CN109182333A - 一种蓝果忍冬基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种蓝果忍冬基因组DNA提取方法属于分子生物学，该方法主要包括以下步骤：首先破碎细胞壁和细胞膜，使DNA充分释放到缓冲液中；其次消除蛋白质、多糖、色素等杂质的干扰；最后防止DNA的降解。用SET核分离缓冲液对样品进行处理，可以很好的将细胞核与上清液中的多糖和多酚等次生物质分开，在研磨过程中加入的PVP以及在后续过程中加入的β‑巯基乙醇，可以有效的防止多酚物质的氧化，氯仿/异戊醇抽提时，中间加入稀释的CTAB以除去多糖。忍冬科植物叶片中含有丰富的糖类和多酚类物质，这些物质会影响DNA的提取效果，而且对PCR时的Tag酶的活性产生影响，通过这种基因组DNA提取方法，获得了产量高、质量好的DNA，DNA电泳条带清晰明亮，无拖尾现象，能够满足进一步的分子水平的研究。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，主要涉及一种蓝果忍冬基因组DNA提取方法。
背景技术：
植物DNA提取是一项常规的实验技术，但是对于多糖和酚类物质含量较高的植物及组织，其提取工作并不容易，可能花去大量的时间和精力而得不到理想的DNA。DNA提取的最根本要求是保持核酸的完整性，基因组DNA产品的分子量应在50kb以上，而在DNA提取过程中，有许多因素能导致DNA降解成小片段，如机械张力或高温很容易使DNA分子发生断裂，因此，在操作时应尽可能轻缓、温和，尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡，以减少机械张力对DNA的损伤。DNA酶可降解DNA，而Ca2+和Mg2+是DNA酶的辅因子，为避免和钝化DNA酶的作用，在溶液中常加入EDTA，以螯合Ca2+和Mg2+。pH值也会影响DNA的产量和质量，如在过酸的条件下，由于DNA脱嘌呤而导致DNA的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂，因此，在DNA 的过程中，应避免使用过酸的条件。
提取植物DNA的过程中最为关键的有三个部分，首先破碎细胞壁和细胞膜，使DNA充分释放到缓冲液中；其次消除蛋白质、多糖、色素等杂质的干扰；最后防止DNA的降解。蓝果忍冬叶片富含多糖、多酚等次生代谢产物，这些物质与DNA的不可逆结合会严重影响Tag聚合酶的活性。本实验首先用SET核分离缓冲液对样品进行预洗，可有效地将细胞核(沉淀中)与上清液中的多糖及多酚等次生物质分开。实验中发现，预洗后的样品在进行抽提时，上相颜色明显变浅，极易与有机相分层，所得DNA外观质量也有显著改善。提取液中增加酚类络合剂PVP和抗氧化剂β-巯基乙醇的用量，可有效地控制酚类物质的氧化褐变及 DNA降解。β-巯基乙醇不但可以作为强还原剂防止多酚氧化，还可以打断多酚氧化酶的二硫键使之失活。大多数的报道是在提取液中加入水溶性PVP，但在实验中发现，这不能完全解决DNA变褐的问题。而直接在液氮研磨样品时加入PVP粉末，从根本上解决酚类物质的氧化问题，提取出的DNA呈白色，易溶于双蒸水中。氯仿/异戊醇抽提时，中间加入一定浓度的CTAB以去除多糖。用高浓度钠盐(NaAC)和-20℃冷藏的无水乙醇沉淀DNA。沉淀时间不宜过长，以防止杂质与DNA共沉淀影响纯度。本研究针对蓝果忍冬叶片组织的特点，对常规CTAB法进行改良，结果获得了产量高、质量好的DNA，用此方法提取的DNA能够满足进一步的分子水平的研究。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种蓝果忍冬基因组DNA提取方法，以获得了产量高、质量好的DNA，满足进一步的分子水平的研究。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
1、一种蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)取少量叶片于预冷研钵中，加入少量PVP粉末，液氮研磨后立即加入一定体积SET核分离缓冲液，迅速研磨成匀浆，小心转入2mL离心管中。一定温度下静置10min，离心，弃上清。
(2)沉淀加入一定体积的提前预热的2×CTAB提取缓冲液，再加入适当体积的β-巯基乙醇，混匀，水浴 1h，期间轻缓，摇动数次。
(3)水浴后冷却至室温，加入一定体积氯仿/异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，离心。
(4)取上清液至另一管中，加入一定体积预热的一定浓度的CTAB溶液混匀，再加入等体积氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，离心。重复抽提1～2次，直至界面无明显的蛋白沉淀。
