CN111286501A

CN111286501A - 一种有效提取海滨木槿基因组的方法

Info

Publication number: CN111286501A
Application number: CN202010275306.3A
Authority: CN
Inventors: 吴冬晴
Original assignee: Jiaxing Frasergen Information Co ltd
Current assignee: Jiaxing Frasergen Information Co ltd
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2040-04-09
Also published as: CN111286501B

Abstract

本发明公开了一种有效提取海滨木槿基因组的方法，通过在常规的基因组提取方法CTAB法中，增加了一步预裂解，使组织中的难溶物质释放出来，然后利用提取缓冲液进行清洗，清洗过后，提取液的粘稠程度有了极大的改善，在后续的建库上机中，也证明了此方法很好的去除了大部分的杂质，磁珠纯化步骤也相对容易，本发明涉及生物基因技术领域。该有效提取海滨木槿基因组的方法，避免出现在研磨加入裂解液后，提取液变得异常粘稠，最终得到的DNA存在大量的不溶物的情况，防止提取出的DNA无法进行后续建库、上机中的纯化和PCR等步骤，可使提取的DNA不再粘稠，样本正常，提取过程也相对容易，更加高效，同时也方便了后续的建库上机等相关操作。

Description

一种有效提取海滨木槿基因组的方法

技术领域

本发明涉及生物基因技术领域，具体为一种有效提取海滨木槿基因组的方法。

背景技术

海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.[Yellow Hibiscus])，锦葵科，木槿属。别名海槿、海塘苗木、日本黄槿。一般生长于海滨盐碱地。花色金黄，鲜艳美丽，是优良的庭园绿化苗木，也是良好的防风固沙、固堤防潮苗木，可作海岸防护林。海滨木槿极耐盐碱，耐海潮间歇性淹没和海浪溅泼，又耐瘠薄，根系发达，具有较强的抗风和消浪性能，能大大减少海浪溅泼冲刷海堤，可作为抗风护塘固堤的先锋树种和水土保持林树种。

植物基因组的提取方法主要为CTAB法，而类似于海滨木槿这种含有多糖多酚等次生代谢产物的植物，在对其DNA提取过程中，多酚类物质极易氧化，氧化后的产物与DNA分子发生不可逆结合，同时多糖又与DNA形成粘稠的胶状复合物，使提取的DNA样品不仅呈棕褐色难于溶解，而且也不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的失败，以致使海滨木槿的分子生物学研究进展缓慢。

目前，在木槿DNA提取方面很多人进行了研究，但大多是针对幼叶，并且蛋白去除也不够彻底，为了进行木槿的基因克隆研究，本发明针对木槿的多酚和多糖的特性以CTAB法为基础进行了不同的改良，对其叶片DNA的提取进行了研究。

本发明在常规的基因组提取方法CTAB法中，增加了一步预裂解，使组织中的难溶物质释放出来，然后利用提取缓冲液进行清洗，清洗过后，提取液的粘稠程度有了极大的改善，在后续的建库上机中，也证明了此方法很好的去除了大部分的杂质，磁珠纯化步骤也相对容易。而普通植物基因组的提取方法为CTAB法，用此常规的方法提取时，都会出现在研磨加入裂解液后，提取液变得异常粘稠，最终得到的DNA存在大量的不溶物，导致提取出的DNA无法进行后续建库、上机中的纯化、PCR等步骤。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种有效提取海滨木槿基因组的方法，该方法成本低、易操作、并最终获得较高质量的基因组，方便后续的建库、上机以及PCR反应。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种有效提取海滨木槿基因组的方法，具体包括以下步骤：

S1、取适量木槿叶片，去除叶脉，将去除叶脉的叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取适量的粉末放入离心管中；

S2、加入裂解缓冲液1，在65℃水浴5min；

S3、在步骤S2后离心去除上清；

S4、离心后的样品加入提取缓冲液以及β-ME，充分混匀后室温静止10min；

S5、离心弃上清；

S6、弃上清后的样品中加入裂解缓冲液2，在65℃水浴1h；

S7、水浴结束后加入等体积酚、氯仿和异戊醇，并抽提一次；

S8、离心后上清加入等体积氯仿和异戊醇，并抽提一次；

S9、离心后上清加入0.7倍的异丙醇，混匀后沉淀10min；

S10、离心后用75％的乙醇清洗沉淀2次；

S11、加入适量的10mM Tris-HCl溶解。

优选的，所述步骤S2中裂解缓冲液1为3％的CTAB以及β-ME。

优选的，所述步骤S6中裂解缓冲液2为2％的CTAB以及β-ME。

优选的，所述步骤S7中酚、氯仿和异戊醇的等体积比为25:24:1。

优选的，所述步骤S8中氯仿和异戊醇的等体积比为24:1。

优选的，所述裂解缓冲液1的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4MNaCl、3％(W/V)CATB、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。

优选的，所述步骤S4中提取缓冲液的配方为：0.7M NaCl、0.4M葡萄糖、3％(W/V)PVP。

优选的，所述裂解缓冲液2的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4MNaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇。

