CN112063618A - 一种改良ctab裂解液在提取板蓝根根系总rna中的应用 - Google Patents

一种改良ctab裂解液在提取板蓝根根系总rna中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112063618A
CN112063618A CN202011090386.1A CN202011090386A CN112063618A CN 112063618 A CN112063618 A CN 112063618A CN 202011090386 A CN202011090386 A CN 202011090386A CN 112063618 A CN112063618 A CN 112063618A
Authority
CN
China
Prior art keywords
total rna
root
root system
isatis
extraction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011090386.1A
Other languages
English (en)
Inventor
吴冬晴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Frasergen Information Co ltd
Original Assignee
Wuhan Frasergen Information Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Frasergen Information Co ltd filed Critical Wuhan Frasergen Information Co ltd
Priority to CN202011090386.1A priority Critical patent/CN112063618A/zh
Publication of CN112063618A publication Critical patent/CN112063618A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种改良CTAB裂解液在提取板蓝根根系总RNA中的应用，属于分子生物学技术领域。所述改良CTAB裂解液包括100mM Tris‑HCl，pH为8，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％W/V的CATB，20％W/V的PVP和0.4％V/V的β‑巯基乙醇。本发明运用改良CTAB裂解液提取板蓝根根系成功地获得的总RNA，有效克服了粘稠状的缺陷，去除了杂质，并且提取成本低、易操作、并能获得高质量的RNA，方便后续的建库、上机以及PCR反应。

