CN108148871B - 一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法。本发明提供一种雷公藤的遗传转化的方法，包括如下步骤：采用基因枪法将含有目的基因的质粒导入雷公藤悬浮细胞；所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：1‑3μg/μl；轰击次数：2‑3次；目标距离：3‑6cm；轰击压力：1100‑1350psi；真空度：26‑28mmHg；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养时间为36‑48h；所述基因枪法中，用微载体和含有目的基因的质粒制备包埋微载体时，采用的沉淀剂为氯化钙或亚精胺。本发明提供的方法可以提高雷公藤遗传转化率，对于雷公藤的遗传转化研究有重要意义。

Description

一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法
技术领域
本发明涉及一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法。
背景技术
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是卫矛科植物，为木质藤本，又名断肠草、黄藤根，在我国主要分布于长江流域以南及西南地区。作为传统中药，其味辛、苦，性寒，具有活血化瘀、清热解毒、消肿散结、杀虫止血等功效。临床上被广泛用于治疗类风湿关节炎、肾小球肾炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病及各种皮肤病，成为国内外研究的热点天然药物之一。
迄今为止已从雷公藤中分离鉴定天然化合物多为萜类和生物碱。雷公藤甲素是主要活性成分之一，它是一类独特的松香烷型二萜化合物，研究发现雷公藤甲素具有明显的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等重要生物活性，成为国内外研究人员的关注热点，并进入临床评价研究阶段。雷公藤红素作为主要的三萜化合物，研究发现其通过抑制癌细胞的蛋白酶活性而诱发癌细胞死亡，有效率达到65％～93％，超过紫杉醇。近期有报道表明雷公藤红素是一个瘦素敏感剂，可能会成为有效治疗肥胖的新型药物。
目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和基因枪法。农杆菌介导转化存在诸多难题，如：雷公藤作为木本植物易木质化、再生困难、需分离更有效的农杆菌菌株，以上问题导致农杆菌转化周期长(6-12月)且转化率低。基因枪转化法是借助高速运动的金属微粒使附着于其表面的核酸分子穿过受体的细胞壁，释放出的DNA分子随机整合到基因组中，通过细胞和组织培养再生植株。基因枪法受体类型广泛；操作简便快速；一次处理可使许多细胞转化。目前应用基因枪法已获得了烟草、拟南芥、大豆等转基因植株或细胞，但在雷公藤中未有报道。然而基因枪法转化率也受到诸多因素影响，比如：受体材料的类型、材料状态、接受和整合外源DNA的能力、转化参数等。因此在基因枪转化过程中，应综合考虑以上影响因素以便有效提高基因枪的转化效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法。
本发明提供一种雷公藤的遗传转化的方法，包括如下步骤：采用基因枪法将含有目的基因的质粒导入雷公藤悬浮细胞；所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：1-3μg/μl；轰击次数：2-3次；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为36-48h。
所述基因枪法中，所述基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：2μg/μl；轰击次数：3次；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为48h。
所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：1-3μg/μl；轰击次数：2-3次；目标距离：3-6cm；轰击压力：1100-1350psi；真空度：26-28mmHg；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为36-48h；所述基因枪法中，用微载体和含有目的基因的质粒制备包埋微载体时，采用的沉淀剂为沉淀剂A和/或沉淀剂B；所述沉淀剂A为氯化钙或氯化钙溶液；所述沉淀剂B为亚精胺或亚精胺溶液。
所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：2μg/μl；轰击次数：3次；目标距离：3cm；轰击压力：1100psi；真空度：28mmHg；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为48h；所述基因枪法中，用微载体和含有目的基因的质粒制备包埋微载体时，采用的沉淀剂为氯化钙或氯化钙溶液。
以上任一所述氯化钙溶液具体可为2.5M氯化钙水溶液。
以上任一所述亚精胺溶液具体可为0.1M亚精胺水溶液。
所述基因枪法具体包括如下步骤：
所述基因枪轰击具体包括如下步骤：
(1)微载体制备：将30mg的金粉加至1ml 70％(v/v)乙醇水溶液中，涡旋3-5min，室温静置15min，10000rpm离心5min收集沉淀；用水清洗沉淀；使用500μl50％(v/v)甘油水溶液重悬沉淀，稍混悬2-3s，得到微载体溶液；
(2)DNA的包裹：取50μl步骤(1)得到的微载体溶液，依次加入5μl含有目的基因的质粒DNA(2μg/μl)和50μl2.5M氯化钙水溶液，涡旋振荡2-3min，静置1min，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用70％(v/v)乙醇水溶液清洗沉淀；使用48μl无水乙醇重悬沉淀，轻震荡2-3s，得到包埋微载体溶液；
(3)将载体膜置于载体膜支架上，吸取8-10μl步骤(2)制备的包埋微载体溶液涂布于载体膜，使用基因枪(PDS 1000/He，Bio-Rad)对雷公藤悬浮细胞进行轰击，参数设置：目标距离：3cm，轰击压力：1100psi，真空度：28mmHg，轰击次数：3次。
以上任一所述共培养采用共培养培养基；所述共培养培养基由溶质和溶剂组成；溶质及其在共培养培养基中的浓度为4.43g/L MS，0.5mg/L 2,4-D，0.1mg/L KT，0.5mg/LIBA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂；溶剂为水。所述共培养培养基的pH为5.8。所述共培养的培养条件为25℃、暗培养。