(三)有益效果

本发明提供了一种有效提取海滨木槿基因组的方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该有效提取海滨木槿基因组的方法，具体包括以下步骤：S1、取适量木槿叶片，去除叶脉，将去除叶脉的叶片放入研钵中，利用液氮研磨成粉状，研磨结束后取适量的粉末放入离心管中，S2、加入裂解缓冲液1，在65℃水浴5min，S3、在步骤S2后离心去除上清，S4、离心后的样品加入提取缓冲液以及β-ME，充分混匀后室温静止10min，S5、离心弃上清，S6、弃上清后的样品中加入裂解缓冲液2，在65℃水浴1h，S7、水浴结束后加入等体积酚、氯仿和异戊醇，并抽提一次，S8、离心后上清加入等体积氯仿和异戊醇，并抽提一次，S9、离心后上清加入0.7倍的异丙醇，混匀后沉淀10min，S10、离心后用75％的乙醇清洗沉淀2次，S11、加入适量的10mM Tris-HCl溶解，可实现通过在常规的基因组提取方法CTAB法中，增加了一步预裂解，使组织中的难溶物质释放出来，然后利用提取缓冲液进行清洗，清洗过后，提取液的粘稠程度有了极大的改善，在后续的建库上机中，也证明了此方法很好的去除了大部分的杂质，磁珠纯化步骤也相对容易，很好的避免了出现在研磨加入裂解液后，提取液变得异常粘稠，最终得到的DNA存在大量的不溶物的情况，防止提取出的DNA无法进行后续建库、上机中的纯化和PCR等步骤，通过先进行细胞预裂解，然后用PVP与裂解液中的多糖多酚结合，可去除DNA中的杂质，再进行一步裂解，可有效的去除木槿DNA中的杂质，可使提取的DNA不再粘稠，样本正常，提取过程也相对容易，更加高效，同时也方便了后续的建库上机等相关操作。

附图说明

图1为本发明木槿基因组DNA提取示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明实施例提供一种技术方案：一种有效提取海滨木槿基因组的方法，具体包括以下步骤：

S2、加入裂解缓冲液1，在65℃水浴5min，裂解缓冲液1为3％的CTAB以及β-ME，裂解缓冲液1的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、3％(W/V)CATB、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；

S3、在步骤S2后离心去除上清；

S4、离心后的样品加入提取缓冲液以及β-ME，充分混匀后室温静止10min，提取缓冲液的配方为：0.7M NaCl、0.4M葡萄糖、3％(W/V)PVP；

S5、离心弃上清；

S6、弃上清后的样品中加入裂解缓冲液2，在65℃水浴1h，裂解缓冲液2为2％的CTAB以及β-ME，裂解缓冲液2的配方为：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；

S7、水浴结束后加入等体积酚、氯仿和异戊醇，并抽提一次，酚、氯仿和异戊醇的等体积比为25:24:1；

S8、离心后上清加入等体积氯仿和异戊醇，并抽提一次，氯仿和异戊醇的等体积比为24:1；

S9、离心后上清加入0.7倍的异丙醇，混匀后沉淀10min；

S10、离心后用75％的乙醇清洗沉淀2次；

S11、加入适量的10mM Tris-HCl溶解。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

PVP：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时，也能和多糖结合，有效去除多糖。

由图1所示，泳道1为预裂解和清洗后提取的木槿基因组DNA，泳道2为常规CTAB法提取的木槿基因组DNA，用常规的CTAB法进行提取，因为原始样本中的杂质过多，导致提取的DNA粘稠，电泳2号孔条带显示拖带；而利用本方法在增加了预裂解液和清洗步骤后，电泳1号孔显示提取的DNA不再粘稠了，样本正常，提取过程也相对容易，高效了很多，同时后续的建库上机等相关操作也方便了不少。

综上，本发明可实现通过在常规的基因组提取方法CTAB法中，增加了一步预裂解，使组织中的难溶物质释放出来，然后利用提取缓冲液进行清洗，清洗过后，提取液的粘稠程度有了极大的改善，在后续的建库上机中，也证明了此方法很好的去除了大部分的杂质，磁珠纯化步骤也相对容易，很好的避免了出现在研磨加入裂解液后，提取液变得异常粘稠，最终得到的DNA存在大量的不溶物的情况，防止提取出的DNA无法进行后续建库、上机中的纯化和PCR等步骤，通过先进行细胞预裂解，然后用PVP与裂解液中的多糖多酚结合，可去除DNA中的杂质，再进行一步裂解，可有效的去除木槿DNA中的杂质，可使提取的DNA不再粘稠，样本正常，提取过程也相对容易，更加高效，同时也方便了后续的建库上机等相关操作。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

S2、加入裂解缓冲液1，在65℃水浴5min；

S3、在步骤S2后离心去除上清；

S5、离心弃上清；

S6、弃上清后的样品中加入裂解缓冲液2，在65℃水浴1h；

S8、离心后上清加入等体积氯仿和异戊醇，并抽提一次；

S9、离心后上清加入0.7倍的异丙醇，混匀后沉淀10min；

S10、离心后用75％的乙醇清洗沉淀2次；

S11、加入适量的10mM Tris-HCl溶解。

2.根据权利要求1所述的一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：所述步骤S2中裂解缓冲液1为3％的CTAB以及β-ME。

3.根据权利要求1所述的一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：所述步骤S6中裂解缓冲液2为2％的CTAB以及β-ME。

4.根据权利要求1所述的一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：所述步骤S7中酚、氯仿和异戊醇的等体积比为25:24:1。

5.根据权利要求1所述的一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：所述步骤S8中氯仿和异戊醇的等体积比为24:1。

6.根据权利要求2所述的一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：所述裂解缓冲液1的配方为：100mM Tris-HCl、20mM EDTA、1.4M NaCl、3％CATB、0.4％β-巯基乙醇。

7.根据权利要求1所述的一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：所述步骤S4中提取缓冲液的配方为：0.7M NaCl、0.4M葡萄糖、3％PVP。

8.根据权利要求3所述的一种有效提取海滨木槿基因组的方法，其特征在于：所述裂解缓冲液2的配方为：100mM Tris-HCl、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％CATB、20％PVP、0.4％β-巯基乙醇。