Description

一种改良CTAB裂解液在提取板蓝根根系总RNA中的应用
【技术领域】
本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种改良CTAB裂解液在提取板蓝根根系总RNA中的应用。
【背景技术】
板蓝根(Isatis tinctoria)是十字花科(Cruciferae)崧蓝属(Isatis)的陆生植物，其根系具有较好的药用价值。由于在药用植物基因研究中所用的实验材料多为根、根茎等木质化程度较高的材料，难于粉碎，而且其所含的多糖易与RNA共沉淀，多酚易被氧化形成醌类物质与RNA不可逆的结合，这些次生代谢产物对RNA的提取造成了很大的干扰。而高质量的RNA提取是进行分子生物学实验的必要前提，如转录组测序等。因此，探索板蓝根根系高质量的RNA提取方法具有重要意义。
现常用的植物RNA提取方法包括CTAB法，TRizol试剂盒法以及很多RNA提取试剂盒等，但由于不同植物或者同一植物的不同组织间存在物质组成上的千差万别，因此上述方法并不适用用所有材料，对于一些植物材料，还需要逐渐优化合适的提取方法。比如，利用天根的多糖多酚植物提取试剂盒(DP441)来提取板蓝根根系的RNA并不成功，从提取的RNA样品来看，呈粘稠状，且底部明显不溶于DEPC水的杂质。此方法不能满足板蓝根相关分子生物学实验的需要。
因此，有必要寻找一种针对性更强的能提出高质量板蓝根根系总RNA的方法，基于CTAB法中的CTAB裂解液进行改良，解决分离的RNA杂质多，纯度低等问题，并满足低成本、易操作、并最终获得较高质量的基因组，方便后续的建库、上机以及PCR反应。
【发明内容】
本发明目的在于克服现有技术的不足而提供一种改良CTAB裂解液在提取板蓝根根系总RNA中的应用，解决提取杂质多、纯度低等问题。
本发明提供了一种改良CTAB裂解液在提取板蓝根根系总RNA中的应用，所述改良CTAB裂解液包括100mM Tris-HCl，pH为8，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％W/V的CATB，20％W/V的PVP和0.4％V/V的β-巯基乙醇。
本发明还提供了一种板蓝根根系总RNA的提取方法，包括如下步骤：
1.液氮中取板蓝根根部组织研磨成粉末，取粉末放入无RNA酶的离心管中；
2.加入裂解液，充分混匀，孵育得到混合液；
3.孵育混合液中加入等体积的抽提试剂进行抽提，离心获抽提上清液；
4.向抽提上清液加入异丙醇，混匀后室温沉淀，离心得总RNA沉淀；
5.向总RNA沉淀中加入醇溶液清洗，得到沉淀物；
6.加入含DNaseA的Nuclease-free水对所得沉淀物进行溶解，获得植物总RNA。
在一种实施方式中，所述裂解液为权利要求1中所述改良CTAB裂解液。
在一种实施方式中，所述裂解液以0.1mL/0.1-0.2g板蓝根根部的量加入。
在一种实施方式中，所述无RNA酶以2mL/0.1-0.2g板蓝根根部的量加入。
在一种实施方式中，所述抽提试剂为体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇混合试剂。
在一种实施方式中，所述步骤2孵育条件为65℃孵育15min。
在一种实施方式中，所述步骤3中离心条件为4℃12000rpm离心15min。
在一种实施方式中，所述步骤5中醇为75％乙醇。
在一种实施方式中，所述含DNaseA的Nuclease-free水以50-100ul/0.1-0.2g板蓝根根部的量加入。
与现有技术对比，本发明的有益效果在于：
1.本发明将改良CTAB裂解液用于提取板蓝根根系成功地获得了总RNA，有效克服了粘稠状的缺陷，去除了杂质。
2.本发明提供的板蓝根根系总RNA的提取方法，提取成本低、易操作、并能获得高质量的RNA，方便后续的建库、上机以及PCR反应。
【说明书附图】
图1是本发明实施例和对比例提取的板蓝根总RNA的电泳图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
本发明提供的一种改良CTAB裂解液组分为：
100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP和0.4％(V/V)β-巯基乙醇。
其中：
Tris-HCl(pH 8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏，有利于RNA的稳定；
EDTA螯合Mg2+和Mn2+，抑制RNase活性，防止RNA被降解；
1.4M NaCl：提供一个高盐环境，使RNP(RNA-CTAB complex)充分溶解，存在于液相中；
CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离，在高盐溶液中核酸是可溶的。
β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
PVP：酚的络合物，能与多酚形成一种不溶地络合物质，有效去除多酚；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
以上裂解液组分相互协同，可应用于板蓝根根系总RNA的成功提取。
实施例
板蓝根根系总RNA的提取，步骤如下：
1)在液氮中将板蓝根根部组织研磨成粉末，并取适量的粉末0.1-0.2g放入2mL的无RNA酶的离心管中(由于RNA比较容易降解，所以在液氮研磨过程中，需随时添加液氮，确保粉末不被融化)；
2)加入1mL的改良CTAB裂解液：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、20mM EDTA、1.4MNaCl、2％(W/V)CATB、20％(W/V)PVP、0.4％(V/V)β-巯基乙醇；充分混匀，65℃孵育15min，得到孵育混合液(考虑到要确保组织样均匀彻底地分散在裂解液里，故植物样品材料不能过多，否则会出现样品组织结团。综合各方因素验证得出，0.1-0.2g的样品材料与1mL的CTAB裂解液混合最合适)；
3)向获得的孵育混合液中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1)混合试剂抽提一次，4℃12000rpm离心15min，得到抽提上清液；
4)向得到的抽提上清液加入等体积的异丙醇，混匀后于室温沉淀10min，4℃12000rpm离心10min，得到总RNA沉淀；
5)向得到的总RNA沉淀中加入1mL75％乙醇溶液，清洗沉淀2次，得到沉淀物；
6)向得到的沉淀物中加入50-100ul的Nuclease-free水(含DNase A)溶解，获得提取的板蓝根根系总RNA。
本实施例提取的板蓝根总RNA的电泳图如图1中泳道3-4所示。
对比例
采用中国专利公开文件CN102899318A中的方法，提取板蓝根根系总RNA。
具体操作步骤如下：
1)将乙二胺四乙酸盐预处理溶液(处理液为3wt％可溶性PVP，2％v/vβ-巯基乙醇，100mmolL-1乙二胺四乙酸)预热至42℃；
2)将0.1g板蓝根根部于液氮中研磨粉末后加入到1ml预热的预处理液中，再加入500μl乙酸乙酯，漩涡振荡器混匀；
3)将匀浆液于室温水平静置1-3分钟；4℃4000g离心3min；保留沉淀；
4)向离心管中加入1ml的Tris-SDS裂解液(100mmol/LTris-HCl，400mmol/L氯化钠，1.0％SDS，2％β-巯基乙醇，pH＝7.5)，将沉淀摇起混匀，室温水平静置3-5分钟；
5)加200μl 2M的高盐溶液(1.2mol/L氯化钠，0.8mol/L柠檬酸钠)，摇匀，再加入300μl酸酚/二氯甲烷(体积比1:1，用2mol/L的醋酸钠(NaOAc，pH 3.7)调pH值至4.0)，混匀后4℃13000g离心5min；
6)上清液转入2ml离心管中，加入500μl二氯甲烷，摇匀后4℃13000g离心5min；
7)上清液转入新的2ml离心管中，加入1ml-20℃预冷的异丙醇，摇匀后水平静置5分钟，4℃13000g离心5min；
8)沉淀用75％乙醇洗涤两次，最后用50μl RNase-free水中，-80℃冻存。
本对比例方法提取的板蓝根中RNA的电泳图如图1中泳道1-2所示。
采用专利公开文件中的方法进行提取，因为原始样本中的杂质过多，导致提取的RNA粘稠，纯度较差，电泳检测无明显的25S和18S条带(图1中的泳道1和2)；而利用本方法在裂解液中增加了PVP和巯基乙醇后，可以有效地去除多糖多酚等杂质，更充分地裂解组织，释放RNA，提取的RNA不再粘稠了，纯度也较好，电泳检测有完整的mRNA条带(图1中的泳道3和4)。本发明通过上述各个步骤的协同作用，成功地从板蓝根部材料中提取出了总RNA；并且，该提取方法简便易行，提取率较高，且价格较试剂盒更低廉，满足了后续分子生物学实验及相关研究的要求。
上述参照具体实施方式对板蓝根根系总RNA的提取方法作了详细的描述，但实施实例的描述是说明性而并非限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明技术的实质和范围下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改良CTAB裂解液在提取板蓝根根系总RNA中的应用，所述改良CTAB裂解液包括100mM Tris-HCl，pH为8，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％W/V的CATB，20％W/V的PVP和0.4％V/V的β-巯基乙醇。
2.一种板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.液氮中取板蓝根根部组织研磨成粉末，取粉末放入无RNA酶的离心管中；
S2.加入裂解液，充分混匀，孵育得到混合液；
S3.孵育混合液中加入等体积的抽提试剂进行抽提，离心获抽提上清液；
S4.向抽提上清液加入异丙醇，混匀后室温沉淀，离心得总RNA沉淀；
S5.向总RNA沉淀中加入醇溶液清洗，得到沉淀物；
S6.加入含DNaseA的Nuclease-free水对所得沉淀物进行溶解，获得植物总RNA。
3.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述裂解液为权利要求1中所述改良CTAB裂解液。
4.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述裂解液以0.1mL/0.1-0.2g板蓝根根部的量加入。
5.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述无RNA酶以2mL/0.1-0.2g板蓝根根部的量加入。
6.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述抽提试剂为体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇混合试剂。
7.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述步骤S2孵育条件为65℃孵育15min。
8.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述步骤S3中离心条件为4℃12000rpm离心15min。
9.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述步骤S5中醇为75％乙醇。
10.根据权利要求2所述的板蓝根根系总RNA的提取方法，其特征在于，所述含DNaseA的Nuclease-free水以50-100ul/0.1-0.2g板蓝根根部的量加入。
CN202011090386.1A 2020-10-13 2020-10-13 一种改良ctab裂解液在提取板蓝根根系总rna中的应用 Pending CN112063618A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011090386.1A CN112063618A (zh) 2020-10-13 2020-10-13 一种改良ctab裂解液在提取板蓝根根系总rna中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011090386.1A CN112063618A (zh) 2020-10-13 2020-10-13 一种改良ctab裂解液在提取板蓝根根系总rna中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112063618A true CN112063618A (zh) 2020-12-11

