.01);其他各组之间无显著性差异(P>0.05)。试验第28d,实施例2组CD4+/CD8+T淋巴细胞比值极显著高于阴性对照组(P<0.01),与其他组差异不显著(P>0.05);其他各组之间CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值无显著性差异(P>0.05)。
三、药理学毒性试验
3.1急性毒性试验资料
检测试剂:血清AST、ALT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
检测设备
Micro-200半自动生化检测仪,分析天平,解剖器械,注射器,试管等。
3.2试验方法
选取体重为18~22g的ICR鼠100只,经3天适应性饲养后,随机均分为5组(雌雄各半),超微粉组、实施例2组、实施例3组、实施例4组和空白对照组,每组各20只;空白对照组灌胃生理盐水,超微粉组所用超微粉选用本发明实施例2所选取的中药组分进行超微粉碎,粉碎至700目,加入占物料总重量10倍的水,4%葡萄糖,4%酵母和2%大豆蛋白胨;搅拌均匀后浸泡0.5h,煎煮3次,煎煮时间1.5h,120目过滤得到滤液;实施例2组、实施例3组、实施例4组分别将各实施例制备的发酵制剂兑水灌服,超微粉组、实施例2组、实施例3组、实施例4组的药物添加量为0.1mL/mL,0.4mL/次/只,一天3次,连续7天。
3.3测定指标及方法
(1)临床症状观察:每日观察试验鼠的精神状态、饮食情况,每日记录发病死亡情况。
(2)病理学观察:对于死亡鼠进行剖检观察内脏变化。
(3)生长指标观察:对试验鼠进行定期称重;试验结束,扑杀鼠称量体重、脏器重脏器指数测定:剖检大鼠,取心脏、脾脏、肝脏、肾脏、睾丸、卵巢,称重,按照下式计算脏器指数:脏器指数=脏器重/体重×100。
(4)肝脏功能变化观察:试验结束后,扑杀鼠,采取血液分离血清,测定AST、ALT。
3.4数据处理与分析
所有采集数据采用Excel软件进行前期处理,然后用SPSS19.0进行统计分析,LSD进行多重比较,结果采用平均值±标准差表示。
3.5临床症状观察
空白对照组和试验组鼠,精神状态和饮食欲、对外界反应能力未见明显的异常。各组鼠发病和死亡情况如下表6。
表6鼠发病和死亡情况
分组 | 总数 | 死亡(只) | 死亡率(%) |
超微粉组 | 20 | 0 | 0 |
实施例2组 | 20 | 0 | 0 |
实施例3组 | 20 | 0 | 0 |
实施例4组 | 20 | 0 | 0 |
空白对照组 | 20 | 0 | 0 |
病理学观察:空白对照组和试验组,鼠扑杀后进行剖检眼观未见观察内脏器官明显的病理变化。
生长指标观察:试验结束,扑杀鼠称量体重、脏器重分析见表7。
表7鼠脏器重分析
分组 | 肝脏指数 | 心脏指数 | 肾脏指数 | 肺脏指数 | 脾脏指数 |
超微粉 | 53.88±1.35a | 4.46±0.21a | 13.40±0.33a | 6.69±0.55a | 4.90±0.51ab |
实施例2组 | 54.22±1.13a | 4.57±0.29a | 13.52±0.19a | 6.85±0.49a | 5.62±0.39b |
实施例3组 | 54.01±1.32a | 4.45±0.18a | 13.46±0.24a | 6.70±0.51a | 5.57±0.54b |
实施例4组 | 54.09±1.28a | 4.49±0.12a | 13.48±0.30a | 6.74±0.36a | 5.59±0.41b |
空白对照组 | 53.71±1.20a | 4.30±0.24a | 13.41±0.21a | 6.60±0.58a | 4.11±0.66a |
注:同列肩标字母相同或无字母表示差异不显著(P>0.05),肩标字母不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表7可知,实施例2、3和4组较对照组脾脏指数显著提高(P<0.05),超微粉组与实施例2、3和4组之间差异不显著;其它指数对照组与各试验组之间无显著性差异(P>0.05)。
肝脏功能变化观察
试验结束后,扑杀鼠,采取血液分离血清,测定AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)见表8。结果显示各组数据与空白对照组相比差异不显著,都处于正常范围内。
表8 AST、ALT的测定结果
分组 | 总数 | ALT | AST |
超微粉 | 20 | 39.09±2.88a | 105.60±3.74a |
实施例2组 | 20 | 39.35±2.05a | 105.98±4.12a |
实施例3组 | 20 | 39.29±2.53a | 105.81±3.95a |
实施例4组 | 20 | 39.26±2.01a | 105.82±4.11a |
空白对照组 | 20 | 39.01±2.60a | 105.37±4.28a |
注:同列肩标字母相同或无字母表示差异不显著(P>0.05),肩标字母不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表8可知,AST、ALT测定结果各试验组与对照组无显著性差异,都处于正常范围内。
3.6长期毒性试验资料
根据实施例2制备的本发明发酵制剂,20mL/kg、100mL/kg给1月龄ICR鼠连续灌胃给药1个月,动物的皮毛、肤色、摄食、活动、尿、便等均无异常;动物的血常规、肝、肾功能等血液生化指标和动物的主要脏器指数均在正常范围,且正常动力无差异,病理组织学检查表明,心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、气管、睾丸、卵巢等重要脏器无病理改变。停药两周后检查以上各项指标均无明显毒性反应,表明无蓄积毒性。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种禽用抗病毒中药组合物,其特征在于:是由以下组分按重量份数制备而成:生石膏60~100份、水牛角10~20份、生地黄9~15份、玄参10~20份、白茅根10~20份、知母10~20份、黄连8~12份、莲子心8~12份、栀子8~12份、丹皮8~12份、赤芍8~12份、连翘8~12份、桔梗8~12份、金银花10~20份、野菊花6~10份、淡竹叶3~8份、甘草6~10份。
2.根据权利要求1所述禽用抗病毒中药组合物,其特征在于:是由以下组分按重量份数制备而成:生石膏80份、水牛角15份、生地黄12份、玄参15份、白茅根15份、知母15份、黄连10份、莲子心10份、栀子10份、丹皮10份、赤芍10份、连翘10份、桔梗10份、金银花15份、野菊花8份、淡竹叶6份、甘草8份。
3.一种异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂,其特征在于:是由中药成分与菌液混合后经异步发酵制成,所述菌液为枯草芽孢杆菌菌液与嗜酸乳杆菌菌液。
4.根据权利要求3所述异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂,其特征在于:所述异步发酵为先接入枯草芽孢杆菌菌液进行有氧发酵,再接入嗜酸乳杆菌进行厌氧发酵。
5.根据权利要求3所述异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂,其特征在于:所述枯草芽孢杆菌菌液中菌含量≥108CFU/mL,嗜酸乳杆菌菌液中菌含量≥107CFU/mL。
6.根据权利要求3-5所述异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂,其特征在于:所述中药组分由以下组分按重量份数制备而成:生石膏60~100份、水牛角10~20份、生地黄9~15份、玄参10~20份、白茅根10~20份、知母10~20份、黄连8~12份、莲子心8~12份、栀子8~12份、丹皮8~12份、赤芍8~12份、连翘8~12份、桔梗8~12份、金银花10~20份、野菊花6~10份、淡竹叶3~8份、甘草6~10份。
7.根据权利要求6所述异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂,其特征在于:所述中药组分由以下组分按重量份数制备而成:生石膏80份、水牛角15份、生地黄12份、玄参15份、白茅根15份、知母15份、黄连10份、莲子心10份、栀子10份、丹皮10份、赤芍10份、连翘10份、桔梗10份、金银花15份、野菊花8份、淡竹叶6份、甘草8份。
8.根据权利要求3-7任一项所述异步发酵法的制备禽用抗病毒中药制剂的制备方法,其特征在于:步骤如下:
(1)按量取中药组分,粉碎,过60目筛网,备用;
(2)将中药各成分依次加入液体发酵罐后,加入占物料总重量10倍的水,4%葡萄糖,4%酵母和2%大豆蛋白胨;搅拌均匀,100℃蒸汽灭菌30min后,冷却至30℃~37℃;
(3)将枯草芽孢杆菌菌种进行活化并扩大培养制备发酵液;接种枯草芽孢杆菌发酵液,接种量为8%~10%,调初始pH值6.5,控制发酵温度30℃~37℃,转速200~300rpm,通气量15~20L/min;发酵时间为24h;
(4)将嗜酸乳杆菌菌种进行活化并扩大培养制备发酵液;接种嗜酸乳杆菌菌液,接种量8%~10%,厌氧发酵36h;
(5)对发酵后液体进行过滤,过滤所得液体即为本发明中药发酵制剂。
9.一种权利要求3-7任一项所述异步发酵法制备的禽用抗病毒中药制剂的用途,其特征在于:用于提高禽类的抗病毒能力和免疫力。
10.一种提高禽类的抗病毒能力和免疫力的方法,其特征在于:给禽类饲喂含有权利要求8所述方法制备的中药制剂的水,添加量为每500mL兑水500kg。
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