所述方法中，所述雷公藤悬浮细胞在转化前采用预培养基进行预培养；所述预培养基为含有0.5mg·L-1 2,4-D、0.1mg·L-1KT和0.5mg·L-1IBA的MS固体培养基。所述预培养基的pH为5.8。所述预培养的培养条件为25℃、暗培养。所述预培养时间为7天。
所述雷公藤悬浮细胞的制备方法包括如下步骤：将雷公藤愈伤组织接种于含有0.5mg·L-1 2,4-D、0.1mg·L-1KT和0.5mg·L-1IBA的MS液体培养液中悬浮培养(25℃、黑暗、120rpm)，得到雷公藤悬浮细胞。所述悬浮培养的时间为21天。
所述雷公藤愈伤组织的制备方法包括如下步骤：将雷公藤的幼叶和幼茎接种于含1.0mg·L-1 2,4-D的MS固体培养基上培养(25℃、暗培养)，得到雷公藤愈伤组织。所述雷公藤愈伤组织在含有0.5mg·L-1 2,4-D、0.1mg·L-1KT和0.5mg·L-1IBA的MS固体培养基上继代培养(25℃、暗培养)3代以上。
含有目的基因的质粒是将目的基因插入出发质粒得到的。
所述出发质粒具体可为过表达载体pH7WG2D。
所述目的基因可为TwFPS1蛋白的编码基因或TwFPS2蛋白的编码基因。
所述含有目的基因(TwFPS1蛋白的编码基因)的质粒具体可为将过表达载体pH7WG2D的重组位点间的片段替换为序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。
所述含有目的基因(TwFPS2蛋白的编码基因)的质粒具体可为将过表达载体pH7WG2D的重组位点间的片段替换为序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。
本发明还保护一种提高雷公藤中雷公藤红素含量的方法，包括如下步骤：提高雷公藤中TwFPS1蛋白或TwFPS2蛋白的表达量和/或活性，得到雷公藤红素含量提高的雷公藤。
本发明还保护一种提高雷公藤中雷公藤红素含量的方法，包括如下步骤：将TwFPS1蛋白的编码基因或TwFPS2蛋白的编码基因导入雷公藤，得到雷公藤红素含量提高的雷公藤。
所述方法中，所述导入是通过以上任一所述雷公藤的遗传转化的方法实现的。
本发明还保护TwFPS1蛋白或TwFPS2蛋白在调控雷公藤中雷公藤红素含量中的应用。所述调控为正向调控。
本发明还保护TwFPS2蛋白的编码基因或TwFPS2蛋白的编码基因在培育雷公藤红素含量高的雷公藤中的应用。
以上任一所述TwFPS1蛋白是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的的由序列3衍生的蛋白质。
以上任一所述TwFPS2蛋白是如下(a3)或(a4)：
(a3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a4)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的的由序列4衍生的蛋白质。
以上任一所述TwFPS1蛋白的编码基因为如下(b1)或(b2)或(b3)的DNA分子：
(b1)其编码区如序列表的序列1所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列至少具有90％同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
以上任一所述TwFPS2蛋白的编码基因为如下(c1)或(c2)或(c3)的DNA分子：
(c1)其编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(c3)与(c1)或(c2)限定的DNA序列至少具有90％同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
本发明的发明人建立了基因枪介导的雷公藤遗传转化系统，以雷公藤悬浮细胞为受体，PBI-1300-EGFP为供体，采用正交实验设计，研究了基因枪的目标距离、轰击压力、轰击次数、真空度、DNA浓度、沉淀剂和共培养时间对转化效率的影响，经方差分析与差异显著性测验，共培养时间、轰击次数和DNA浓度对转化效率影响显著，其余参数对转化率影响不显著，最优转化条件为：目标距离3cm，轰击压力1100psi，轰击次数3次，真空度28mmHg，DNA浓度：2μg/μl，沉淀剂：CaCl2，共培养时间48h。经流式细胞仪检测，平均瞬时转化率为19.17％。FPS基因家族主要参与倍半萜、三萜生物合成途径，利用该体系将FPS家族基因转化雷公藤悬浮细胞，经潮霉素筛选培养获得转基因细胞，经PCR检测，证明载体上GFP基因已整合到抗性细胞基因组中，经qPCR检测，FPS家族基因表达显著上调，且雷公藤红素达到973.60μg/g，是野生型细胞雷公藤红素的10.60倍。本发明提供的方法可以提高雷公藤遗传转化率，对于雷公藤的遗传转化研究有重要意义。
附图说明
图1为潮霉素临界浓度筛选。
图2为不同因素水平对悬浮细胞GFP表达的影响。
图3为基因枪瞬时转化率图像流式分析。图3A：野生型悬浮细胞egfp表达量；图3B：野生型悬浮细胞细胞核egfp荧光图像；图3C：悬浮细胞egfp瞬时表达量；图3D：瞬时表达悬浮细胞细胞核egfp荧光图像；图3E：瞬时表达悬浮细胞cDNA为模板PCR扩增egfp基因片段；图3F：瞬时表达平均转化率。
图4为转基因T3代细胞PCR鉴定。图4A：转基因T3代细胞基因组为模板扩增egfp基因片段；图4B：转基因T3代细胞基因组为模板扩增潮霉素基因片段。
图5为转基因细胞系Southern blot分析。
图6为T0和T3代转基因细胞系基因表达分析。
图7为转基因细胞系红素含量测定。图7A：转基因细胞系雷公藤红素UPLC检测；图7B：转基因细胞系雷公藤红素含量分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
PBI-1300-EGFP载体：Addgene公司；PBI-1300-EGFP载体含有潮霉素抗性选择标记基因和EGFP报告基因。
载体pENTR/SD/D-TOPO：美国Invitrogen公司。
过表达载体pH7WG2D：美国Invitrogen公司；过表达载体pH7WG2D含有潮霉素抗性选择标记基因和EGFP报告基因。
E.coli DH5α感受态细胞：北京全式金生物技术有限公司。