Family

ID=73655361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011090386.1A Pending CN112063618A (zh) 2020-10-13 2020-10-13 一种改良ctab裂解液在提取板蓝根根系总rna中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112063618A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263720A (zh) * 2014-09-03 2015-01-07 北京林业大学 植物叶片总rna提取方法
CN111286501A (zh) * 2020-04-09 2020-06-16 嘉兴菲沙基因信息有限公司 一种有效提取海滨木槿基因组的方法
CN111454939A (zh) * 2020-04-09 2020-07-28 武汉菲沙基因信息有限公司 一种桑树基因组dna的高效提取方法
CN111454938A (zh) * 2020-04-09 2020-07-28 武汉菲沙基因信息有限公司 一种红树基因组dna的高效提取方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263720A (zh) * 2014-09-03 2015-01-07 北京林业大学 植物叶片总rna提取方法
CN111286501A (zh) * 2020-04-09 2020-06-16 嘉兴菲沙基因信息有限公司 一种有效提取海滨木槿基因组的方法
CN111454939A (zh) * 2020-04-09 2020-07-28 武汉菲沙基因信息有限公司 一种桑树基因组dna的高效提取方法
CN111454938A (zh) * 2020-04-09 2020-07-28 武汉菲沙基因信息有限公司 一种红树基因组dna的高效提取方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Meng et al. A rapid TRIzol‐based two‐step method for DNA‐free RNA extraction from Arabidopsis siliques and dry seeds
CN101864414A (zh) 仿刺参体壁总rna提取方法
CN102776174A (zh) 一种从百合组织中同时提取dna和rna的方法
Dong et al. A reliable method for extraction of RNA from various conifer tissues
BRPI0621562A2 (pt) mÉtodo para rÁpido isolamento de rna e um kit deste
Chang et al. Isolation of high-quality RNA from Platycladus orientalis and other Cupressaceae plants
CN102628039B (zh) 一种通用植物总rna提取法
CN110511925A (zh) 一种柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒及提取方法
CN104212796A (zh) 一种鱼类精巢组织总rna的提取方法
CN113136384B (zh) 濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法
CN112063618A (zh) 一种改良ctab裂解液在提取板蓝根根系总rna中的应用
CN113584018A (zh) 莲叶桐核酸提取改良版ctab法
CN104152439B (zh) 一种适用于烟草种子的rna提取方法
CN111454939A (zh) 一种桑树基因组dna的高效提取方法
CN103013985B (zh) 一种白桦叶片基因组dna提取方法
CN107267498A (zh) 一种通用型从微量植物材料中提取dna的试剂盒及方法
CN109136221A (zh) 一种提取橡胶树叶片总dna的方法
CN102424825B (zh) 榛子叶片和花芽总rna提取方法
CN102140448A (zh) 动物组织dna提取方法
CN106801051B (zh) 一种用于提取植物rna的试剂盒以及提取方法
CN111286501B (zh) 一种有效提取海滨木槿基因组的方法
CN106282158A (zh) 一种从沙冬青提取高质量基因组dna的方法
SPEIRS et al. RNA extraction and fractionation
CN102181435A (zh) 一种快速提取人参叶组织rna的方法
CN102250881B (zh) 一种高效提取热带植物dna的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201211