CN105002165A

CN105002165A - 通过预处理提高大曲高粱酒醅总dna提取质量的方法

Info

Publication number: CN105002165A
Application number: CN201510503464.9A
Authority: CN
Inventors: 朱会霞; 程宗志; 郭亚伟; 李泽霞; 佟兰欣; 张福艳
Original assignee: HEBEI HENGSHUI LAOBAIGAN WINE INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: HEBEI HENGSHUI LAOBAIGAN WINE INDUSTRY Co Ltd
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2015-10-28

Abstract

本发明涉及酒醅DNA的制备技术领域，具体的将公开了一种通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法。技术方案为：采用中温淀粉酶、液化酶对大曲高粱酒醅进行预处理，降解大部分淀粉；再利用纤维素酶降解酒醅中的纤维素；通过富集菌体、细胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗涤制备酒醅总DNA的方法。本发明的方法不仅除去了酒醅中干扰DNA提取的淀粉、纤维素及腐植酸等杂质，且试剂易于获取、降低了实验成本；通过破壁条件的改变，利用酶、物理、化学相结合的方法可将真菌及细菌的基因组DNA完整地提取出来。该方法有助于提高大曲高粱酒醅总DNA的提取质量，具有良好的应用前景。

Description

通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法

技术领域

本发明属于生物领域，涉及酒醅DNA的制备方法，具体涉及通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取量的方法，特别涉及采用中温淀粉酶、液化酶对大曲高粱酒醅进行预处理，降解大部分淀粉，再利用纤维素酶降解酒醅中的纤维素，通过富集菌体、细胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗涤制备酒醅总DNA的方法。

背景技术

常规环境样品中总DNA的提取经常采用无菌去离子水涡旋振荡洗涤、离心的方法富集菌体，目的是在微生物细胞裂解释放DNA之前，先将微生物细胞从它们的环境基质中分离出来。但这一方法对酒醅并不适用。大曲高粱酒醅样品微生物大多富集在酒醅中的谷物上，对酒醅样品先用无菌去离子水涡旋振荡洗涤，很多杂质也与菌体混杂，导致洗涤液中不仅有微生物细胞，还有大量淀粉、纤维素及腐植酸。这些物质分子较大，易随菌体沉降。且在细胞破壁处理阶段由于温度、金属离子的影响，淀粉链打开，易与DNA链缠绕且具有吸附性，将导致抽提步骤不能将酒醅样品中的微生物DNA尽量完整地提取出来，分析结果反映的样品微生物群落具有片面性。这无疑为酒醅样品中微生物群落多样性的分析带来影响。

由于酒醅本身所具有的特殊性，即不同发酵阶段的酒醅样品中各种微生物的数量与比例有所不同，利用酶、物理、化学相结合的方法可将真菌及细菌的基因组DNA完整地提取出来。

中国白酒各香型、品种的酒醅成分（粮食种类）、微生物组成千差万别，酒醅总DNA的提取方法也应有所不同。但在目前酒醅DNA提取方法较为单一。2012年12月12日国家知识产权局公布了“通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法”，专利申请号：CN201210344426.X；公开号：CN102816757A。但这种方法并不适用于大曲高粱酒醅。在多次实验的基础上，我们提供一种采用中温淀粉酶、液化酶及纤维素酶对大曲高粱酒醅进行预处理，降解大部分淀粉和纤维素，再通过富集菌体、细胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗涤操作制备酒醅总DNA的方法，不仅试剂易于获取、降低了实验成本，并且可通过破壁条件的改变，利用酶、物理、化学相结合的方法可将真菌及细菌的基因组DNA完整地提取出来。该方法有助于提高大曲高粱酒醅总DNA的提取质量，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对酒醅DNA提取困难的现状，提供一种通过淀粉酶、液化酶、纤维素酶预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法，为分析酒醅样品中微生物群落多样性奠定基础。

实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法是采用中温淀粉酶、液化酶对大曲高粱酒醅进行预处理，降解大部分淀粉；再利用纤维素酶降解酒醅中的纤维素；通过富集菌体、细胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗涤制备酒醅总DNA。