雷公藤：参考文献：Su P,Cheng Q,Wang X,et al.Characterization of eightterpenoids from tissue,cultures of the Chinese herbal plant,Tripterygium,wilfordii,by high-performance liquid,chromatography coupled withelectrospray,ionization tandem mass spectrometry.[J].BiomedicalChromatography Bmc,2014,28(9):1183-1192.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。
共培养培养基由溶质和溶剂组成；溶质及其在共培养培养基中的浓度为4.43g/LMS,0.5mg/L 2,4-D,0.1mg/L KT,0.5mg/L IBA,30g/L蔗糖,7g/L琼脂；溶剂为水，pH 5.8。
MS：PhytoTechnology，货号：M519。
TwFPS1蛋白如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列1所示。
TwFPS2蛋白如序列表的序列4所示，其编码基因如序列表的序列2所示。
实施例1、基因枪介导的雷公藤遗传转化方法的优化
一、雷公藤悬浮细胞培养
剪取雷公藤新生叶及茎，清洁干净后消毒，用无菌水冲洗若干次，将幼叶切成1.0cm×1.0cm左右小块，将幼茎切成1.0cm左右长小段，接种于含1.0mg·L-1 2,4-D的MS固体培养基上(25℃、暗培养)，培养约半个月后，在外植体切口处开始长出愈伤组织，选取白色有光泽、质地疏松、长势良好的愈伤组织，转移至含有0.5mg·L-12,4-D+0.1mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA的MS固体培养基上继代培养(25℃、暗培养)。
雷公藤愈伤组织经过连续继代培养3代以上，选取生长良好、质地疏松、生长情况一致或相似的的愈伤组织，用镊子夹成小块，转接入含0.5mg·L-1 2,4-D+0.1mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA的MS液体培养液(100mL)的250mL三角瓶中(每瓶2.0g愈伤组织)，25℃、黑暗、120rpm悬浮培养21天，得到雷公藤悬浮细胞。
二、转化受体耐潮霉素水平的筛选
将步骤一得到的雷公藤悬浮细胞接种于含有不同浓度潮霉素(0,0.1,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90和100mg/L)的继代培养基(MS+0.5mg·L-12,4-D+0.1mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA)中，25℃、黑暗、120rpm悬浮培养21天，通过抽滤弃去液体培养基，比较各组悬浮细胞质量确定潮霉素临界浓度。设置将步骤一得到的雷公藤悬浮细胞接种于不含有潮霉素的继代培养基进行培养的对照组。
结果如图1所示。结果表明，潮霉素浓度大于30mg/L时悬浮细胞迅速褐变和死亡，表现为生长抑制，甚至细胞的死亡；潮霉素浓度在3mg/L到20mg/L之间时，不能有效抑制悬浮细胞的生长；潮霉素浓度在0.1mg/L至2mg/L之间时，若用于抗性筛选，会导致大量假阳性的产生。因此，浓度2.5mg/L可以有效抑制悬浮细胞的生长，并且不能引起细胞迅速死亡。
三、基因枪介导的雷公藤悬浮细胞遗传转化
1、将步骤一得到的雷公藤悬浮细胞接种于含有0.5mg·L-1 2,4-D+0.1mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA的MS固体培养基(pH 5.8)上预培养(25℃、暗培养)7天。
2、微载体制备：将30mg的金粉中加至1ml 70％(v/v)乙醇水溶液中，涡旋3-5min，室温静置15min，10000rpm离心5min收集沉淀；使用1ml无菌水重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀(重复使用无菌水清洗沉淀两次)；使用500μl50％(v/v)无菌甘油水溶液重悬沉淀，稍混悬2-3s，得到微载体溶液(终浓度为60mg/ml)。
3、DNA的包裹：取50μl步骤2得到的微载体溶液，按顺序加入5μl PBI-1300-EGFP载体DNA和沉淀剂，涡旋振荡2-3min，静置1min，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用140μl70％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用140μl 70％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用48μl无水乙醇重悬沉淀，轻震荡2-3s，得到包埋微载体。
4、将载体膜置于载体膜支架上，吸取8-10μl步骤3制备的包埋微载体涂布于载体膜(为了避免微载体的聚集，在每次涂布微载体前混悬2-3s)，使用基因枪(PDS1000/He，Bio-Rad)对步骤1预培养的悬浮细胞进行轰击(轰击步骤详见操作手册)。
5、完成步骤4后，被轰击后的悬浮细胞在共培养培养基上进行过渡共培养(25℃、暗培养)。采用激光共聚焦显微镜观察细胞中GFP表达情况(在LSM880NLO显微镜(Zeiss,German)中使用488nm的激发波长检测GFP)。
设置不同的基因枪参数组合。不同参数设置见表1。基因枪参数的正交设计表见表2(共18组，每组重复2次)。
表1本实验中所涉及的因素及水平
Figure BDA0001519602080000071
a沉淀剂仅用2.5M氯化钙
b沉淀剂仅用0.1M亚精胺
c沉淀剂使用2.5M氯化钙和0.1M亚精胺
表2混合正交实验表L18(6×36)
Figure BDA0001519602080000072
Figure BDA0001519602080000081
表2中的数值为表1中的水平数
6、根据步骤5的检测结果计算轰击效率。轰击效率由每平方厘米的GFP点数量来评估。利用SPSS 18.0进行在5％的水平上统计分析。通过极差分析和方差分析，确定各实验因素不同水平及各因素的贡献率。在极差分析中，计算Ki和r的均值：
Figure BDA0001519602080000082
作为混合正交实验，调整R到R'：
Figure BDA0001519602080000083
各因素对指标指标的影响可以根据R值越大，R值越大，影响指标的因素越大。极差分析较为直观，但不能区分由实验条件引起的数据波动或由实验误差引起的数据波动，方差分析可以用来弥补极差分析的缺陷。方差分析将总变异分为因素变异和误差变异。通过F检验，确定参数的显著性。
R'统计结果如表3所示。结果表明，利用基因枪介导转化雷公藤悬浮细胞，7个参数可能影响效果：目标距离、轰击压力、真空度、轰击次数、沉淀剂、质粒DNA浓度和共培养时间，进行初步的分析，参数对轰击效果的影响顺序为：共培养时间>质粒DNA浓度>真空度>沉淀剂>目标距离>轰击次数>轰击压力。
