CN102321664B - 一种利用发根农杆菌诱导产生雷公藤毛状根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用发根农杆菌诱导产生雷公藤毛状根的方法，包括（1）无菌外植体的获得；（2）发根农杆菌菌液的制备；（3）农杆菌侵染诱导毛状根；（4）毛状根离体培养体系的建立，所述毛状根离体培养体系的建立，是在27±1℃暗培养条件下，将毛状根置于含500mg/L头孢噻肟钠的1∕2MS固体培养基中大量培养，每7d继代一次，继代过程中逐渐降低头孢噻肟钠的使用浓度，直至无菌，最后将已完全无菌的毛状根于1∕2MS固体培养基上进行继代培养保存。对产生的无菌雷公藤毛状根进行检测时发现其含有相当数量的雷公藤甲素，明显高于传统雷公藤野生根及组培根中甲素的含量，具有良好的工业化应用前景。利用毛状根培养生产雷公藤甲素，可用以填补中药缺口。
Description
技术领域
本发明公开了一种利用发根农杆菌诱导产生雷公藤（Tripterygium wilfordii Hok . f1）毛状根的方法，并初步建立了雷公藤毛状根离体培养体系。
背景技术
发根农杆菌(Agrobaeterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)农杆菌属(Agrobactefium)一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物 ，通过发根农杆菌感染植物，将其所含的Ri 质粒上的一段DNA （T-DNA）转移并整合到植物基因组中，诱导产生毛状根。
雷公藤是一种双子叶木质藤本植物，分布于南方福建、江西、浙江、广东、湖南、湖北、台湾等省份。是珍贵的药用植物。雷公藤提取物中含有70种以上的有效成分，主要有；生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类等次生代谢物。这些成分具有解毒散结、活血化瘀、消炎、抗肿瘤、免疫调整、抗生育等多种药理作用。广泛用于治疗类风湿性关节炎、肺病、肾病、皮肤病、白血病等疾病。
由于植物次生代谢物质具有极其复杂的化学结构，至今仍没有找到有效的或经济可行合成方法。虽然近几十年来利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究获得了迅速发展，但是由于植物细胞培养是采用未分化的细胞，其生长与代谢通路常常不相容的，因而次生代谢产物的生产能力低且不稳定，从而限制了其产业化的发展。而经过发根农杆菌侵染植物所形成的毛状根（hair root）由于其生长迅速且遗传性状稳定，成为药用植物次生代谢产物生产的重要原料。毛状根本质是一种恶性增殖的器官、相对于常规细胞培养，其具有激素自养、生长迅速、周期短等特点，因而可进行大量培养。同时它起源于单细胞，遗传性状稳定，拥有亲本植株的特征次生代谢途径。
利用药用植物毛状根培养体系生产次生代谢产物的研究已有几十年的历史。如Mano等（1986）建立了29个日本莨菪（Scoplia japinlica）毛状根无性系，研究表明均能产生阿托品烷生物碱，从中选育出的克隆，其重量的增加比正常植株高出102倍，莨菪碱含量高达1.3%，为原植株根中的3倍；Yshikawa和Furuya（1987）通过人参的愈伤组织成功诱导出了毛状根，这种毛状根在无外源激素的条件下生长迅速，是用激素诱导人参根快速增长的2倍，毛状根中有效成分人参皂甙的含量最高可达干重的0.95%，高于在生根和天然栽培根的含量，Parr等（1988）通过诱导长春花形成的毛状根，并从中检测到了具有抗癌作用的长春碱，但通过长春花的细胞培养却无法得到这种生物碱，说明毛状根能够合成某些悬浮细胞不能合成的次生代谢物质。