(5)取上清，加入一定体积适当浓度的NaAC(pH＝5.2)混匀，再加入适当体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min后可见白色丝絮状沉淀析出。
(6)离心弃上清，用1mL适当浓度的乙醇清洗两次，室温干燥后溶于一定体积的ddH2O中，加入一定体积RNase(10mg/mL)酶液一定温度下消化。
(7)加入一定体积的氯仿/异戊醇轻轻颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min室温离心10min。
(8)重复步骤(5)，离心弃上清，沉淀用1mL适当浓度乙醇洗两次，室温干燥后溶于适量ddH2O中，-20℃保存备用。
2、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的叶片质量为0.1-0.35 g，SET核分离缓冲液体积为0.7-1.2mL，静置的温度条件为2-8℃，离心条件为4℃,4000r/min离心10 min。
3、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)所述的2×CTAB提取缓冲液预热条件为60-65℃，所加的2×CTAB体积为700-1000μL，所加β-巯基乙醇体积为1-10μL，水浴温度为60-65℃。
4、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(3)所述的氯仿/异戊醇混合液体积为700-1000μL，氯仿/异戊醇混合液配比为22/3-24/1，离心条件为12000r/min室温离心10min。
5、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(4)所述的CTAB溶液浓度为10-15％，所加的CTAB溶液体积为上清液体积的1/8-1/10，氯仿/异戊醇混合液配比为22/3-24/1，离心条件为室温12000r/min离心10min。
6、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(5)所述的NaAC(pH＝5.2) 物质的量浓度为1-5mol/L，NaAC溶液所加体积为1/5-1/10，所加无水乙醇体积为上清液体积1-3倍。
7、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(6)所述的离心条件为4℃12000 r/min离心10min，所加乙醇浓度为70-95％，所加ddH2O体积为400-600μL，所加RNase(10mg/mL)酶液体积为1-5μL，酶液消化条件为37℃消化1h。
8、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(7)所述的氯仿/异戊醇混合配比为22/3-24/1，氯仿/异戊醇混合液所加体积为400-800μl，离心条件为12000r/min室温离心10 min。
9、根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(8)所述的离心条件为4℃,10000 r/min离心10min，所加乙醇浓度为70-95％。
一种蓝果忍冬基因组DNA提取方法属于分子生物学，该方法主要包括以下步骤：首先破碎细胞壁和细胞膜，使DNA充分释放到缓冲液中；其次消除蛋白质、多糖、色素等杂质的干扰；最后防止DNA的降解。用SET核分离缓冲液对样品进行处理，可以很好的将细胞核与上清液中的多糖和多酚等次生物质分开，在研磨过程中加入的PVP以及在后续过程中加入的β-巯基乙醇，可以有效的防止多酚物质的氧化，氯仿/异戊醇抽提时，中间加入稀释的CTAB以除去多糖。忍冬科植物叶片中含有丰富的糖类和多酚类物质，这些物质会影响DNA的提取效果，而且对PCR时的Tag酶的活性产生影响，通过这种基因组DNA提取方法，获得了产量高、质量好的DNA，DNA电泳条带清晰明亮，无拖尾现象，能够满足进一步的分子水平的研究。
附图说明
附图1为本技术路线图。
具体实施方式
实施例1：
(1)取叶片0.1g于预冷研钵中，加入少量PVP粉末，液氮研磨后立即加入0.7-1.2mLSET核分离缓冲液，迅速研磨成匀浆，小心转入2mL离心管中。2-8℃静置10min，4℃,4000r/min离心10min，弃上清。
(2)沉淀加入700-1000μl 60-65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，再加入1-10μL的β-巯基乙醇，混匀， 60-65℃水浴1h，期间轻缓，摇动数次。
(3)水浴后冷却至室温，加入700-1000μL氯仿/异戊醇(22:3)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心10min。