各因素在不同水平上的差异如图2所示。其中，曲线的峰值表现为显著水平。具体来说最显著的组合为：目标组织距离：3cm(水平1)，轰击压力：1100psi(水平2)，真空度：28mmHg(水平3)，轰击次数：3次(水平3)、沉淀剂：氯化钙(水平1)，质粒DNA浓度：2μg/μl(水平3)，共培养时间：48h(水平2)。
方差分析的结果如表4所示。p值显示，共培养时间极显著(p<0.01)，轰击次数和质粒DNA浓度均有显著性(p<0.05)。通过GFP的表达对转化条件进行了评价：共培养时间，质粒DNA浓度和轰击次数这三个因素较显著，而其他因素则不显著。
将极差分析与方差分析相结合，综合评价确定最佳转化条件为目标距离：3cm，轰击压力：1100psi，真空度：28mmHg，轰击次数：3次，沉淀剂：氯化钙，质粒DNA浓度：2μg/μl，共培养时间：48h。
表3各因素水平数据极差分析L18(6×36)
Figure BDA0001519602080000091
表4各因素方差分析
Figure BDA0001519602080000092
a SS:离差平方和
b DF:自由度
c MS:平均离差平方和
d F值
*0.01<P<0.05:轰击次数，质粒DNA浓度
**P<0.01:共培养时间
7、最优组合转化效率计算
(1)将步骤一得到的雷公藤悬浮细胞接种于含有0.5mg·L-12,4-D+0.1mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA的MS固体培养基(pH 5.8)上预培养(25℃、暗培养)7天。
(2)微载体制备：将30mg的金粉中加至1ml 70％(v/v)乙醇水溶液中，涡旋3-5min，室温静置15min，10000rpm离心5min收集沉淀；使用1ml无菌水重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀(重复使用无菌水清洗沉淀两次)；使用500μl50％(v/v)无菌甘油水溶液重悬沉淀，稍混悬2-3s，得到微载体溶液(终浓度为60mg/ml)。
(3)DNA的包裹：取50μl步骤2得到的微载体溶液，按顺序加入5μl PBI-1300-EGFP载体DNA(2μg/μl)和50μl2.5M氯化钙水溶液，涡旋振荡2-3min，静置1min，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用140μl 70％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用140μl 70％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用48μl无水乙醇重悬沉淀，轻震荡2-3s，得到包埋微载体。
(4)将载体膜置于载体膜支架上，吸取8-10μl步骤3制备的包埋微载体涂布于载体膜(为了避免微载体的聚集，在每次涂布微载体前混悬2-3s)，使用基因枪(PDS1000/He，Bio-Rad)对步骤1预培养的悬浮细胞进行轰击(轰击步骤详见操作手册)，设置参数如下：目标距离：3cm，轰击压力：1100psi，真空度：28mmHg，轰击次数：3次。被轰击后的悬浮细胞在共培养培养基上进行过渡共培养(25℃、暗培养)48h。
应用图像流式细胞仪检测最优条件的转换效率，细胞核处理方法参照文献(Xu,C.,Wang,Y.,Yu,Y.,Duan,J.,Liao,Z.,Xiong,G.,et al.(2011).Degradation ofMONOCULM 1 by APC/CTAD1 regulates rice tillering.Nature Communications 3(2),132-136.)：在预冷的Galbraith’sh缓冲液(45mM MgCl2、30mM柠檬酸钠、20mM MOPS、0.1％(w/v)TritonX-100，pH 7.0)中使用刀片将悬浮细胞切碎，200目细胞筛过滤后用DAPI染色(2μg/mL)，通过图像流式细胞仪(FlowSight Flow Cytometer,Amnis)检测细胞核中DAPI(405nm),GFP(488nm),SSC(785nm)信号表达情况，以未转化的悬浮细胞细胞为对照，明确悬浮细胞转化效率；运用双分子共聚焦显微镜(LSM880NLO,Zeiss)检测亚细胞定位情况。
结果如图3所示。在结合优化条件的基础上，收集了10000个细胞核，并从3个独立流式细胞检测实验中收集数据。利用成像流式细胞仪分析，发现平均转换效率为19.17％(图3F)。野生型悬浮细胞的细胞核仅检测到DAPI荧光(图3A、图3B)，而转基因细胞的细胞核同时检测到GFP和DAPI荧光(图3C、图3D)。
所有样本均提取基因组DNA，采用pBI1300-EGFP F/R引物完成PCR分析。
pBI1300-EGFP F：5′-GTAAACGGCCACAAGTTCAGCG-3′；
pBI1300-EGFP R：5′-GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG-3′；
结果显示扩增产物中存在与egfp基因一致的420bp产物，反映了悬浮细胞中egfp转录的存在(图3E)。
实施例2、基因枪介导的雷公藤遗传转化应用
一、TwFPS1过表达载体构建
1、提取雷公藤的总RNA，反转录为cDNA。
2、以步骤1得到cDNA为模板，采用引物FPS1-att-F和引物FPS1-att-R进行PCR扩增，得到扩增产物。
FPS1-att-F：5′-CACCATGAGCGACACCAAGTCCAAGT-3′；
FPS1-att-R：5′-CTACTTCTCTCGCTTGTATATT-3′。
3、通过BP反应，将步骤2得到的扩增产物导入载体pENTR/SD/D-TOPO，得到含有序列表的序列1所示的双链DNA分子的阳性入门克隆质粒(已经测序验证)。
BP反应体系：步骤2得到的扩增产物0.5μl，Salt Solution 2μl，载体pENTR/SD/D-TOPO 0.5μl。
BP反应条件：25℃反应1h。
4、取步骤3得到的阳性入门克隆质粒，与过表达载体pH7WG2D进行LR反应，得到过表达载体pH7WG2D-TwFPS1。过表达载体pH7WG2D-TwFPS1是将过表达载体pH7WG2D的重组位点间的片段替换为序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组表达载体(已经测序验证)。
LR反应体系：阳性入门克隆质粒(100-300ng)0.4μl，过表达载体pH7WG2D(150ng)1μl，5×LR Clonase reaction buffer 1μl，TE Buffer(pH 8.0)0.6μl。
