CN104212796A - 一种鱼类精巢组织总rna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法,将鱼类精巢组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后匀浆、过滤、离心，经蛋白酶K消化、氯仿-正丁醇混合液萃取后，再经异丙醇-醋酸钠沉淀，DNA酶处理后，经洗涤而获得鱼类精巢组织总RNA。本发明所述提取方法可避免鱼类精巢组织中的大量的蛋白成分和结缔组织对RNA提取的影响，获得纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的RNA分离纯化方法。

Description

一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法

技术领域

本发明涉及鱼类总RNA的提取，具体地说，涉及一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法。

背景技术

总RNA分离纯化技术是分子生物学研究技术的基础，从组织中提取纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的总RNA的分离纯化方法，是决定后续实验结果质量的关键，一些特定的部位使用通用的RNA分离纯化方法，往往不能满足要求，需要相应的处理与提取制备方法。

鱼类精巢组织内含有大量的蛋白成分(精原细胞、精母细胞和精子等)和结缔组织，采用常规RNA分离纯化方法，在抽提的过程中容易蛋白污染，而且操作过程中样本不易研磨，裂解时易产生粘稠胶团，造成抽提过程中RNA的降解和得率偏低。由于存在上述问题，使鱼类精巢组织总RNA难以稳定的分离和纯化。

目前，有针对性的分离纯化鱼精巢组织总RNA的方法较少，用传统方法处理鱼精巢组织研磨不充分、裂解易形成粘稠胶团、提取的总RNA浓度低、稳定性差、污染率高，无法满足后续实验的要求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于鱼类精巢组织总RNA的提取方法。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法，具体为：将鱼类精巢组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后匀浆、过滤、离心，经蛋白酶K消化、氯仿-正丁醇混合液萃取后，再经异丙醇-醋酸钠沉淀，DNA酶处理后，经洗涤而获得鱼类精巢组织总RNA。

进一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β-巯基乙醇和/或8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0-2.5％和0.10-0.15％。由于Trizol裂解液本身含有0.10％的8-羟基喹啉，因此也可不再加入8-羟基喹啉。但为了更好的抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰，在Trizol裂解液使用前加入0.05％8-羟基喹啉，使其在Trizol裂解液中的体积浓度达到0.15％。

进一步地，所述过滤使用35-40目滤网过滤。

作为优选，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为1/4Trizol体积。

进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。

进一步地，在使用异丙醇-醋酸钠沉淀RNA前，加入RNase-free的脂质体。

进一步地，在经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。

进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：

1)取鱼类精巢组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存；

2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中，超声破碎，过滤，离心，取上清；

3)加入RNase-free水稀释，再加入蛋白酶K，振荡摇匀，离心，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取上清；

5)加入RNase-free的脂质体；

6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀，离心，弃上清液；

7)用预冷的乙醇悬浮沉淀，离心，弃去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；

8)加入RNase-free DNase缓冲液、RNase-free DNA酶、RNA酶抑制剂和RNase-free水，处理40-50min，得到DNA酶处理液；

9)加入乙二胺四乙酸，加热处理灭酶活，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水乙醇，混匀后放置15-25min，离心，弃上清；

10)用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液充分溶解，-80℃保存。

更进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：

1)取60-80mg鱼类精巢组织，无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速冻，-80℃超低温冻存；

2)将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8-10s，间隔15-20s，超声破碎8-10s，使用35-40目过滤网过滤一次，17000-19000g 4℃离心5min，取上清；

3)加入450μl RNase-free水，加入蛋白酶K 50μl，振荡摇匀后56℃水浴30min，17000-19000g 4℃离心10min，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液450-500μl，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，取上清；

5)加入5μg RNase-free的脂质体，用针头抽吸上清2-3次；

6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀-20℃放置60min，12000g 4℃离心15min，弃上清液，管底部会出现少量沉淀；所述异丙醇-醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋酸钠溶液的pH＝5.2；

7)用75％已预冷的乙醇800-1000μl均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4℃离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水20μl充分溶解；

8)加入5μl的RNase-free DNase缓冲液、2μl的RNase-free DNA酶、2.5μl的RNA酶抑制剂和20.5μl RNase-free水，37℃处理40-50min，得到DNA酶处理液；

