CN104630209A - 一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组dna的方法 - Google Patents

Abstract

一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，包括以下几个步骤：1）配制基因组DNA提取缓冲液；2）用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗；3）将昆虫放入离心管内，加入3～6倍虫体体积的提取缓冲液，50±5℃水浴； 4）-20℃放置14～17 h，冷抽提基因组DNA；5）加入蛋白酶K，使其终浓度为0.6 mg/mL，50±5℃水浴；6）95℃水浴灭活蛋白酶K；7）将昆虫从离心管中取出，管内溶液即含有该昆虫的基因组DNA。该提取方法不仅能够保持虫体的完整性，而且经过-20℃冷抽提，使昆虫的基因组DNA在低温条件下从虫体内充分释放，避免了基因组DNA的降解，提高了基因组DNA的质量。

Description

一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的分子生物学方法。

背景技术

昆虫的基因组DNA对于昆虫的分类鉴定、系统进化、物种多样性等方面的研究具有重要意义，高质量的DNA是进行相关研究的前提。传统的昆虫基因组DNA提取方法需要先将虫体破碎研磨，再经过蛋白酶消化和有机溶剂抽提，最终得到基因组DNA。这些方法会对昆虫样本造成永久性的破坏，不利于保留样本的完整性，尤其是一些珍稀的昆虫样本，进而对后续的形态学分类鉴定产生一定的影响。同时，传统的提取方法需要用到苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂，这些溶剂都具有一定的毒性，会对操作人员和周围环境产生潜在的危害。

侯晓晖等公开的“一种提取昆虫DNA的方法”（申请号201310210257.5）中提出了一种在不破坏虫体的情况下提取昆虫基因组DNA的方法。其主要步骤是将昆虫浸入STE缓冲液中，按照10%的比例加入蛋白酶K，56℃孵育1 h以上，然后取出虫体，余下的溶液中即含有昆虫的基因组DNA，该方法主要是利用蛋白酶K的消化作用使DNA释放至缓冲液中。然而该方法尚存在一些不足之处：（1）仅通过蛋白酶K的消化作用不足以充分释放出昆虫体内的DNA，尤其是一些体表被几丁质外壳包裹的昆虫；（2）蛋白酶K消化后，没有经过高温使蛋白酶失活，残留的酶会对后续实验产生一定的影响；（3）56℃长时间孵育会使基因组DNA发生降解，影响DNA质量。

发明内容

本发明针对现有方法的缺陷与不足，提供了一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，包括以下具体步骤：

1 提取缓冲液的配制

配制基因组DNA提取缓冲液：10×PCR BufferⅡ，0.45% NP40，0.45% Tween20，0.6 mg/mL蛋白酶K，ddH₂O补至最终体积。

2 虫体的预处理

先用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗2～4遍，最后用吸水纸吸干虫体表面水分。

3 基因组DNA的提取

（1）将昆虫放入离心管内，加入3～6倍虫体体积的提取缓冲液，50±5℃水浴1～2 h，每隔10～20 min轻柔颠倒混匀一次；

（2）-20℃放置14～17 h，冷抽提基因组DNA；

（3）加入蛋白酶K，使其终浓度为0.6 mg/mL，50±5℃水浴1～2 h，每隔10～20 min轻柔颠倒混匀一次；

（4）95℃水浴10～15 min，灭活蛋白酶K；

（5）用无菌镊子将昆虫从离心管中取出，放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有该昆虫的基因组DNA，-20℃保存备用。

4 基因组DNA的鉴定

（1）通过1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量；

（2）以基因组DNA为模板，通过PCR扩增线粒体CO1基因来检测基因组DNA是否满足后续的生物学实验要求。

本发明与现有方法相比具有以下优点：（1）提取过程无需使用有毒的有机溶剂，减少了对操作者和环境的危害；（2）提取缓冲液中除了加有蛋白酶K之外，还加有温和的表面活性剂NP40和Tween20，既增强了对昆虫的消化能力，增加了DNA的释放量，又不会对昆虫形态产生破坏；（3）-20℃低温冷抽提DNA不仅减少了DNA的降解，还提高了得率；（4）最后经过95℃高温灭活蛋白酶K，消除了其对后续实验的影响。

附图说明

图1是样品1和2的基因组DNA电泳检测结果；

其中：1：样品1的基因组DNA，2：样品2的基因组DNA，M：Trans15K DNA分子量标准。

图2是分别以样品1和2的基因组DNA为模板，PCR扩增CO1基因的电泳检测结果；

其中：1：样品1的PCR结果，2：样品2的PCR结果，M：Trans2K DNA分子量标准。

图3是样品1的基因组DNA提取前后，昆虫外形的对比；

图4是样品2的基因组DNA提取前后，昆虫外形的对比。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例对本发明做进一步的详细说明，本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

提取膜翅目蚂蚁（样品1）的基因组DNA。

1 提取缓冲液的配制

配制400 μL提取缓冲液：40 μL 10×PCR BufferⅡ，1.8 μL NP40，1.8 μL Tween20，12 μL蛋白酶K（20 mg/mL），344.4 μL ddH₂O。

2 虫体的预处理

先用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗3遍，最后用吸水纸吸干虫体表面水分。

3 基因组DNA的提取

（1）将蚂蚁放入离心管内，加入300 μL提取缓冲液，50℃水浴1 h，每隔15 min轻柔颠倒混匀一次；

（2）-20℃放置15 h，冷抽提基因组DNA；

（3）加入9 μL蛋白酶K（20 mg/mL），50℃水浴1 h，每隔15 min轻柔颠倒混匀一次；

（4）95℃水浴10 min，灭活蛋白酶K；

（5）用无菌镊子将蚂蚁从离心管中取出，放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有蚂蚁的基因组DNA，-20℃保存备用。

4 基因组DNA的鉴定

1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量，如图1中泳道1所示，样品1的基因组DNA条带单一，没有出现弥散，说明基因组DNA的完整性很好，没有产生降解。

如图2中泳道1所示，以样品1的基因组DNA为模板，PCR扩增出来的CO1基因条带十分清晰特异，表明基因组DNA能够满足后续的生物学实验要求。

5 DNA提取前后蚂蚁外形的对比

如图3所示，提取基因组DNA前后，样品1的外形没有发生明显变化，说明整个提取过程没有对虫体形态产生破坏。

实施例2

提取同翅目叶蝉（样品2）的基因组DNA。

1 提取缓冲液的配制

配制300 μL提取缓冲液：30 μL 10×PCR BufferⅡ，1.35 μL NP40，1.35 μL Tween20，9 μL蛋白酶K（20 mg/mL），258.3 μL ddH₂O。

2 虫体的预处理（同实施例1）

3 基因组DNA的提取

（1）将叶蝉放入离心管内，加入200 μL提取缓冲液，50℃水浴1 h，每隔15 min轻柔颠倒混匀一次；

（2）-20℃放置15 h，冷抽提基因组DNA；

（3）加入6 μL蛋白酶K（20 mg/mL），50℃水浴1 h，每隔15 min轻柔颠倒混匀一次；

（4）95℃水浴10 min，灭活蛋白酶K；

（5）用无菌镊子将叶蝉从离心管中取出，放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有叶蝉的基因组DNA，-20℃保存备用。

4 基因组DNA的鉴定

如图1中泳道2所示，样品2的基因组DNA条带单一，没有出现弥散，说明基因组DNA的完整性很好，没有产生降解。

如图2中泳道2所示，以样品2的基因组DNA为模板，PCR扩增出来的CO1基因条带十分清晰特异，表明基因组DNA能够满足后续的生物学实验要求。

5 DNA提取前后叶蝉外形的对比

如图4所示，提取基因组DNA前后，样品2的外形没有发生明显变化，说明整个提取过程没有对虫体形态产生破坏。

Claims (3)

1.一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

（1）配制基因组DNA提取缓冲液；

（2）用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质，再用蒸馏水清洗2～4遍，吸水纸吸干虫体表面水分；

（3）将昆虫放入离心管内，加入3～6倍虫体体积的提取缓冲液，50±5℃水浴1～2 h，每隔10～20 min轻柔颠倒混匀一次；

（4）-20℃放置14～17 h，冷抽提基因组DNA；

（5）加入蛋白酶K，使其终浓度为0.6 mg/mL，50±5℃水浴1～2 h，每隔10～20 min轻柔颠倒混匀一次；

（6）95℃水浴10～15 min，灭活蛋白酶K；

（7）用无菌镊子将昆虫从离心管中取出，放入95%酒精中存留，离心管内的溶液即含有该昆虫的基因组DNA，-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，其特征在于：所述提取缓冲液配制如下：10×PCR BufferⅡ，0.45% NP40，0.45% Tween20，0.6 mg/mL蛋白酶K，ddH₂O补至最终体积。

3.根据权利要求1所述的无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法，其特征在于：步骤（7）所得到的基因组DNA质量可以通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。