(4)取上清液至另一管中，加入1/8-1/10体积预热的10-15％CTAB溶液混匀，再加入等体积氯仿/异戊醇(22:3)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心10min。重复抽提1～2次，直至界面无明显的蛋白沉淀。
(5)取上清，加入1/5-1/10体积1-5mol/L NaAC(pH＝5.2)混匀，再加入1-3倍体积预冷的无水乙醇， -20℃放置30min后可见白色丝絮状沉淀析出。
(6)12000r/min,4℃离心10min，弃上清，用1mL 70-95％乙醇清洗两次，室温干燥后溶于400-600 μL ddH2O中，加入1-5μL的RNase(10mg/mL)酶液35-42℃消化1h。
(7)加入400-800μL的氯仿/异戊醇(22:3)轻轻颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min室温离心 10min。
(8)重复步骤(5)，10000r/min 4℃离心10min，弃上清，沉淀用1mL 70-95％乙醇洗两次，室温干燥后溶于适量ddH2O中，-20℃保存备用。
实例二：
(1)取叶片0.1-0.35g于预冷研钵中，加入少量PVP粉末，液氮研磨后立即加入0.7-1.2mL SET核分离缓冲液，迅速研磨成匀浆，小心转入2mL离心管中。2-8℃静置10min，4℃,4000r/min离心10min，弃上清。
(2)沉淀加入700-1000μL,60-65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，再加入1-10μL的β-巯基乙醇，混匀， 60-65℃水浴1h，期间轻缓，摇动数次。
(3)水浴后冷却至室温，加入700-1000μL氯仿/异戊醇(23:2)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心 10min。
(4)取上清液至另一管中，加入1/8-1/10体积预热的10-15％CTAB溶液混匀，再加入等体积氯仿/异戊醇(23:2)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心10min。重复抽提1～2次，直至界面无明显的蛋白沉淀。
(5)取上清，加入1/5-1/10体积1-5mol/L NaAC(pH＝5.2)混匀，再加入1-3倍体积预冷的无水乙醇， -20℃放置30min后可见白色丝絮状沉淀析出。
(6)12000r/min 4℃离心10min，弃上清，用1mL 70-95％乙醇清洗两次，室温干燥后溶于400-600μL ddH2O中，加入1-5μL的RNase(10mg/mL)酶液35-42℃消化1h。
(7)加入400-800μL的氯仿/异戊醇(23:2)轻轻颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min室温离心 10min。
(8)重复步骤(5)，10000r/min 4℃离心10min，弃上清，沉淀用1mL 70-95％乙醇洗两次，室温干燥后溶于适量ddH2O中，-20℃保存备用。
实例三：
(1)取叶片0.1-0.35g于预冷研钵中，加入少量PVP粉末，液氮研磨后立即加入0.7-1.2mL的SET核分离缓冲液，迅速研磨成匀浆，小心转入2mL离心管中。2-8℃静置10min，4℃，4000r/min离心10min，弃上清。
(2)沉淀加入700-1000μL,60-65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，再加入1-10μL的β-巯基乙醇，混匀， 60-65℃水浴1h，期间轻缓，摇动数次。
(3)水浴后冷却至室温，加入700-1000μL氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心 10min。
(4)取上清液至另一管中，加入1/8-1/10体积预热的10-15％CTAB溶液混匀，再加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀，12000r/min室温离心10min。重复抽提1～2次，直至界面无明显的蛋白沉淀。
(5)取上清，加入1/5-1/10体积1-5mol/L NaAC(pH＝5.2)混匀，再加入1-3倍体积预冷的无水乙醇， -20℃放置30min后可见白色丝絮状沉淀析出。
(6)12000r/min 4℃离心10min，弃上清，用1mL 70-95％乙醇清洗两次，室温干燥后溶于400-600 μL ddH2O中，加入1-5μL的RNase(10mg/mL)酶液35-42℃消化1h。