9)加入2.5μl浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78-82℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置15-25min，12000g 4℃离心10min，弃上清；

10)用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心5min，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液20-30μl充分溶解，-80℃保存。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法，可避免鱼类精巢组织中的大量的蛋白成分和结缔组织对RNA提取的影响，获得纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的RNA分离纯化方法。

本发明通过在Trizol中加入2.5％的β-巯基乙醇和0.05％的8-羟基喹啉，可在裂解过程中有效抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰。Trizol中加入β-巯基乙醇和8-羟基喹啉，用来抑制RNA酶活性，本申请根据实验结果发现，在处理富含RNA酶的组织时，Trizol加入2.5％的β-巯基乙醇和0.05％的8-羟基喹啉协同作用效果最好，可有效的抑制内源性RNA酶，并有效排除核蛋白和色素等的干扰。

本发明将冷冻样本在Trizol中匀浆后，使用超声破碎进行处理，能够更好的裂解细胞，使RNA充分游离到液相中。液氮研磨法破碎样本，由于液氮极易挥发，研磨过程中要不断的向研钵中加入液氮，耗费时间长，操作不方便，有安全隐患，而对冻存样本进行电动匀浆，匀浆后再使用超声破碎，细胞破碎速度快，匀浆彻底，操作简单安全，缩短了处理时间，有效减少RNA的降解。

本发明在匀浆破碎后，使用35-40目滤网过滤一次，可有效去除裂解过程中产生的絮状沉淀物。裂解和匀浆过程中，Trizol与蛋白(精原细胞、精母细胞等)、细胞壁、结缔组织等产生的絮状沉淀物，容易影响后续实验，使用35-40目滤网过滤可去除。

本发明对过滤液使用蛋白酶K进行处理，结合过滤方法，可有效去除匀浆液中的蛋白成分。由于精巢中蛋白含量高，使用过滤方法不能完全去除，匀浆阶段使用蛋白酶K进行处理，为了提高处理效果向Trizol中加入水，可防止向Trizol液中直接加入蛋白酶K而降低酶的活性，普通组织中蛋白酶K(QIAGEN公司)的用量为20-30μl，实验中用量增加至50μl可提高酶的处理效率。

本发明在Trizol裂解液处理后，离心力增加至17000-19000g，可有效沉降破碎细胞壁、杂质等。

本发明使用氯仿与正丁醇混合液(24:1)，可提高蛋白、DNA和RNA的分离效果，保证RNA的纯度和完整性。常规提取过程中，抽提时使用氯仿或氯仿异戊醇混合物，使用量约为1/5Trizol体积，改用氯仿与正丁醇混合物，比例为24:1，使用量增加至1/4体积可以有效提高处理效率，利于水相、蛋白相和有机相的分离，且异戊醇的毒性较大，改用正丁醇可降低毒性，保护操作人员。

本发明在沉淀RNA之前，加入RNase-free的脂质体，可有效析出RNA，提高RNA得率。

本发明将常规方法中的异丙醇沉淀步骤改为使用异丙醇-醋酸钠混合液(异丙醇：醋酸钠＝4:1)沉淀，处理条件为-20℃放置60min，，沉淀RNA。在加入异丙醇同时加入醋酸钠，沉淀RNA的同时溶解多糖类物质，使它们有效分离。醋酸钠等高盐溶液可在提取过程中加入，用于去除多糖和析出RNA，一般加入的体积为10％，浓度一般为3mol/L(终浓度0.3mol/L)，处理条件一般为-20℃放置3小时，本申请根据实验发现在加入异丙醇阶段，醋酸钠加入量增加至20％且浓度降低至2mol/L(终浓度0.4mol/L)，处理条件为-20℃放置60min，可提高沉淀并溶解多糖类物质的效率，而RNA析出阶段醋酸钠浓度也增加至3.5mol/L，可有效析出RNA。

本发明将一般乙醇处理过程中7000-8000g的离心力增加至12000g，能够更好地沉淀RNA，较大的离心力使RNA粘附于管底，去除上清的时候利于操作。

本发明引入DNA酶处理步骤，将消化时间延长至40-50min，可提高DNA酶处理效率，更彻底的去除基因组DNA污染。DNA酶的失活使用78-82℃热处理3min，使DNA酶失活更加彻底，利于后续的分离与纯化，相对于氯仿抽提法，缩短了处理时间，有效减少RNA在纯化中的降解。