LR反应条件：25℃反应3h。
二、TwFPS2过表达载体构建
1、提取雷公藤的总RNA，反转录为cDNA。
2、以步骤1得到cDNA为模板，采用引物FPS2-att-F和引物FPS2-att-R进行PCR扩增，得到扩增产物。
FPS2-att-F：5′-CACCATGGCGGATCTCAAGTCAACGT-3′；
FPS2-att-R：5′-CTACTTCTGTCTCTTGTATATC-3′。
3、通过BP反应，将步骤2得到的扩增产物导入载体pENTR/SD/D-TOPO，得到含有序列表的序列2所示的双链DNA分子的阳性入门克隆质粒(已经测序验证)。
BP反应体系：步骤2得到的扩增产物0.5μl，Salt Solution 2μl，载体pENTR/SD/D-TOPO 0.5μl。
BP反应条件：25℃反应1h。
4、取步骤3得到的阳性入门克隆质粒，与过表达载体pH7WG2D进行LR反应，得到过表达载体pH7WG2D-TwFPS2。过表达载体pH7WG2D-TwFPS2是将过表达载体pH7WG2D的重组位点间的片段替换为序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组表达载体(已经测序验证)。
LR反应体系：步骤3得到的阳性入门克隆质粒(100-300ng)0.4μl，过表达载体pH7WG2D(150ng)1μl，5×LR Clonase reaction buffer 1μl，TE Buffer(pH 8.0)0.6μl。
LR反应条件：25℃反应3h。
上述BP反应中的试剂均来自于试剂盒pENTR/SD/D-TOPO Cloning Kit,with OneShot TOP10Chemically Competent E.coliInvitrogen；Invitrogen，货号：K242020。
LR反应反应中的试剂均来自于试剂盒Gateway LR Clonase II Enzyme mix；Invitrogen，货号：11791020。
三、基因枪介导的雷公藤遗传转化
利用基因枪分别将目标载体(TwFPS1过表达载体或TwFPS2过表达载体或过表达载体pH7WG2D)导入雷公藤，具体步骤如下：
1、将步骤一得到的雷公藤悬浮细胞接种于含有0.5mg·L-1 2,4-D+0.1mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA的MS固体培养基(pH 5.8)上预培养(25℃、暗培养)7天。
2、微载体制备：将30mg的金粉中加至1ml 70％(v/v)乙醇水溶液中，涡旋3-5min，室温静置15min，10000rpm离心5min收集沉淀；使用1ml无菌水重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀(重复使用无菌水清洗沉淀两次)；使用500μl50％(v/v)无菌甘油水溶液重悬沉淀，稍混悬2-3s，得到微载体溶液(终浓度为60mg/ml)。
3、DNA的包裹：取50μl步骤2得到的微载体溶液，按顺序加入5μl目标载体DNA(2μg/μl)和50μl2.5M氯化钙水溶液，涡旋振荡2-3min，静置1min，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用140μl 70％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用140μl70％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，10000rpm离心1min，收集沉淀；使用48μl无水乙醇重悬沉淀，轻震荡2-3s，得到包埋微载体。
4、将载体膜置于载体膜支架上，吸取8-10μl步骤3制备的包埋微载体涂布于载体膜(为了避免微载体的聚集，在每次涂布微载体前混悬2-3s)，使用基因枪(PDS1000/He，Bio-Rad)对步骤1预培养的悬浮细胞进行轰击(轰击步骤详见操作手册)，参数设置：目标距离：3cm，轰击压力：1100psi，真空度：28mmHg，轰击次数：3次。
5、完成步骤4后，被轰击后的悬浮细胞在共培养培养基上进行过渡共培养(25℃、暗培养)48h。
6、完成步骤5后，将悬浮细胞转移至选择培养基(MS+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+0.5mg/L IBA+3g/mL蔗糖+7g/L琼脂+2.5mg/L潮霉素，pH 5.8)进行抗性筛选，得到转TwFPS1悬浮细胞(T0)、转TwFPS2悬浮细胞(T0)和转过表达载体pH7WG2D悬浮细胞。
将转TwFPS1悬浮细胞(T0)和转TwFPS2悬浮细胞(T0)继续进行继代培养至T3代。
7、对步骤6得到的转TwFPS1悬浮细胞(T3)和转TwFPS2悬浮细胞(T3)采用PH7 EGFPF/R(扩增egfp基因片段)和Hm F/R(扩增潮霉素抗性基因片段)进行PCR鉴定。
PH7-EGFP F：5′-ACCCTCGTGACCACCCTGAC-3′；
PH7-EGFP R：5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT-3′；
Hm F：5′-CGTTATGTTTATCGGCACT-3′；
HmR：5′-TTGGCGACCTCGTATTGG-3′；
采用转过表达载体pH7WG2D悬浮细胞(Vector)和未转化的悬浮细胞(WT)作为对照。
结果如图4所示。结果表明，转TwFPS1悬浮细胞(T3)和转TwFPS2悬浮细胞(T3)的PCR扩增产物中存在309bp片段(潮霉素基因)和512bp片段(egfp基因)，证实了TwFPS1基因和TwFPS2基因已分别整合到雷公藤悬浮细胞基因组，而野生型(WT)悬浮细胞没有显示PCR扩增条带。
提取步骤6得到的转TwFPS1悬浮细胞(T3)、转TwFPS2悬浮细胞(T3)和未转化的悬浮细胞作的基因组DNA，将基因组DNA采用SacI酶切后进行Southern blot分析。
结果如图5所示。图5中，泳道c为潮霉素抗性基因片段；泳道1为转TwFPS1悬浮细胞(T3)，泳道2为转TwFPS2悬浮细胞(T3)，泳道3为未转化的悬浮细胞。结果表明，在转TwFPS1悬浮细胞(T3)中有3个杂交带，在转TwFPS2悬浮细胞(T3)中有一个杂交带，在未转化悬浮细胞中未检测到杂化条带。
三、转基因细胞TwFPS家族基因相对表达量检测
待测细胞：转TwFPS1悬浮细胞(T0)、转TwFPS1悬浮细胞(T3)、转TwFPS2悬浮细胞(T0)、转TwFPS2悬浮细胞(T3)、未转化的雷公藤悬浮细胞(WT)、转过表达载体pH7WG2D悬浮细胞(Vector)。
提取待测细胞中总RNA，并反转录为cDNA，采用引物qRT-FPS1F和引物qRT-FPS1S组成的引物对检测转TwFPS1悬浮细胞中TwFPS1的表达情况，采用qRT-FPS2F和引物qRT-FPS2S组成的引物对检测转TwFPS2悬浮细胞中TwFPS2的表达情况，采用β-Actin作为内参(采用qRT-β-Actin F和qRT-β-Actin S组成的引物对检测)。
qRT-FPS1F：5′-GGGTGTATTTGCGGAGT-3′；
qRT-FPS1S：5′-CGGCAGAATCTAATGGAG-3′；
qRT-FPS2F：5′-CAGACCCTCACCTTCCATT-3′；
qRT-FPS2S：5′-AAGAGTAACCATAAGCAGCAGAC-3′；
qRT-β-Actin F：5′-AGGAACCACCGATCCAGACA-3′；
qRT-β-Actin S：5′-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3′；
结果如图6所示。在转基因T0代悬浮细胞中TwFPS1和TwFPS2的相对表达量显著增加(P<0.05)，分别比未转化悬浮细胞的提高3.06倍和10.87倍。在转基因T3悬浮细胞中TwFPS1和TwFPS2的相对表达量显著增加(P<0.05)，分别比未转化悬浮细胞提高5.60倍和2.85倍。结果表明，通过粒子轰击过表达TwFPS1和TwFPS2可以显著增强雷公藤悬浮细胞两种基因的相对表达量。
四、转基因细胞雷公藤红素含量检测
待测细胞：转TwFPS1悬浮细胞(T0-T3)、转TwFPS2悬浮细胞(T0-T3)、未转化的雷公藤悬浮细胞(WT)、转过表达载体pH7WG2D悬浮细胞(Vector)。
检测待测细胞中雷公藤红素含量(参照文献：Su P,Cheng Q,Wang X,etal.Characterization of eight terpenoids from tissue,cultures of the Chineseherbal plant,Tripterygium,wilfordii,by high-performance liquid,chromatographycoupled with electrospray,ionization tandem mass spectrometry.[J])。采用WatersACQUITY UPLC系统分析，Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)色谱柱，Waters Separations Module 2695，Waters 2996Photodiode Array Detector检测器，Waters Millennium 32工作站。流动相由A相和B相组成；A相为0.05％(v/v)甲酸水溶液，B相为0.05％(v/v)甲酸乙腈溶液，采用A相和B相进行梯度洗脱，流速为0.4mL/min；柱温为40℃；全波长检测，进样1μL。
雷公藤红素标准品保留时间(RT)为17.668min；
未转化的雷公藤悬浮细胞(WT)中雷公藤红素保留时间(RT)为17.666min；
转过表达载体pH7WG2D悬浮细胞的保留时间为17.625min；
转TwFPS1悬浮细胞的保留时间为17.674min；
转TwFPS2悬浮细胞的保留时间为17.661min。
结果如图7所示。野生型悬浮细胞中雷公藤红素含量为91.73±6.27μg/g，空载转基因细胞中雷公藤红素的含量为148.95±148.95μg/g，过表达TwFPS1悬浮细胞细胞T0代雷公藤红素含量为90.95±6.74μg/g，过表达TwFPS2悬浮细胞细胞T0代雷公藤红素含量为73.70±5.27μg/g。过表达TwFPS1悬浮细胞细胞T1代雷公藤红素含量为235.77±5.11μg/g，过表达TwFPS2悬浮细胞细胞T1代雷公藤红素含量为244.28.08±16.23μg/g。过表达TwFPS1悬浮细胞细胞T2代雷公藤红素含量为355.34±32.29μg/g，过表达TwFPS2悬浮细胞细胞T2代雷公藤红素含量为456.84±23.87μg/g。分别过表达TwFPS1和TwFPS2后，悬浮细胞T3代的雷公藤红素显著升高(P<0.01)，比WT悬浮细胞分别提高3.48倍和10.60倍。
结果表明，通过粒子轰击过表达TwFPS1和TwFPS2可以显著提高雷公藤悬浮细胞中雷公藤红素的含量。
<110> 中国中医科学院中药研究所
<120> 一种基因枪介导的雷公藤遗传转化方法
<160> 4
<210> 1
<211> 1029
<212> DNA
<213> 雷公藤（Tripterygium wilfordii）
<400> 1
atggcggatc tcaagtcaac gttcatgaag gtctactcga ctctcaaatc tgagctgctc 60
gacgatcctg ctttcgagtg gactcccgat tcccgtcaat gggtcgagca gatgttggac 120
tacaatgtgc ctaaagggaa gctgaaccga ggcctctctg tactcgacag ctacaaattg 180
ttgaaagaag gagaggaatt aactgaagag gaaatgtttc ttgcaagctc tcttggttgg 240
tgtattgaat ggcttcaagc atattttctt gttcttgatg acattatgga tggctctcat 300
acacggcgag gtcaaccttg ttggtttaga ttgccaaaga ttggtatgat tgcaataaac 360
gatggggtcg tacttcgtaa tcacattcct agggttctaa gaaaacattt tcgagataag 420
ccttactatg ttgatctgct agatttgttt aatgaggttg agtttcaaac agcctcggga 480
cagatgattg acctgatcac aacacttgaa ggggagaaag atttatccaa atacacgttg 540
tcactccacc gccgcattgt tcagtataaa actgcctatt actcatttta tctatctgtt 600
gcatgtgcat tgctcatgtc tggtgagaaa ctagagaacc atatagatgt caagaacaca 660
cttgttgaca tggggattta ctttcaagta caggatgatt atttggattg ctttggcgat 720
cctgaaacca ttggcaagat aggaacagat attgaagact ttaagtgctc ctggttggtt 780
gttaaagcag tggagctatg taatgaagag caaaagaaag tgctatatga aaactacgga 840