目前国内外尚未见有关利用雷公藤毛状根对其活性物质进行生产的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用发根农杆菌诱导产生雷公藤毛状根的方法，利用毛状根培养生产雷公藤甲素，可用以填补中药缺口。
本发明的方法包括（1）无菌外植体的获得；（2）发根农杆菌菌液的制备；（3）农杆菌侵染诱导毛状根；（4）毛状根离体培养体系的建立，所述毛状根离体培养体系的建立，是在27±1℃暗培养条件下，将毛状根置于含500mg/L头孢噻肟钠的1∕2MS固体培养基中大量培养，每7d继代一次，继代过程中逐渐降低头孢噻肟钠的使用浓度，直至无菌，最后将已完全无菌的毛状根于1∕2MS固体培养基上进行继代培养保存。
发根农杆菌菌液的制备如下：发根农杆菌活化后接种于含100mg/L卡那霉素的液体YEB培养基中，27±1℃黑暗条件下120-180r/min振荡培养至OD600=0.5-0.8，收集菌液，并将菌体在4℃条件下，8000r/min离心10分钟，弃上清液，将菌体重悬于2倍体积的无菌1∕2MS液体培养基中。
农杆菌浸染诱导毛状根的方法为：将无菌外植体与发根农杆菌菌液共同培养于1∕2MS液体培养基内，加入识别信号因子乙酰丁香酮至150μmol/L，以促进其转化，在120r/min， 27±1℃下振荡处理30min后，取出浸染的外植体用无菌滤纸吸干，在27±1℃暗培养条件下，置于1∕2MS固体培养基中诱导毛状根产生。
对产生的无菌雷公藤毛状根进行检测时发现其含有相当数量的雷公藤甲素（15.6559mg/g），明显高于传统雷公藤野生根及组培根中甲素的含量，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为诱导产生的毛状根。
图2为雷公藤标准品液相色谱检测图。
图2为诱导产生的毛状根中雷公藤甲素含量的液相色谱检测图。
具体实施方式
本发明的一种利用发根农杆菌诱导产生雷公藤毛状根的方法，具体内容与实施方式如下：
1、雷公藤无菌外植体的获取：摘取野生雷公藤幼苗的叶片和嫩茎，清水冲洗后，超净工作台上切段， 划痕。叶片切成1cm2,嫩茎长2～4 cm。嫩茎划痕 2～3次 ,并保持两端剪口平滑。将切段外植体经70%的酒精消毒1min, 无菌水清洗3次后，再浸泡于0.1% HgCl2溶液中消毒10min后,用无菌水冲洗3 次后,无菌滤纸擦干表面水分，置于1∕2MS液体培养基，在2000lx ,16h/d 日光照,25 ℃条件下培养2～3d，以使创伤部位分泌更多的酚类物质，提高转化率。
2、发根农杆菌菌液的制备方法：将实验室保藏的发根农杆菌GIM1.141（购于广东微生物研究所菌种保藏中心）活化后接种于含100mg/L卡那霉素的液体YEB培养基（牛肉浸膏，5g/L；酵母浸膏，1 g/L；蛋白胨，5g/L；硫酸镁，0.5g/L；pH=7.0-7.4）中，27±1℃黑暗条件下振荡培养（120-180r/min）至OD600≈0.5-0.8收集菌液，并将菌体在4℃条件下，8000r/min离心10分钟，弃上清液，将菌体重悬于2倍体积的无菌1∕2MS液体培养基中。
3、农杆菌浸染诱导毛状根的方法：将经过预培养的雷公藤无菌外植体，放入制备好的农杆菌重悬菌液中，加入识别信号因子乙酰丁香酮（acetosyringone）至150μmol/L，以促进其转化，在120r/min，（27±1）℃下振荡处理30min后，取出浸染的外植体用无菌滤纸吸干，在（27±1）℃暗培养条件下，置于1∕2MS固体培养基中诱导毛状根产生，每7d继代一次，约30d后在外植体的创伤部位可见有毛状根长出。
4、雷公藤毛状根离体培养体系建立：将生成的毛状根从雷公藤外植体上切下, 在（27±1）℃暗培养条件下，置于含500mg/L头孢噻肟钠的1∕2MS固体培养基中生长，每7d继代一次，继代过程中逐渐降低头孢噻肟钠的使用浓度，直至无菌。最后将已完全无菌的雷公藤毛状根于1∕2MS固体培养基上进行继代培养保存。
