CN104630209A - 一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法,包括以下几个步骤:1)配制基因组DNA提取缓冲液;2)用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质,再用蒸馏水清洗;3)将昆虫放入离心管内,加入3~6倍虫体体积的提取缓冲液,50±5℃水浴; 4)-20℃放置14~17 h,冷抽提基因组DNA;5)加入蛋白酶K,使其终浓度为0.6 mg/mL,50±5℃水浴;6)95℃水浴灭活蛋白酶K;7)将昆虫从离心管中取出,管内溶液即含有该昆虫的基因组DNA。该提取方法不仅能够保持虫体的完整性,而且经过-20℃冷抽提,使昆虫的基因组DNA在低温条件下从虫体内充分释放,避免了基因组DNA的降解,提高了基因组DNA的质量。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的分子生物学方法。
背景技术
昆虫的基因组DNA对于昆虫的分类鉴定、系统进化、物种多样性等方面的研究具有重要意义,高质量的DNA是进行相关研究的前提。传统的昆虫基因组DNA提取方法需要先将虫体破碎研磨,再经过蛋白酶消化和有机溶剂抽提,最终得到基因组DNA。这些方法会对昆虫样本造成永久性的破坏,不利于保留样本的完整性,尤其是一些珍稀的昆虫样本,进而对后续的形态学分类鉴定产生一定的影响。同时,传统的提取方法需要用到苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂,这些溶剂都具有一定的毒性,会对操作人员和周围环境产生潜在的危害。
侯晓晖等公开的“一种提取昆虫DNA的方法”(申请号201310210257.5)中提出了一种在不破坏虫体的情况下提取昆虫基因组DNA的方法。其主要步骤是将昆虫浸入STE缓冲液中,按照10%的比例加入蛋白酶K,56℃孵育1 h以上,然后取出虫体,余下的溶液中即含有昆虫的基因组DNA,该方法主要是利用蛋白酶K的消化作用使DNA释放至缓冲液中。然而该方法尚存在一些不足之处:(1)仅通过蛋白酶K的消化作用不足以充分释放出昆虫体内的DNA,尤其是一些体表被几丁质外壳包裹的昆虫;(2)蛋白酶K消化后,没有经过高温使蛋白酶失活,残留的酶会对后续实验产生一定的影响;(3)56℃长时间孵育会使基因组DNA发生降解,影响DNA质量。
发明内容
本发明针对现有方法的缺陷与不足,提供了一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现:
一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法,包括以下具体步骤:
1 提取缓冲液的配制
配制基因组DNA提取缓冲液:10×PCR BufferⅡ,0.45% NP40,0.45% Tween20,0.6 mg/mL蛋白酶K,ddH2O补至最终体积。
2 虫体的预处理
先用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质,再用蒸馏水清洗2~4遍,最后用吸水纸吸干虫体表面水分。
3 基因组DNA的提取
(1)将昆虫放入离心管内,加入3~6倍虫体体积的提取缓冲液,50±5℃水浴1~2 h,每隔10~20 min轻柔颠倒混匀一次;
(2)-20℃放置14~17 h,冷抽提基因组DNA;
(3)加入蛋白酶K,使其终浓度为0.6 mg/mL,50±5℃水浴1~2 h,每隔10~20 min轻柔颠倒混匀一次;
(4)95℃水浴10~15 min,灭活蛋白酶K;
(5)用无菌镊子将昆虫从离心管中取出,放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有该昆虫的基因组DNA,-20℃保存备用。
4 基因组DNA的鉴定
(1)通过1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量;
(2)以基因组DNA为模板,通过PCR扩增线粒体CO1基因来检测基因组DNA是否满足后续的生物学实验要求。
本发明与现有方法相比具有以下优点:(1)提取过程无需使用有毒的有机溶剂,减少了对操作者和环境的危害;(2)提取缓冲液中除了加有蛋白酶K之外,还加有温和的表面活性剂NP40和Tween20,既增强了对昆虫的消化能力,增加了DNA的释放量,又不会对昆虫形态产生破坏;(3)-20℃低温冷抽提DNA不仅减少了DNA的降解,还提高了得率;(4)最后经过95℃高温灭活蛋白酶K,消除了其对后续实验的影响。
附图说明
图1是样品1和2的基因组DNA电泳检测结果;
其中:1:样品1的基因组DNA,2:样品2的基因组DNA,M:Trans15K DNA分子量标准。
图2是分别以样品1和2的基因组DNA为模板,PCR扩增CO1基因的电泳检测结果;
其中:1:样品1的PCR结果,2:样品2的PCR结果,M:Trans2K DNA分子量标准。
图3是样品1的基因组DNA提取前后,昆虫外形的对比;