aagccggacc cagccaatgt tgcgaaagtc aaagccctct ataacaagct taaccttgag 900
ggtgtatttg ctgagtatga gagtcaaagc tatgagaaac tcataacttc catcgaagcc 960
catccgagca aggcagtgga agcagtgttg aagtcctttt tggctaagat atacaagaga 1020
cagaagtag 1029
<210> 2
<211> 1029
<212> DNA
<213> 雷公藤（Tripterygium wilfordii）
<400> 2
atgagcgaca ccaagtccaa gttcttggaa gtgtactcta cattgaaatc agagcttctc 60
cacgatcctg ctttcgaatt caccgatgaa tctcgcaaat gggtcgagcg gatgctggat 120
tataatgttc ctggaggaaa gctcaaccga ggactctctg tcattgacag ttacaagtta 180
ttgaaagaag ggaaagaatt gactgatgat gaaatattcc ttgcatctgc acttggttgg 240
tgcattgaat ggcttcaagc atattttctt gttcttgacg atatcatgga caaatctgtt 300
actcggcggg gtcaaccatg ttggttcaga cagccaaaga ttggaatgat tgctgtaaat 360
gacggattga ttcttcgcaa ccatattccc agagttctca agaagcattt tggagggaaa 420
ccttattatg tggatctgct tgatttgttt aatgaggtgg aattccaaac tgcctccgga 480
caaatgatag atctaatcac cacacatgaa ggagagaaag atctatcaaa gtactctttg 540
cctcttcacc atcgcattgt tcagtacaaa actgcttatt attcgtttta tcttcctgtt 600
gcatgtgctt tgcttatgac cggtgagaat cttgacaatc atattgaagt gaagagcatc 660
cttattgaga tgggaaccta tttccaagta caggatgatt acctggactg ttttggggat 720
cctgaagtaa ttggaaaggt tggaactgat attgaagatt ttaagtgctc gtggttggta 780
gtaaaagcac ttgaacgggc tagcgaggag caaaagcgat tgctacatga aaactacggg 840
aacgcagatc ctgcttgtgt tgcaaaagtt aaagaacttt atatggcttt agatcttcag 900
ggtgtatttg cggagtatga gaggacgagc tacgagaaca taattaaacg cattgaagct 960
catccaagta aggctgtgca agatgtgttg aagtccttcc tgaagaaaat atacaagcga 1020
gagaagtag 1029
<210> 3
<211> 342
<212> PRT
<213> 雷公藤（Tripterygium wilfordii）
<400> 3
Met Ala Asp Leu Lys Ser Thr Phe Met Lys Val Tyr Ser Thr Leu Lys
1 5 10 15
Ser Glu Leu Leu Asp Asp Pro Ala Phe Glu Trp Thr Pro Asp Ser Arg
20 25 30
Gln Trp Val Glu Gln Met Leu Asp Tyr Asn Val Pro Lys Gly Lys Leu
35 40 45
Asn Arg Gly Leu Ser Val Leu Asp Ser Tyr Lys Leu Leu Lys Glu Gly
50 55 60
Glu Glu Leu Thr Glu Glu Glu Met Phe Leu Ala Ser Ser Leu Gly Trp
65 70 75 80
Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Met
85 90 95
Asp Gly Ser His Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Leu Pro
100 105 110
Lys Ile Gly Met Ile Ala Ile Asn Asp Gly Val Val Leu Arg Asn His
115 120 125
Ile Pro Arg Val Leu Arg Lys His Phe Arg Asp Lys Pro Tyr Tyr Val
130 135 140
Asp Leu Leu Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe Gln Thr Ala Ser Gly
145 150 155 160
Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Leu Glu Gly Glu Lys Asp Leu Ser
165 170 175
Lys Tyr Thr Leu Ser Leu His Arg Arg Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala
180 185 190
Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Ser Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Ser Gly
195 200 205
Glu Lys Leu Glu Asn His Ile Asp Val Lys Asn Thr Leu Val Asp Met
210 215 220
Gly Ile Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Asp
225 230 235 240
Pro Glu Thr Ile Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Lys Cys