上述通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法的附加技术特征还包括：

——所述酒醅预处理：10 g~20 g酒醅置入含90 ml无菌水三角瓶中，振荡10 min ~15 min，取上层液体5 ml ~10 ml，置于灭菌离心管中，11000 r/min~13000 r/min离心5min，弃上清，重复此步骤以无菌去离子水洗涤一次，沉淀加入3 ml ~5 ml 5%中温淀粉酶液混匀，45 ℃~50 ℃保温1 h后再加入1 ml液化酶混匀，45 ℃~50 ℃保温1 h；保温结束后11000 r/min~13000 r/min离心5min，弃上清液后加入无菌去离子水混匀；加入3 ml ~5 ml 5%纤维素酶液混匀，45 ℃~50 ℃保温1 h，11000 r/min~13000 r/min离心5min，弃上清液后加入无菌去离子水混匀，重复此步骤以彻底去除干扰物质。

——所述细胞破壁、降解蛋白：富集菌体后的离心管中加入2 ml缓冲液，50 μl 50 mg/ml溶菌酶和60μl 20 mg/ml溶壁酶24 ℃~26 ℃水浴30 min，35 ℃~39 ℃水浴30 min；加入200μl 10%SDS（十二烷基硫酸钠）（或100μl 20%SDS）和100 μl 20 mg/ml蛋白酶K；45 ℃~50 ℃水浴1-1.5 h，加0.1g玻璃珠，剧烈震荡2 min；冻融3次，每次5 min；

——所述DNA的抽提：加入600 ul 5mol/L Nacl和200 ul 10% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），45 ℃~50 ℃水浴20 min；加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀；11000 r/min~13000 r/min离心10 min，将上清液转移到新离心管中，若上层水相很浑浊，需重复此步骤；加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀；11000 r/min~13000 r/min离心10min，将上清液转移到新离心管中，若上层水相很浑浊，需重复此步骤；

——所述DNA沉淀和洗涤：加0.6倍体积异戊醇，-70 ℃~-20 ℃过夜；11000 r/min~13000 r/min离心15 min，尽量倒干净液体；用500 ul预冷的70%乙醇洗涤，11000 r/min~13000 r/min离心15 min；弃上清液，65 ℃烘干30 min，到烘干为止，加TE缓冲液（或无菌去离子水）溶解保存。即可得酒醅DNA。

需要说明的是：

由于预处理步骤加入了淀粉酶、液化酶和纤维素酶，这些酶部分随菌体沉降被带入后续操作步骤，可用蛋白酶K降解除去。因此细胞破壁、除蛋白步骤中蛋白酶K的加入量高于其他提取方法。

本发明所提供的通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取量的方法，与现有技术相比具有以下优点：其一，由于在酒醅预处理中采用中温淀粉酶、液化酶对大曲高粱酒醅进行预处理，降解酒醅处理液中大部分淀粉，减少其对后续DNA提取步骤的影响；其二，采用纤维素酶对大曲高粱酒醅进行预处理，降解酒醅处理液中大部分纤维素，减少其对后续DNA提取步骤的影响；其三，本发明的方法不仅除去了酒醅中干扰DNA提取的淀粉、纤维素及腐植酸等杂质，且试剂易于获取、降低了实验成本；通过破壁条件的改变，利用酶、物理、化学相结合的方法可将真菌及细菌的基因组DNA完整地提取出来。该方法有助于提高大曲高粱酒醅总DNA的提取质量，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细阐述。

实施例1：

酒醅预处理：取20 g发酵至第2 d酒醅置入含90 ml无菌水三角瓶中，振荡15 min，取上层液体10 ml置于灭菌离心管中，12000 r/min离心5min，弃上清，重复此步骤以无菌去离子水洗涤一次，沉淀加入5 ml 5%中温淀粉酶液混匀，49 ℃保温1 h后再加入1 ml液化酶混匀，49 ℃保温1 h。之后12000 r/min离心5min，弃上清加入无菌去离子水、5 ml 5%纤维素酶液混匀，49 ℃保温1 h，12000 r/min离心5min，弃上清加入无菌去离子水混匀，重复此步骤一次。

细胞破壁、除蛋白：富集菌体后的离心管中加入2 ml缓冲液，50 μl 50 mg/ml溶菌酶和60μl 20 mg/ml溶壁酶25 ℃水浴30 min，37 ℃水浴30 min；加入200μl 10%SDS（十二烷基硫酸钠）（或100μl 20%SDS）和100 μl 20 mg/ml蛋白酶K；49 ℃水浴1-1.5 h，加0.1g玻璃珠，剧烈震荡2 min；冻融3次，每次5 min；

DNA提取：加入600 ul 5mol/L Nacl和200 ul 10% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），49 ℃水浴20 min；加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀；12000 r/min离心10 min，将上清液转移到新离心管中，若上层水相很浑浊，需重复此步骤；加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀；再次离心10min，将上清液转移到新离心管中，若上层水相很浑浊，需重复此步骤；