附图说明

图1为本发明所述方法提取的鱼类精巢组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明所述方法提取的鱼类精巢组织总RNA经反转录后，对β-actin基因进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例所述鱼类精巢组织总RNA的提取方法具体步骤如下：

1.用手术工具取60mg鱼类精巢组织，无菌RNase-free(无RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速冻，超低温(-80℃)冻存。

2.将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8s，间隔15s，超声破碎8s，使用35目过滤网过滤一次，170004℃离心5min，吸上清至离心管A中。

注：Trizol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25μlβ-巯基乙醇和0.5μl的8-羟基喹啉。

注：过滤网目数，是指物料的粒度或粗细度，一般定义是指在1英寸*1英寸(1英寸＝25.4mm)的面积内有多少个网孔数，即筛网的网孔数，35目筛孔尺寸：0.5mm，40目筛孔尺寸：0.425mm。

3.向离心管A中加入450μl RNase-free水，加入蛋白酶K 50μl(QIAGEN公司)，振荡摇匀后56℃水浴30min，17000g 4℃离心10min，吸取上清液至离心管B中。

4.离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝24:1)450μl(约为混合液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，吸取上清液至离心管C中。

5.向上清中加入5μg RNase-free的脂质体，用4.5号针头(搭配1ml注射器)抽吸上清2次。

6.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液(异丙醇：醋酸钠＝4:1，醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20℃放置60min，12000g 4℃离心15min，弃上清液，管底部会出现少量沉淀。

7.用75％已预冷的乙醇800μl均匀悬浮漂洗沉淀,12000g 4℃离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5min，晾干，加入RNase-free水20μl充分溶解。

8.向RNA溶液中加入5μl的RNase-free DNase缓冲液(10×DNaseI Buffer，宝生物公司)、2μl的RNase-free DNA酶(5U/μl RNase-freeRecombinant DNase I，宝生物公司)、2.5μl的RNA酶抑制剂(20U/μlRNase Inhibitor，Life technologies公司)和20.5μl RNase-free水，37℃处理40min，得到DNA酶处理液。

9.向DNA酶处理液中加入2.5μl 0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置15min，12000g 4℃离心10min，弃上清。

10.用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心5min，弃上清，室温封闭静置5min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液20μl充分溶解，-80℃保存。

本发明提取并纯化获得的鱼类精巢组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，28s条带亮度是18s亮度的二倍，同时测得的鱼类精巢总RNA浓度为300-500ng/μl，吸光度OD260/OD280的比值稳定在1.8-2.0之间，说明获得的总RNA纯度高、完整性佳、无DNA和蛋白污染。

本发明提取后的鱼类精巢组织总RNA经反转录后，对β-actin基因进行了PCR扩增，琼脂糖电泳凝胶检测结果如图2：电泳条带完整、清晰、特异性好，说明此总RNA能满足后续的RT-PCR、Real TimeRT-PCR、Northern blot、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。

实施例2

本实施例所述鱼类精巢组织总RNA的提取方法具体步骤如下：

1.用手术工具取80mg鱼类精巢组织，无菌RNase-free(无RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速冻，超低温(-80℃)冻存。

2.将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎10s，间隔20s，超声破碎10s，使用40目过滤网过滤一次，19000g4℃离心5min，吸上清至离心管A中。

注：Trizol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25μlβ-巯基乙醇和0.5μl的8-羟基喹啉。

注：过滤网目数，是指物料的粒度或粗细度，一般定义是指在1英寸*1英寸(1英寸＝25.4mm)的面积内有多少个网孔数，即筛网的网孔数，35目筛孔尺寸：0.5mm，40目筛孔尺寸：0.425mm。

3.向离心管A中加入450μl RNase-free水，加入蛋白酶K 50μl(QIAGEN公司)，振荡摇匀后56℃水浴30min，19000g 4℃离心10min，吸取上清液至离心管B中。

4.离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝24:1)500μl(混合液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，吸取上清液至离心管C中。