245 250 255
Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Val Glu Leu Cys Asn Glu Glu Gln Lys
260 265 270
Lys Val Leu Tyr Glu Asn Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Ala Asn Val Ala
275 280 285
Lys Val Lys Ala Leu Tyr Asn Lys Leu Asn Leu Glu Gly Val Phe Ala
290 295 300
Glu Tyr Glu Ser Gln Ser Tyr Glu Lys Leu Ile Thr Ser Ile Glu Ala
305 310 315 320
His Pro Ser Lys Ala Val Glu Ala Val Leu Lys Ser Phe Leu Ala Lys
325 330 335
Ile Tyr Lys Arg Gln Lys
340
<210> 4
<211> 342
<212> PRT
<213> 雷公藤（Tripterygium wilfordii）
<400> 4
Met Ser Asp Thr Lys Ser Lys Phe Leu Glu Val Tyr Ser Thr Leu Lys
1 5 10 15
Ser Glu Leu Leu His Asp Pro Ala Phe Glu Phe Thr Asp Glu Ser Arg
20 25 30
Lys Trp Val Glu Arg Met Leu Asp Tyr Asn Val Pro Gly Gly Lys Leu
35 40 45
Asn Arg Gly Leu Ser Val Ile Asp Ser Tyr Lys Leu Leu Lys Glu Gly
50 55 60
Lys Glu Leu Thr Asp Asp Glu Ile Phe Leu Ala Ser Ala Leu Gly Trp
65 70 75 80
Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Met
85 90 95
Asp Lys Ser Val Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Gln Pro
100 105 110
Lys Ile Gly Met Ile Ala Val Asn Asp Gly Leu Ile Leu Arg Asn His
115 120 125
Ile Pro Arg Val Leu Lys Lys His Phe Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val
130 135 140
Asp Leu Leu Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe Gln Thr Ala Ser Gly
145 150 155 160
Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr His Glu Gly Glu Lys Asp Leu Ser
165 170 175
Lys Tyr Ser Leu Pro Leu His His Arg Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala
180 185 190
Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Thr Gly
195 200 205
Glu Asn Leu Asp Asn His Ile Glu Val Lys Ser Ile Leu Ile Glu Met
210 215 220
Gly Thr Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Asp
225 230 235 240
Pro Glu Val Ile Gly Lys Val Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Lys Cys
245 250 255
Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu Arg Ala Ser Glu Glu Gln Lys
260 265 270
Arg Leu Leu His Glu Asn Tyr Gly Asn Ala Asp Pro Ala Cys Val Ala
275 280 285
Lys Val Lys Glu Leu Tyr Met Ala Leu Asp Leu Gln Gly Val Phe Ala
290 295 300
Glu Tyr Glu Arg Thr Ser Tyr Glu Asn Ile Ile Lys Arg Ile Glu Ala
305 310 315 320
His Pro Ser Lys Ala Val Gln Asp Val Leu Lys Ser Phe Leu Lys Lys
325 330 335
Ile Tyr Lys Arg Glu Lys
340

Claims (3)

1.一种雷公藤的遗传转化的方法，包括如下步骤：采用基因枪法将含有目的基因的质粒导入雷公藤悬浮细胞；
所述基因枪法中，基因枪轰击的参数设置如下：DNA浓度：2µg/µl；轰击次数：3次；目标距离：3cm；轰击压力：1100psi；真空度：28mmHg；所述基因枪法中，完成基因枪轰击后，共培养的时间为48h；所述基因枪法中，用微载体和含有目的基因的质粒制备包埋微载体时，采用的沉淀剂为氯化钙或氯化钙溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共培养采用共培养培养基；所述共培养培养基由溶质和溶剂组成；溶质及其在共培养培养基中的浓度为4.43g/L MS，0.5 mg/L 2,4- D，0.1 mg/L KT，0.5 mg/L IBA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂；溶剂为水。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述雷公藤悬浮细胞在转化前采用预培养基进行预培养；所述预培养基为含有0.5mg·L-1 2,4-D、0.1 mg·L-1 KT和 0.5mg·L-1IBA的MS固体培养基。
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