CN104630261B - 一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，包括材料选择、菌液制备、外植体浸染、共培养、阳性筛选、瞬时表达检测6个步骤。采用本发明能够将团花遗传转化瞬时表达效率提高863.6～908.9％，有效解决通过农杆菌介导方法浸染效率低、较难获得团花转基因植株的问题，有效降低农杆菌斑的生长，延长农杆菌与外植体共培养的时间而基本不伤害外植体，提高转基因的瞬时表达率。
Description
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域。具体涉及一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法。
背景技术
团花(Neolamarckiacadamba)，又称黄梁木，为我国南方乡土阔叶树种，由于生长迅速，树干通直，因而被誉为“奇迹树”，早在20世纪70年代就受国内外普遍关注。其材性与杉木相当，速生性与桉树、杨树相近，是较好的用材和纸浆原料树种；树皮含有丰富的生物碱类，其中3α-二氢卡丹宾和3β-二氢卡丹宾为治疗高血压药物“钩藤总碱”的有效成分，具有强而持久的降压作用，其效价已经接近利血平(EndoK,OshimaY,KikuchiH,etal.HypotensiveprinciplesofUncariahooks.Plantamedica.1983,49(3):188-190)，这2个生物碱类在钩藤中仅为微量成分存在，而在团花树皮中作为仅次于卡丹宾含量的主要成分存在，是较好药源树种；此外，团花也是优良的园林绿化树种、蜜源树种、饲料树种。由于团花用途广、潜在经济价值大，有着广阔的开发前景。虽然团花有较好的速生、丰产特性，但抗寒性弱，在我国可进行人工栽培的区域受到制约；利用传统的常规育种进行抗性选育，存在周期长、变异不确定等问题；而利用植物基因工程方法对团花进行遗传改良，具有育种目标明确、费用低、操作简单、重复性好、育种周期较常规育种短的优点。
农杆菌介导的遗传转化技术已广泛用于获取新品种或进行种质改良的研究，但获得转基团植株与再生体系、农杆菌株类型和浸染浓度、共培养方法和时间等诸多因素有关，这些因素组成一个完整的遗传转化系统，任何一个因素的效率偏低，均会导致遗传转化效率的下降甚至无法获得转基因植株。
目前，采用团花大田枝芽(邓小梅，詹艳玲，张倩，等.黄梁木组培快繁技术研究.华南农业大学学报.2012,33(2):216-219；林碧珍，张树河，林加耕.团花树组培快繁技术研究.中国热带农业.2009(3):46-47.)、种子无菌苗子叶或下胚轴(黄浩.黄梁木地理变异和再生系统的建立.华南农业大学学位论文,2014.)作为外植体，通过组织培养获得再生植株已获成功，由于邓小梅等、林碧珍等人采用大田枝芽作为外植体的方法，是通过直接器官再生方式获再生植株，该方法并不适合团花进行遗传转化；而黄浩采用种子无菌苗子叶或下胚轴为外植体，是经过愈伤组织的间接器官再生方式获得再生植株的方法，正是普遍用于植物遗传转化的再生方法。在前期，我们已利用常规的农杆菌介导遗传转化方法对团花进行了试验，但瞬时表达效率较低，转化效率很极低。因此，需进一步对团花遗传转化方法进行了优化，目的是建立一种团花高效遗传转化的技术，为团花遗传改良特别是抗寒、抗虫的改良提供技术基础。
经文献检索，尚无团花遗传转化的相关报道。
发明内容
本发明针对团花在农杆菌介导的遗传转化中瞬时表达率低，转化效率低的问题，提供一种提高遗传转化瞬时表达率的方法。通过农杆菌介导法将外源基因导入团花受体细胞，提高外源基因的转化效率，建立由农杆菌介导的团花遗传转化体系。
本发明所述的提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，包括如下步骤：
1.材料选择
选择20～25d的无菌团花幼苗,切取胚轴和带柄子叶为外植体；
选择带GUS基因的植物表达载体pBI121，通过CaCl2法导入农杆菌C58或LBA4404，获得菌液C或菌液L，菌液C为带植物表达载体pBI121的农杆菌C58菌液，菌液L为带植物表达载体pBI121的农杆菌LBA4404菌液；
植物表达载体pBI121、农杆菌C58和LBA4404均由生物公司购买获得。
2.菌液制备
吸取50μL的菌液C或菌液L，转移到质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和25mg/L链霉素的100mLYEB液体培养基中，于22℃、130r/min振荡培养至菌液OD600值为0.8，然后于5000r/min离心10min收集菌体，再用200mLDCR液体培养基重悬，于28℃、130r/min振荡培养，至菌液OD600值为0.8～1.0，此时带菌液C或菌液L的DCR液体即为遗传转化浸染液。
所述YEB培养基成分为：5.0g/L牛肉浸膏，1.0g/L酵母粉，5.0g/L蛋白胨，5.0g/L蔗糖，0.04g/LMgSO4·7H2O，pH值为7.0；
所述DCR培养基成分为：P.K.Gupta和D.J.Durzan于1985年公开发表的DCR配方(P.K.Gupta,D.J.Durzan.ShootmultiplicationfrommaturetreesofDouglas-fir(Pseudotsugamenziesii)andsugarpine(Pinuslambertiana).PlantCellReports,1985,4:177-179)。
3.外植体浸染
将切取的外植体浸入到装有步骤2遗传转化浸染液的三角瓶中，轻轻摇动让外植体完全浸泡在浸染液中，密封好三角瓶口，在0.05Mpa的真空干燥器内放置5min；
4.外植体共培养
将步骤3中浸染后的外植体从遗传转化浸染液中取出，吸干外植体表面的农杆菌，然后转移到含液体分化诱导培养基的湿润滤纸上共培养；在22℃的黑暗条件下共培养6d；
所述液体分化诱导培养基为DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖，pH5.2～5.4；
5.阳性筛选
将共培养后的外植体，转移到质量体积浓度比为12mg/L卡那霉素和100mg/L头孢霉素的固体分化诱导培养基中培养，在25±2℃、光周期为10h/d的条件下培养7d；
所述固体分化诱导培养基为DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH5.8～6.2。
6.瞬时表达检测
用灭菌的超纯水，将共培养7d后的外植体表面清净干净，浸没于GUS染色液中，于37℃的恒温箱中温育12h，然后转入体积浓度比为70％的乙醇溶液中脱色2～3次，每次10min，最后保存于体积浓度比为70％的乙醇溶液中；
所述GUS染色液成分为：每1000mL溶液含15.601gNaH2PO4，3.7224gNa2EDTA,211.2mgK4[Fe(CN)6]·3H2O,164.7mgK3[Fe(CN)6],1mLTriton·X-100,0.5gX-Gluc；染色液的pH7.0；X-Gluc在使用前需用二甲基亚砜(DMSO)溶解。
在适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶(GUS)可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此，具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点；由于团花组织和细胞不含有β-葡聚糖苷酶，没经浸染的团花是无法呈现蓝色或蓝色斑点的，而经过浸染的团花外植体，若经GUS染色液染色后呈蓝色，表明GUS基因已转入到团花的细胞中。
浸染步骤中，先在0.05Mpa的真空干燥器内放置5min，然后采用湿润滤纸共培养6d的浸染方法，其瞬时表达效率较在常压下浸染、直接在固体培养基上培养3d的浸染效率提高863.6％～908.9％，经显著性检验，二种方法间差异极显著。
在采用浸染时置于真空干燥器中和含湿润液体分化诱导培养基共培养6d的方法，GUS瞬时表达率均在40％以上。
本发明具有以下优点：
1、浸染时所使用的设备和材料简单，采用在0.05MPa真空下浸染、经液体诱导分化培养基湿润的滤纸进行共培养，共培养时间可延长至6～7d，较目前常用的固体诱导分化培养基共培养方法多3～4d，GUS瞬时表达率提高863.6％～908.9％，也提高获得转基因植株的可能性，为通过转基因方法对团花进行遗传改良奠定基础；
2、本发明提出的技术方案具有简便易行、可操作性和重现性好的特点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明所述的提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法的一个实例，包括如下步骤：
1、材料选择：
双元表达载体pBI121、农杆菌C58，已灭菌带滤纸的培养皿，外植体为20～25d苗龄团花种子无菌苗下胚轴和带柄子叶。
2、菌液制备：
将携带GUS基因的表达载体pBI121通过CaCl2法导入农杆菌C58中。待菌液PCR鉴定正确无误后，挑取农杆菌转化子的单菌落，在质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和25mg/L链霉素的液体LB培养基2mL中于28℃振荡培养过夜。第2天吸取50μL菌液转接入100mLYEB液体培养基，于22℃、130r/min振荡培养至菌液OD600值为0.8，然后于5000r/min离心10min收集菌体，再用200mLDCR液体培养基重悬，于28℃、130r/min振荡培养，至菌液OD600值为0.8～1.0，此时的液体即为带有表达载体pBI121的农杆菌C58遗传转化浸染液。
3、外植体浸染：
在超净工作台上，切取团花无菌苗的下胚轴子叶，迅速转移到摇好的农杆菌C58遗传转化浸染液中，置于0.05Mpa的真空干燥器内放置5min。
4、共培养：
将浸染的外植体取出，吸干表面的农杆菌液，转移到经液体诱导分化培养基DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖的湿润滤纸培养皿中，于22℃的黑暗环境下进行共培养，每天观察农杆菌斑在外植体周围生长情况。
5、GUS染色检测：
共培养时间满6d时，开始看到外植体周围有少量脓状菌斑出现，但外植体均无黄化现象，此时，用无菌水洗净外植体表面菌株，转移到固体分化培养基DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.6g/L琼脂中培养；7d后经GUS染色检测，检测到GUS的瞬时表达率为45.4±1.63％；而采用在常压下浸染、直接在固体分培养基上共培养的方法，当共培养时间满2d时，外植体周围的农杆菌斑明显，少量外植体已黄化死亡，此时，用无菌水洗净表面菌株和培养基，转移到固体分化培养基培养，7d后利用GUS染色检测，检测到GUS的瞬时表达率为4.5±1.23％；前者较后者的瞬时表达率提高908.9％，经显著性检验，二者差异极显著，试验结果见表1。
表1C58菌株不同浸染和共培养方法对瞬时表达率的影响
GUS染色方法为：将转到固体培养基培养7d后的外植体取出，用无菌水洗净表面培养基并吸干水分，浸没于GUS染色液中，于37℃的恒温箱中温育12h，然后转入体积浓度比为70％的乙醇溶液中脱色2～3次，每次10min，最后保存于体积浓度比为70％的乙醇溶液中；若外植体呈蓝色或蓝色斑点即表示GUS基因已转入到团花的细胞中。
实施例2
本发明所述的提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法的另一个实例，包括如下步骤：
1、材料选择：
双元表达载体pBI121，农杆菌LBA4404，已灭菌带滤纸的培养皿，外植体为20～25d苗龄团花种子无菌苗下胚轴和带柄子叶；
2、菌液制备：
将携带GUS基因的表达载体pBI121通过CaCl2法导入根癌农杆菌LBA4404中；待菌液PCR鉴定正确无误后，挑取农杆菌转化子的单菌落，在质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素(Kan)、50mg/L利福平(Rif)和25mg/L链霉素(Str)的液体LB培养基2mL中28℃振荡培养过夜。第2天吸取50μL菌液转接入100mLYEB液体培养基，于22℃、130r/min振荡培养至菌液在600nm的OD值为0.8，然后于5000r/min离心10min收集菌体，再用200mLDCR液体培养基重悬，于28℃、130r/min振荡培养，至菌液在600nm波长时的OD值为0.8～1.0，此时的液体即为带有表达载体pBI121的农杆菌LBA4404遗传转化浸染液；
3、外植体浸染：
在超净工作台上，切取团花无菌苗的下胚轴子叶，，迅速转移到摇好的LBA4404菌液中，在超净工作台上浸染5min，浸染过程中摇动1～2次；
4、共培养：
将浸染的外植体取出，吸干表面的农杆菌液，转移到经液体诱导分化培养基DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖的湿润滤纸培养皿中，于22℃的黑暗环境下进行共培养，每天观察农杆菌斑在外植体周围生长情况；
5、GUS染色检测：
共培养时间满7d时，开始看到外植体周围有少量脓状菌斑出现，但外植体均无黄化现象，此时，用无菌水洗净外植体表面菌株，转移到固体分化培养基DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.6g/L琼脂中培养；7d后经GUS染色检测，检测到GUS的瞬时表达率为42.4±1.98％；而采用在常压下浸染、直接在固体分化培养基上共培养的方法，当共培养时间满3d时，外植体周围的农杆菌斑明显，少量外植体已黄化死亡，此时，用无菌水洗净表面菌株和培养基，转移到固体分化培养基培养，7d后利用GUS染色检测，检测到GUS的瞬时表达率为4.4±1.62％；前者较直接在固体分化培养基上共培养的瞬时表达率提高863.6％，经显著性检验，二者差异极显著，试验结果见表2。
表2LBA4404菌株不同浸染和共培养方法对瞬时表达率的影响
GUS染色检测方法参照实施例一的GUS染色检测。
Claims (2)
1.一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)材料选择
选择20～25d的无菌团花幼苗,切取胚轴和带柄子叶为外植体；
选择带GUS基因的植物表达载体pBI121，通过CaCl2法导入农杆菌C58或LBA4404，获得菌液C或菌液L，菌液C为带植物表达载体pBI121的农杆菌C58菌液，菌液L为带植物表达载体pBI121的农杆菌LBA4404菌液；
(2)菌液制备
吸取50μL的菌液C或菌液L，转移到质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和25mg/L链霉素的100mLYEB液体培养基中，于22℃、130r/min振荡培养至菌液OD600值为0.8，然后于5000r/min离心10min收集菌体，再用200mLDCR液体培养基重悬，于28℃、130r/min振荡培养，至菌液OD600值为0.8～1.0，此时带菌液C或菌液L的DCR液体即为遗传转化浸染液；
所述YEB培养基成分为：5.0g/L牛肉浸膏，1.0g/L酵母粉，5.0g/L蛋白胨，5.0g/L蔗糖，0.04g/LMgSO4·7H2O，pH值为7.0；
所述DCR培养基成分为：P.K.Gupta和D.J.Durzan于1985年公开发表的DCR配方；
(3)外植体浸染
将切取的外植体浸入到装有步骤(2)遗传转化浸染液的三角瓶中，轻轻摇动让外植体完全浸泡在浸染液中，密封好三角瓶口，在0.05Mpa的真空干燥器内放置5min；
(4)外植体共培养
将步骤(3)中浸染后的外植体从遗传转化浸染液中取出，吸干外植体表面的农杆菌，然后转移到含液体分化诱导培养基的湿润滤纸上共培养；在22℃的黑暗条件下共培养6d；
所述液体分化诱导培养基为DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖，pH5.2～5.4；
(5)阳性筛选
将共培养后的外植体转移到质量体积浓度比为12mg/L卡那霉素和100mg/L头孢霉素的固体分化诱导培养基中培养，在25±2℃、光周期为10h/d的条件下培养7d；
所述固体分化诱导培养基为DCR+2.0mg/LTDZ+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH5.8～6.2；
(6)瞬时表达检测
用灭菌的超纯水，将共培养7d后的外植体表面清净干净，浸没于GUS染色液中，于37℃的恒温箱中温育12h，然后转入体积浓度比为70％的乙醇溶液中脱色2～3次，每次10min，最后保存于体积浓度比为70％的乙醇溶液中；若外植体呈蓝色或蓝色斑点即表示GUS基因已转入到团花的细胞中，
所述GUS染色液成分为：每1000mL溶液含15.601gNaH2PO4，3.7224gNa2EDTA,211.2mgK4[Fe(CN)6]·3H2O,164.7mgK3[Fe(CN)6],1mLTriton·X-100,0.5gX-Gluc；染色液的pH7.0。
2.根据权利要求1所述的提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，其特征在于：所述X-Gluc在使用前用二甲基亚砜(DMSO)溶解。
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