DNA沉降：加0.6倍体积异戊醇，-70 ℃~-20 ℃过夜；13000 r/min离心15 min，尽量倒干净液体；用500 ul预冷的70%乙醇洗涤，13000 r/min离心15 min；弃上清液，65 ℃烘干30 min，到烘干为止，加TE缓冲液（或无菌去离子水）溶解保存。即可得酒醅DNA。

实施例2：

酒醅预处理：取10 g发酵至第5 d酒醅置入含90 ml无菌水三角瓶中，振荡10 min，取上层液体10 ml置于灭菌离心管中，11000 r/min离心5min，弃上清，重复此步骤以无菌去离子水洗涤一次，沉淀加入5 ml 5%中温淀粉酶液混匀，49 ℃保温1 h后再加入1 ml液化酶混匀，49 ℃保温1 h。之后11000 r/min离心5min，弃上清加入无菌去离子水、5 ml 5%纤维素酶液混匀，49 ℃保温1 h，11000 r/min离心5min，弃上清加入无菌去离子水混匀，重复此步骤一次。

细胞破壁、除蛋白：富集菌体后的离心管中加入2 ml缓冲液，50 μl 50 mg/ml溶菌酶和60μl 20 mg/ml溶壁酶24 ℃水浴30 min，37 ℃水浴30 min；加入200μl 10%SDS（十二烷基硫酸钠）（或100μl 20%SDS）和100 μl 20 mg/ml蛋白酶K；49 ℃水浴1 h，加0.1g玻璃珠，剧烈震荡2 min；冻融3次，每次5 min；

DNA提取步骤同实施例1；

DNA沉降步骤同实施例1。

Claims

1.通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法，其特征在于：采用中温淀粉酶、液化酶对大曲高粱酒醅预处理，降解大部分淀粉；再利用纤维素酶降解酒醅中的纤维素；通过富集菌体、细胞破壁、降解蛋白、抽提、沉淀和洗涤制备酒醅总DNA。

2.根据权利要求1所述的通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法，其特征在于：所述的酒醅预处理：10 g~20 g酒醅置入含90 ml无菌水瓶中，振荡10 min ~15 min，取上层液体5 ml ~10 ml，置于灭菌离心管中，11000 r/min~13000 r/min离心5min，弃上清，重复此步骤以无菌去离子水洗涤一次，沉淀加入3 ml ~5 ml 5%中温淀粉酶液混匀，45 ℃~50 ℃保温1 h后再加入1 ml液化酶混匀，45 ℃~50 ℃保温1 h；保温结束后11000 r/min~13000 r/min离心5min，弃上清液后加入无菌去离子水混匀；加入3 ml ~5 ml 5%纤维素酶液混匀，45 ℃~50 ℃保温1 h，11000 r/min~13000 r/min离心5min，弃上清液后加入无菌去离子水混匀，重复此步骤以彻底去除干扰物质。

3.根据权利要求1所述的通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法，其特征在于：所述的细胞破壁、降解蛋白：富集菌体后的离心管中加入2 ml缓冲液，50 μl 50 mg/ml溶菌酶和60μl 20 mg/ml溶壁酶24 ℃~26 ℃水浴30 min，35 ℃~39 ℃水浴30 min；加入200μl 10%SDS（十二烷基硫酸钠）或100μl 20%SDS和100 μl 20 mg/ml蛋白酶K；45 ℃~50 ℃水浴1-1.5 h，加0.1g玻璃珠，剧烈震荡2 min；冻融3次，每次5 min。

4.根据权利要求1所述的通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法，其特征在于：所述的抽提：加入600 ul 5mol/L Nacl和200 ul 10% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），45 ℃~50 ℃水浴20 min；加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀；11000 r/min~13000 r/min离心10 min，将上清液转移到新离心管中，若上层水相很浑浊，需重复此步骤；加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀；11000 r/min~13000 r/min离心10min，将上清液转移到新离心管中，若上层水相很浑浊，需重复此步骤。

5.根据权利要求1所述的通过预处理提高大曲高粱酒醅总DNA提取质量的方法，其特征在于：所述的DNA沉降、洗涤：加0.6倍体积异戊醇，-70 ℃~-20 ℃过夜；11000 r/min~13000 r/min离心15 min，尽量倒干净液体；用500 ul预冷的70%乙醇洗涤，11000 r/min~13000 r/min离心15 min；弃上清液，65 ℃烘干30 min，到烘干为止，加TE缓冲液或无菌去离子水溶解保存；即可得酒醅DNA。