图4是样品2的基因组DNA提取前后,昆虫外形的对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例对本发明做进一步的详细说明,本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
提取膜翅目蚂蚁(样品1)的基因组DNA。
1 提取缓冲液的配制
配制400 μL提取缓冲液:40 μL 10×PCR BufferⅡ,1.8 μL NP40,1.8 μL Tween20,12 μL蛋白酶K(20 mg/mL),344.4 μL ddH2O。
2 虫体的预处理
先用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质,再用蒸馏水清洗3遍,最后用吸水纸吸干虫体表面水分。
3 基因组DNA的提取
(1)将蚂蚁放入离心管内,加入300 μL提取缓冲液,50℃水浴1 h,每隔15 min轻柔颠倒混匀一次;
(2)-20℃放置15 h,冷抽提基因组DNA;
(3)加入9 μL蛋白酶K(20 mg/mL),50℃水浴1 h,每隔15 min轻柔颠倒混匀一次;
(4)95℃水浴10 min,灭活蛋白酶K;
(5)用无菌镊子将蚂蚁从离心管中取出,放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有蚂蚁的基因组DNA,-20℃保存备用。
4 基因组DNA的鉴定
1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量,如图1中泳道1所示,样品1的基因组DNA条带单一,没有出现弥散,说明基因组DNA的完整性很好,没有产生降解。
如图2中泳道1所示,以样品1的基因组DNA为模板,PCR扩增出来的CO1基因条带十分清晰特异,表明基因组DNA能够满足后续的生物学实验要求。
5 DNA提取前后蚂蚁外形的对比
如图3所示,提取基因组DNA前后,样品1的外形没有发生明显变化,说明整个提取过程没有对虫体形态产生破坏。
实施例2
提取同翅目叶蝉(样品2)的基因组DNA。
1 提取缓冲液的配制
配制300 μL提取缓冲液:30 μL 10×PCR BufferⅡ,1.35 μL NP40,1.35 μL Tween20,9 μL蛋白酶K(20 mg/mL),258.3 μL ddH2O。
2 虫体的预处理(同实施例1)
3 基因组DNA的提取
(1)将叶蝉放入离心管内,加入200 μL提取缓冲液,50℃水浴1 h,每隔15 min轻柔颠倒混匀一次;
(2)-20℃放置15 h,冷抽提基因组DNA;
(3)加入6 μL蛋白酶K(20 mg/mL),50℃水浴1 h,每隔15 min轻柔颠倒混匀一次;
(4)95℃水浴10 min,灭活蛋白酶K;
(5)用无菌镊子将叶蝉从离心管中取出,放入95%酒精中存留。离心管内的溶液即含有叶蝉的基因组DNA,-20℃保存备用。
4 基因组DNA的鉴定
如图1中泳道2所示,样品2的基因组DNA条带单一,没有出现弥散,说明基因组DNA的完整性很好,没有产生降解。
如图2中泳道2所示,以样品2的基因组DNA为模板,PCR扩增出来的CO1基因条带十分清晰特异,表明基因组DNA能够满足后续的生物学实验要求。
5 DNA提取前后叶蝉外形的对比
如图4所示,提取基因组DNA前后,样品2的外形没有发生明显变化,说明整个提取过程没有对虫体形态产生破坏。
Claims (3)
1.一种无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法,其特征在于:包括以下具体步骤:
(1)配制基因组DNA提取缓冲液;
(2)用95%酒精小心清洗昆虫体表的杂质,再用蒸馏水清洗2~4遍,吸水纸吸干虫体表面水分;
(3)将昆虫放入离心管内,加入3~6倍虫体体积的提取缓冲液,50±5℃水浴1~2 h,每隔10~20 min轻柔颠倒混匀一次;
(4)-20℃放置14~17 h,冷抽提基因组DNA;
(5)加入蛋白酶K,使其终浓度为0.6 mg/mL,50±5℃水浴1~2 h,每隔10~20 min轻柔颠倒混匀一次;
(6)95℃水浴10~15 min,灭活蛋白酶K;
(7)用无菌镊子将昆虫从离心管中取出,放入95%酒精中存留,离心管内的溶液即含有该昆虫的基因组DNA,-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法,其特征在于:所述提取缓冲液配制如下:10×PCR BufferⅡ,0.45% NP40,0.45% Tween20,0.6 mg/mL蛋白酶K,ddH2O补至最终体积。
3.根据权利要求1所述的无损伤冷抽提小型昆虫基因组DNA的方法,其特征在于:步骤(7)所得到的基因组DNA质量可以通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。
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