CN101985633A - 一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法 - Google Patents

一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法 Download PDF

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刘仲华
毛清黎
王坤波
杨新河
龚雨顺
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李顺文
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Abstract

本发明涉及一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法，选用R1000发根农杆菌菌株感染苗龄10-20d的苦瓜试管苗的茎段或子叶盘在含IBA5.0的MS培养基中共培养1-2d得到共培养的外植体，然后在含500mgL-1头孢霉素的1/2MS0固体培养基上脱菌培养8-10d便可获得苦瓜发根。采用本发明获得的苦瓜发根，发根频率及发根密度最高可达84.2%和12.3，发根中苦瓜总皂甙含量达33.43mg/g，分别比苦瓜试管苗的根、茎和子叶含量高69.1%、48.6%和49.8%。本发明为选育优质高产的苦瓜新品种以及利用Ri质粒为载体,进行有用基因转移奠定了基础，也为利用苦瓜发根培养生物合成苦瓜皂甙等药用成分提供了有效途径。

Description

一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程及细胞工程技术领域。具体涉及一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法。
背景技术
现代研究证实苦瓜皂甙是苦瓜中的主要有效成分，其具有降血糖、抗肿瘤、抗艾滋病、抗氧化、抗生育、抗菌、抗病毒以及提高人体免疫性等药理作用。与细胞培养和愈伤组织培养相比，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）Ri质粒转化诱导出的发根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定以及分化程度高、不易变异等特点，此外尚可从发根培养物中寻找新的化合物。因此发根培养技术被认为是一条利用生物技术生产次生代谢产物(如药物、天然色素、香料、天然调味品等)的新的有效途径。目前，国内外对苦瓜的有效成分、药理功能和提取分离技术进行了较全面的研究，但有关利用Ri质粒转化技术提高苦瓜中功能成分含量及利用苦瓜发根培养技术生产苦瓜中特有功能成分的研究，至今在国内外还没见相关报道。本发明提供了一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的有效方法，为进一步利用发根培养系统生物合成苦瓜皂甙等有用次生代谢物提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法，该方法可获得较高发根频率、发根密度和苦瓜总皂甙的苦瓜发根。
本发明提供的技术方案是：一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法，选用R1000发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株感染苗龄10-20d的苦瓜试管苗的茎段或子叶盘在含IBA5.0的MS培养基中共培养1-2d得到共培养的外植体，然后在含500 mgL-1头孢霉素的1/2MS0固体培养基上脱菌培养8-10d便可获得苦瓜发根。
所述的苗龄10-20d的苦瓜试管苗由下法得到：取苦瓜种子剥出种皮，用蒸馏水浸泡1h，在75％乙醇中浸泡1min，用无菌水冲净乙醇，再用0.1％HgCl2消毒10min，无菌水冲洗5次，置于MS0培养基上12h/d光照培养至苗高6-8cm。
所述的感染是指：从YEB斜面培养基挑取发根农杆菌单菌落，转至含100mgL-1卡那霉素的YEB培养液，于黑暗、25℃，120 rpm培养24～36 h得发根农杆菌菌液；将苦瓜无菌苗的茎段或子叶盘浸入发根农杆菌菌液中，浸泡10-20min取出；用无菌滤纸吸干多余的菌液。
所述的脱菌培养是指：共培养的外植体经无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸取表水后移至含500 mgL-1头孢霉素的1/2MS0固体培养基上培养，25℃，在黑暗条件下脱菌培养，2-5d转接一次，直到无菌斑。
采用本发明获得的苦瓜发根，发根频率及发根密度最高可达84.2%和12.3，发根中苦瓜总皂甙含量达33.43 mg/g，分别比苦瓜试管苗的根、茎和子叶含量高69.1%、48.6%和49.8%。 本发明利用Ri质粒转化苦瓜成功，这为选育优质高产的苦瓜新品种以及利用Ri质粒为载体,进行有用基因转移奠定了基础，也为利用苦瓜发根培养生物合成苦瓜皂甙等药用成分提供了有效途径。 
具体实施方式   
试管苗培养：取苦瓜种子(青皮苦瓜和长白苦瓜种子)剥出种皮，用蒸馏水浸泡1h，在75％乙醇中浸泡1min，用无菌水冲净乙醇，再用0.1％HgCl2消毒10min，无菌水冲洗5次，置于MS0培养基上12h/d光照培养至苗高6-8cm左右（约1-3w）可作为供转化的外植体材料。 
菌种的活化：从YEB斜面培养基挑取R1000发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）单菌落，转至含100mgL-1卡那霉素的YEB培养液（25-30ml/100ml三角瓶），于黑暗、25℃，120 rpm培养24~36 h（菌液OD600=0.8-1.0，相当于8X106-107个细菌/ml菌液）用于感染。 
外植体的转化：
浸染：将苦瓜无菌苗外植体（切成10mm左右的茎段或5*5mm2子叶盘）浸入经活化的发根农杆菌菌液中，浸泡10-20min取出。用无菌滤纸吸干多余的菌液。 
共培养：固体共培养：将浸染过的外植体置于含IBA5.0（mg L-1）的MS固体培养基上，25℃，黑暗下共培养24-48h。 
脱菌培养：共培养的外植体经无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸取表水后移至含500 mgL-1头孢霉素（头孢噻肟钠，Cefotaxime）的1/2MS0固体培养基上培养，25℃，在黑暗条件下脱菌培养，2-5d转接一次，一般经4-5次转接后可完成脱菌（直到无菌斑），并获得发根。获得苦瓜发根的诱导频率及发根密度最高达90%和11.25，发根中苦瓜总皂甙含量达33.43 mg/g，分别比苦瓜试管苗的根、茎和子叶含量高69.1%、48.6%和49.8%。[测定方法参见：毛清黎等. 超声波乙醇浸提快速测定苦瓜总皂甙的方法研究[J]. 食品科学. 2006, 27(12): 622-626.] 。

Claims (4)

1. 一种发根农杆菌介导苦瓜发根高频诱导及遗传转化的方法，其特征在于选用R1000发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株感染苗龄10-20d的苦瓜试管苗的茎段或子叶盘在含IBA5.0的MS培养基中共培养1-2d得到共培养的外植体，然后在含500 mgL-1头孢霉素的1/2MS0固体培养基上脱菌培养8-10d便可获得苦瓜发根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的苗龄10-20d的苦瓜试管苗由下法得到：取苦瓜种子剥出种皮，用蒸馏水浸泡1h，在75％乙醇中浸泡1min，用无菌水冲净乙醇，再用0.1％HgCl2消毒10min，无菌水冲洗5次，置于MS0培养基上12h/d光照培养至苗高6-8cm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的感染是指：从YEB斜面培养基挑取发根农杆菌单菌落，转至含100mgL-1卡那霉素的YEB培养液，于黑暗、25℃，120 rpm培养24～36 h得发根农杆菌菌液；将苦瓜无菌苗的茎段或子叶盘浸入发根农杆菌菌液中，浸泡10-20min取出；用无菌滤纸吸干多余的菌液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的脱菌培养是指：共培养的外植体经无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸取表水后移至含500 mgL-1头孢霉素的1/2MS0固体培养基上培养，25℃，在黑暗条件下脱菌培养，2-5d转接一次，直到无菌斑。
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