5.向上清中加入5μg RNase-free的脂质体，用4.5号针头(搭配1ml注射器)抽吸上清3次。

6.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液(异丙醇：醋酸钠＝4:1，醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20℃放置60min，12000g 4℃离心15min，弃上清液，管底部会出现少量沉淀。

7.用75％已预冷的乙醇1000μl均匀悬浮漂洗沉淀,12000g 4℃离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置10min，晾干，加入RNase-free水20μl充分溶解。

8.向RNA溶液中加入5μl的RNase-free DNase缓冲液(10×DNaseI Buffer，宝生物公司)、2μl的RNase-free DNA酶(5U/μl RNase-freeRecombinant DNase I，宝生物公司)、2.5μl的RNA酶抑制剂(20U/μlRNase Inhibitor，Life technologies公司)和20.5μl RNase-free水，37℃处理50min，得到DNA酶处理液。

9.向DNA酶处理液中加入2.5μl 0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀82℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置25min，12000g 4℃离心10min，弃上清。

10.用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心5min，弃上清，室温封闭静置10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液30μl充分溶解，-80℃保存。

本发明提取并纯化获得的鱼类精巢组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，28s条带亮度是18s亮度的二倍，同时测得的鱼类精巢总RNA浓度为300-500ng/μl，吸光度OD260/OD280的比值稳定在1.8-2.0之间，说明获得的总RNA纯度高、完整性佳、无DNA和蛋白污染。

本发明提取后的鱼类精巢组织总RNA经反转录后，对β-actin基因进行了PCR扩增，琼脂糖电泳凝胶检测结果如图2：电泳条带完整、清晰、特异性好，说明此总RNA能满足后续的RT-PCR、Real TimeRT-PCR、Northern blot、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法，其特征在于，将鱼类精巢组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后匀浆、过滤、离心，后依次经蛋白酶K消化及氯仿-正丁醇混合液萃取，再经异丙醇-醋酸钠沉淀及DNA酶处理后经洗涤获得鱼类精巢组织总RNA。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Trizol裂解液使用前加入β-巯基乙醇和8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0-2.5％和0.10-0.15％。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述过滤使用35-40目滤网过滤。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为1/4Trizol体积。

5.根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，在使用异丙醇-醋酸钠沉淀RNA前，加入RNase-free的脂质体。

7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。

8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取鱼类精巢组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存；

2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中，超声破碎，过滤，离心，取上清；

3)加入RNase-free水稀释，再加入蛋白酶K，振荡摇匀，离心，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取上清；

5)加入RNase-free的脂质体；

6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀，离心，弃上清液；

7)用预冷的乙醇悬浮沉淀，离心，弃去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；

8)加入RNase-free DNase缓冲液、RNase-free DNA酶、RNA酶抑制剂和RNase-free水，处理40-50min，得到DNA酶处理液；

9)加入乙二胺四乙酸，加热处理灭酶活，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水乙醇，混匀后放置15-25min，离心，弃上清；

10)用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液充分溶解，-80℃保存。

9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取60-80mg鱼类精巢组织，无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速冻，-80℃超低温冻存；

2)将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8-10s，间隔15-20s，超声破碎8-10s，使用35-40目过滤网过滤一次，17000-19000g 4℃离心5min，取上清；

3)加入450μl RNase-free水，加入蛋白酶K 50μl，振荡摇匀后56℃水浴30min，17000-19000g 4℃离心10min，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液450-500μl，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，取上清；

5)加入5μg RNase-free的脂质体，用针头抽吸上清2-3次；

6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀-20℃放置60min，12000g 4℃离心15min，弃上清液，管底部会出现少量沉淀；所述异丙醇-醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋酸钠溶液的pH＝5.2；

7)用75％已预冷的乙醇800-1000μl均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4℃离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水20μl充分溶解；

8)加入5μl的RNase-free DNase缓冲液、2μl的RNase-free DNA酶、2.5μl的RNA酶抑制剂和20.5μl RNase-free水，37℃处理40-50min，得到DNA酶处理液；

9)加入2.5μl浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78-82℃加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后-80℃放置15-25min，12000g 4℃离心10min，弃上清；

10)用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心5min，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液20-30μl充分溶解，-80℃保存。