为了进一步说明本发明的效果，进行了以下有益的试验：
1、不同类型外植体对发根的影响。采用发根农杆菌GIM1.141对雷公藤的嫩茎与叶片外植体进行诱导发根，结果如表1所示。由表1可知，发根农杆菌GIM1.141菌株对雷公藤叶片外植体诱导产生毛状根的效率明显高于嫩茎外植体。
表1不同外植体产生毛状根的发根率
2、雷公藤甲素的测定：利用高效液相色谱分别对毛状根、野生根及组培根中雷公藤甲素浓度进行检测。将新鲜植物样品置于烘箱中，于60℃条件下，烘干10h至恒重，在研钵中碾碎。称取0.5g雷公藤粉末，以甲醇为提取剂，导入10ml离心管，超声波提取处理30min，于4℃冰箱中储存，自然浸提12h，把样品放入离心机中3500r/min，取上清液，并定容于10ml容量瓶中，样品经0.45μm微孔滤头过滤，微量注射器每次吸取10μl，用于测定雷公藤甲素。雷公藤甲素标准品购于成都普瑞法科技开发有限公司。液相色谱仪的参数设置为：流动相为70%甲醇，30%水；流速为1ml/min，检测波长208nm。检测前将流动相，超纯水，甲素标准溶液和发酵液样品预先超声波处理半小时，雷公藤甲素标样及毛状根样品中甲素的色谱检测图见图2与图3。
雷公藤不同形态根（毛状根、野生根及组培根）中药用成分雷公藤甲素的含量如表2所示。从中可知，由GIM1.141菌株诱导产生的毛状根中雷公藤甲素的含量高达15.6559mg/g，分别是野生雷公藤植株和组培苗根中甲素含量的94.92和19.03倍。
表2雷公藤甲素含量
Claims (1)
1.一种利用发根农杆菌诱导产生雷公藤毛状根的方法，其特征在于：
（1） 雷公藤无菌外植体的获取：摘取野生雷公藤幼苗的叶片和嫩茎，清水冲洗后，超净工作台上切段， 划痕，叶片切成1cm2,嫩茎长2～4 cm，嫩茎划痕 2～3次 ,并保持两端剪口平滑，将切段外植体经70%的酒精消毒1min, 无菌水清洗3次后，再浸泡于0.1% HgCl2溶液中消毒10min后,用无菌水冲洗3 次后,无菌滤纸擦干表面水分，置于1∕2MS液体培养基，在2000lx ,16h/d 日光照,25 ℃条件下培养2～3d，以使创伤部位分泌更多的酚类物质，提高转化率；
（2） 发根农杆菌菌液的制备方法：将发根农杆菌GIM1.141活化后接种于含100mg/L卡那霉素的液体YEB培养基，牛肉浸膏，5g/L；酵母浸膏，1 g/L；蛋白胨，5g/L；硫酸镁，0.5g/L；pH=7.0-7.4中，27±1℃黑暗条件下振荡培养120-180r/min至OD600=0.5-0.8收集菌液，并将菌体在4℃条件下，8000r/min离心10分钟，弃上清液，将菌体重悬于2倍体积的无菌1∕2MS液体培养基中；
（3） 农杆菌浸染诱导毛状根的方法：将经过预培养的雷公藤无菌外植体，放入制备好的农杆菌重悬菌液中，加入识别信号因子乙酰丁香酮acetosyringone至150μmol/L，以促进其转化，在120r/min， 27±1℃下振荡处理30min后，取出浸染的外植体用无菌滤纸吸干，在27±1℃暗培养条件下，置于1∕2MS固体培养基中诱导毛状根产生，每7d继代一次， 30d后在外植体的创伤部位见有毛状根长出；
（4） 雷公藤毛状根离体培养体系建立：将生成的毛状根从雷公藤外植体上切下, 在27±1℃暗培养条件下，置于含500mg/L头孢噻肟钠的1∕2MS固体培养基中生长，每7d继代一次，继代过程中逐渐降低头孢噻肟钠的使用浓度，直至无菌，最后将已完全无菌的雷公藤毛状根于1∕2MS固体培养基上进行继代培养保存。
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