(7)加入400-800μL的氯仿/异戊醇(24:1)轻轻颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min室温离心 10min。
(8)重复步骤(5)，10000r/min 4℃离心10min，弃上清，沉淀用1mL 70-95％乙醇洗两次，室温干燥后溶于适量ddH2O中，-20℃保存备用。
Claims (9)
1.一种蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)取少量叶片于预冷研钵中，加入少量PVP粉末，液氮研磨后立即加入一定体积SET核分离缓冲液，迅速研磨成匀浆，小心转入2mL离心管中，一定温度下静置10min，离心，弃上清；
(2)沉淀加入一定体积的提前预热的2×CTAB提取缓冲液，再加入适当体积的β-巯基乙醇，混匀，水浴1h，期间轻缓，摇动数次；
(3)水浴后冷却至室温，加入一定体积氯仿/异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，离心；
(4)取上清液至另一管中，加入一定体积预热的一定浓度的CTAB溶液混匀，再加入等体积氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，离心，重复抽提1～2次，直至界面无明显的蛋白沉淀；
(5)取上清，加入一定体积适当浓度的NaAC(pH＝5.2)混匀，再加入适当体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min后可见白色丝絮状沉淀析出；
(6)离心弃上清，用1mL适当浓度的乙醇清洗两次，室温干燥后溶于一定体积的ddH2O中，加入一定体积RNase(10mg/mL)酶液一定温度下消化；
(7)加入一定体积的氯仿/异戊醇轻轻颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min室温离心10min；
(8)重复步骤(5)，离心弃上清，沉淀用1mL适当浓度乙醇洗两次，室温干燥后溶于适量ddH2O中，-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的叶片质量为0.1-0.35g，SET核分离缓冲液体积为0.7-1.2mL，静置的温度条件为2-8℃，离心条件为4℃4000r/min离心10min。
3.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)所述的2×CTAB提取缓冲液预热条件为60-65℃，所加的2×CTAB体积为700-1000μL，所加β-巯基乙醇体积为1-10μL，水浴温度为60-65℃。
4.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(3)所述的氯仿/异戊醇混合液体积为700-1000μL，氯仿/异戊醇混合液配比为22/3-24/1，离心条件为12000r/min室温离心10min。
5.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(4)所述的CTAB溶液浓度为10-15％，所加的CTAB溶液体积为上清液体积的1/8-1/10，氯仿/异戊醇混合液配比为22/3-24/1，离心条件为室温12000r/min离心10min。
6.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(5)所述的NaAC(pH＝5.2)物质的量浓度为1-5mol/L，NaAC溶液所加体积为1/5-1/10，所加无水乙醇体积为上清液体积1-3倍。
7.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(6)所述的离心条件为4℃12000r/min离心10min，所加乙醇浓度为70-95％，所加ddH2O体积为400-600μL，所加RNase(10mg/ml)酶液体积为1-5μL，酶液消化条件为35-42℃消化1h。
8.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(7)所述的氯仿/异戊醇混合配比为22/3-24/1，氯仿/异戊醇混合液所加体积为400-800μL，离心条件为12000r/min室温离心10min。
9.根据权利要求1所述的蓝果忍冬基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(8)所述的离心条件为4℃10000r/min离心10min，所加乙醇浓度为70-95％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190111 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |