CN113215146A - 从白酒大曲或酒醅中提取微生物总dna的方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法及用途。本发明所解决的技术问题是针对白酒大曲或酒醅微生物中DNA提取困难的现状，提供一种通过物理法、酶法和试剂盒法联用提高微生物总DNA提取质量的方法。本发明的方法中试剂易于获取，操作方法也较为简单，利用酶、物理相结合的方法破壁，得到的真菌及细菌的基因组DNA较为完整，纯度也高，提取质量稳定。本发明的方法不仅适用于大曲微生物总DNA的提取，对于提取酒醅微生物总DNA也有较好的效果。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法及用途。
背景技术
中国白酒酿造历史悠久，因其独特的口感深受大众喜爱，具有较高的经济价值。根据白酒风味特征的不同，可以将其分为三种主要类型：浓香型白酒、酱香型白酒和清香型白酒。白酒的酿造采用了传统固态糖化发酵工艺，大曲是酿造浓香型白酒的关键，它富含微生物、酶与香味代谢物，不仅是白酒酿造的重要物质基础，也为制酒过程提供糖化发酵，生香的酶源及香味前体物质。但开放的制曲方式造成了制曲的原材料、环境、工具等方面都有可能带入微生物，这使得大曲的微生物来源十分广泛，这些不稳定因素将会导致大曲品质的波动性，最终影响白酒品质与产量的稳定性。因此研究大曲中微生物群落结构对稳定和改善白酒品质显得尤为重要。
随着测序技术、组学技术、分子生物学技术的不断进步发展，大曲中混菌发酵体系的研究有了必要的技术保障。目前对大曲微生物的研究还主要集中在通过可培养法对大曲中可培养微生物的研究分析，但传统的可培养法，能培养的微生物种类是有限的，大部分的不可培养微生物难以被发现，得到的微生物群不能准确的代表整个大曲的微生物群落组成。应用分子生物学的方法，能有效地克服传统可培养技术的不足，扩增子测序能更加快速准确的得到大曲微生物组成，宏基因组学还能对群落中微生物的潜在功能进行预测。
但是，无论是扩增子测序还是宏基因组测序，都需要先从大曲样品中获得微生物总DNA，微生物总DNA的质量决定了测序结果的准确性。然而，因为大曲样品中复杂的成分，对微生物总DNA的提取造成了一定的难度。目前对于微生物总DNA的提取的方法主要是化学法和试剂盒法，但化学法提取的基因组片段较小，且纯度低，试剂盒法提取的基因组浓度则较低，因此急需要一种能提取出完整性较好、纯度和浓度高的基因组的方法。
发明内容
本发明的目的是针对白酒大曲和酒醅微生物中DNA提取困难的现状，提供一种通过物理法、酶法和试剂盒法联用提高微生物总DNA提取质量的方法，为分析白酒大曲和酒醅样品中微生物群落多样性奠定基础。
本发明提供了从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，包括以下步骤：
从白酒大曲或酒醅中收集菌体，反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，包括以下步骤：
a、白酒大曲或酒醅中加PBS缓冲液震荡、离心后，收集上清液；重复前述步骤，合并上清液；
b、将收集的上清液离心后，收集菌体沉淀；
c、将菌体沉淀重悬于PBS缓冲液中，得菌体重悬液；
d、将菌体重悬液反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述白酒大曲种类为高温大曲、中温大曲或低温大曲。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤a中，所述白酒大曲或酒醅量为3～10g。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤a中，PBS缓冲液加入量为每克白酒大曲或酒醅加入2～4mL PBS缓冲液。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤a中，离心力为150～200g，时间为3～5min。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤b中，离心力为9000～11000g，离心时间8～12min。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤c中，重悬的PBS缓冲液的体积为0.5～1mL。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述反复冻融过程中，液氮冷冻时间为10～120s，加热温度为50～70℃，加热时间为1～4min，反复冻融次数为2～5次。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，反复冻融后依次加入溶壁酶、溶菌酶、RNA酶和蛋白酶K并分别在相应的酶反应温度下反应。
进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶壁酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L。
进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶壁酶的反应温度为30℃，时间为1～2h。
进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶菌酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L。
进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶菌酶的反应温度为37℃，时间为0.5～1.5h。
进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述RNA酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L。
进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述RNA酶的反应温度为37℃，时间为1～2h。
进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述蛋白酶K的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.05～0.5g/L。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述蛋白酶K的反应温度为65℃，时间为0.5～1.5h。
其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，使用的试剂盒为土壤基因组提取试剂盒。
有益效果：本发明所提供的提取微生物总DNA的方法，与现有技术相比具有以下优点：
1、在含微生物的样品预处理阶段，采用了反复冻融方法，使得细胞破裂，有助于后续的基因组提取；在细胞破裂后，依次使用了溶壁酶、溶菌酶、RNA酶和蛋白酶K，不仅能提高基因组提取的量，还能有效的去除基因组中RNA和其他杂质，提高了所提基因组的质量，最后加入蛋白酶K还可去除前面步骤中所加入的酶；
2、本发明的方法中试剂易于获取，操作方法也较为简单，利用酶、物理相结合的方法破壁，得到的真菌及细菌的基因组DNA较为完整，纯度也高，提取质量稳定。且该方法有助于提高大曲微生物和酒醅微生物总DNA的提取质量，具有良好的应用前景；
3、本发明的方法不仅适用于大曲微生物总DNA的提取，对于提取酒醅微生物总DNA也有较好的效果。
附图说明
图1为不同样品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中1为高温大曲样品，2为中温大曲样品，3为低温大曲样品，4为酒醅样品。
图2为不同样品基因组DNA扩增16S rDNA和ITS琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中1为高温大曲样品，2为中温大曲样品，3为低温大曲样品，4为酒醅样品。
图3为对比例中提取大曲中的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中1是对比例1；2是对比例2；3是对比例3；4是对比例4；5是对比例5；6是对比例6。
具体实施方式
本发明提供了从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，包括以下步骤：
a、称取3～10g的白酒大曲或酒醅，按照每克白酒大曲或酒醅中加入2～4mL PBS缓冲液的比例加PBS缓冲液，加入玻璃珠3～10颗，玻璃珠大小4～5mm，充分震荡，震荡时间为3～10min，然后低速离心，将大颗粒杂质去除，收集上清液，然后再在沉淀中加入PBS缓冲液重复洗两次，每次PBS缓冲液加入量为5～10mL，然后离心，收集上清液。
其中，低速离心力为150～200g，时间为3～5min；在这个离心条件下上清液中很少存在谷物残渣，离心力低于150g时，上清液中的谷物残渣较多；离心力高于200g时，菌体易沉淀。
b、将收集的上清液合并高速离心后，收集菌体沉淀；其中高速离心力为9000～11000g，离心时间8～12min；在这个离心条件下，能获得合适的菌体沉淀量，利于后期基因组的提取。
c、将菌体沉淀加入适量PBS缓冲液，混悬均匀，转移至EP管中，然后使菌体沉淀重悬于PBS缓冲液中，得菌体重悬液。
重悬菌体所加的PBS缓存液的量也应该根据菌体量来进行决定，每0.1g菌体加0.5mL PBS缓冲液较为合适，重悬液太稠或者太稀，会造成所提取基因组质量不佳。因此，本发明每0.1g菌体加0.5mL PBS缓冲液。
d、将菌体重悬液反复冻融后按顺序分别依次加入溶壁酶、溶菌酶、RNA酶和蛋白酶K在相对应的温度下水浴加热反应，最后使用试剂盒，提取微生物总DNA。
本发明采用反复冻融方法，使得细胞破裂，有助于后续的基因组提取；在细胞破裂后，依次使用了溶壁酶、溶菌酶、RNA酶和蛋白酶K，不仅能提高基因组提取的量，还能有效的去除基因组中RNA和其他杂质，提高了所提基因组的质量，最后加入蛋白酶K还可去除前面步骤中所加入的酶。进一步地，本发明将溶壁酶加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L，溶菌酶为0.1～0.5g/L，RNA酶为0.1～0.5g/L，蛋白酶K为0.05～0.5g/L，更有利于基因组的提取。
不同酶活性不同，反应的温度也不同，本发明的溶壁酶的反应温度为30℃，时间为1～2h；溶菌酶的反应温度为37℃，时间为0.5～1.5h；RNA酶的反应温度为37℃，时间为1～2h；蛋白酶K的反应温度为65℃，时间为0.5～1.5h。
不同试剂盒，提出的基因组效果会有一定的差异，因此本发明选用市面上土壤基因组提取试剂盒；优选地，选用QIAGEN公司DNeasy PowerSoil Pro Kit试剂盒。
实施例1高温大曲微生物总DNA的提取
1.称取5g高温大曲样品，加入15mL PBS缓冲液于50mL的离心管中，加入玻璃珠3颗，充分震荡5min，然后以离心力为150g离心5min，取上清液于离心管中。
2.再加入5mL PBS缓冲液重复洗两次，150g离心5min，收集上清液。
3.将所收集的所有上清液在10000g离心10min，然后收集沉淀，加入2mL PBS缓冲液，混悬均匀，转移至EP管中；10000g离心10min，得菌体沉淀。收集菌体沉淀，重悬于0.5mLPBS溶液中。
4.将菌体重悬液反复冻融，液氮下冷冻30s，70℃水浴2min，重复三次。
5.加入5μL的溶壁酶(20g/L)、30℃水浴1h；再加入2μL溶菌酶(50g/L)，37℃水浴30min；再加入5μLRNA酶(10g/L)，37℃水浴1h，最后加入2.5μL蛋白酶K(10g/L)，65℃水浴30min。
6.使用QIAGEN公司DNeasy PowerSoil Pro Kit试剂盒，提取微生物总DNA。
7.微生物总DNA质量检测，取4μL的微生物总DNA，在电压120V的恒压条件下进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下进行显色拍照，观察条带。采用核酸定量仪测量DNA的浓度和测定OD260/280、OD260/230值。
8.以提取得到的DNA为模板，分别设计了真菌和细菌的引物，对其进行PCR扩增。引物的序列如下：真菌的引物为ITS1(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(SEQ ID NO:1))和ITS4(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO:2))；
细菌的引物为27F(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO:3))和1492R(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO:4))。
PCR模板量为用0.5μL，扩增体系为ExTaq系，扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸lmin，共30个循环，72℃终延伸10min。
实施例2中温大曲微生物总DNA的提取
称取10g中温大曲样品，加入20mL PBS缓冲液于50mL的离心管中，加入玻璃珠3颗，充分震荡5min，然后150g离心5min，取上清于离心管中。
剩下步骤同实施例1。
实施例3低温大曲微生物总DNA的提取
称取10g低温大曲样品，加入30mL PBS缓冲液于50mL的离心管中，加入玻璃珠3颗，充分震荡5min，然后150g离心5min，取上清于离心管中。
剩下步骤同实施例1。
实施例4酒醅微生物总DNA的提取
称取10g酒醅样品，加入30mL PBS缓冲液于50mL的离心管中，加入玻璃珠3颗，充分震荡5min，然后150g离心5min，取上清于离心管中。
剩下步骤同实施例1。
对比例1化学直接提取法提取中温大曲微生物总DNA
1.称取5g高温大曲样品，加入15mL PBS缓冲液于50mL的离心管中，加入玻璃珠3颗，充分震荡5min，然后以离心力为150g离心5min，取上清液于离心管中。
2.再加入5mL PBS缓冲液重复洗两次，150g离心5min，收集上清液。
3.将所收集的所有上清液在10000g离心10min，然后收集沉淀，加入2mL PBS缓冲液，混悬均匀，转移至EP管中；10000g离心10min，得菌体沉淀。收集菌体沉淀，重悬于0.5mLPBS溶液中。
4.加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1体积比)，上下颠倒混匀，静置5min，12000r/min离心10min。
5.在上清液中加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20℃放置30min以上。12000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加入400μL TE缓冲液(Tris-HCl(1M，pH8.0)5.0mL；EDTA(0.5M，pH8.0)1.0mL；pH8.0；定容至500mL)、80μL CTAB/NaCl(称取2.05g NaCl、5g CTAB，加去离子水溶解，定容至50mL)、100μL NaCl(5mol/L)，上下颠倒混匀，65℃水浴15min，每2min上下颠倒混匀一次。
6.取上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，上下颠倒混匀，静置5min，12000r/min离心10min。
7.取上清转入另一离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(氯仿：异戊醇＝24：1，体积比)，颠倒混匀，12000r/min离心10min。
8.取上清转入另一离心管中，加入等体积的异戊醇，混匀。-20℃放置30min，12000r/min离心10min，弃上清，加入70％乙醇500μL，弹起沉淀，12000r/min离心5min，弃上清，重复一次。
9.弃上清，用灭菌的滤纸条吸干残液，风干沉淀。
对比例2超声破碎法与化学直接提取法联用提取中温大曲微生物总DNA
在对比例1中的第3步和第4步之间添加以下操作：
超声破碎，加入等量玻璃珠，超声波破碎(仪器参数设置：时间10min，运行3s，停止7s)。离心(4℃，15000r/min，10min)，取上清。
对比例3酶法与化学直接提取法联用提取中温大曲微生物总DNA
在对比例1中的第3步和第4步之间添加以下操作：
加入5μL的溶壁酶(20g/L)、30℃水浴1h；再加入2μL溶菌酶(50g/L)，37℃水浴30min；再加入5μLRNA酶(10g/L)，37℃水浴1h，最后加入2.5μL蛋白酶K(10g/L)，65℃水浴30min。
对比例4超声、酶法与化学直接提取法联用提取中温大曲微生物总DNA
在对比例1中的第3步和第4步之间添加以下操作：
加入等量玻璃珠，超声波破碎(仪器参数设置：时间10min，运行3s，停止7s)，离心(4℃，15000r/min，10min)，取上清。加入5μL的溶壁酶(20g/L)、30℃水浴1h；再加入2μL溶菌酶(50g/L)，37℃水浴30min；再加入5μL RNA酶(10g/L)，37℃水浴1h，最后加入2.5μL蛋白酶K(10g/L)，65℃水浴30min。
对比例5反复冻融法与化学直接提取法联用提取中温大曲微生物总DNA
在对比例1中的第3步和第4步之间添加以下操作：
震荡30s，液氮冷冻30s，70℃水浴融解2min。重复上述震荡、冷冻、融解过程3次，离心(4℃，15000r/min，10min)，取上清。
对比例6反复冻融、酶法与化学直接提取法联用提取中温大曲微生物总DNA
在对比例1中的第3步和第4步之间添加以下操作：
震荡30s，液氮冷冻30s，70℃水浴融解2min。重复上述震荡、冷冻、融解过程3次。离心(4℃，15000r/min，10min)，取上清。加入5μL的溶壁酶(20g/L)、30℃水浴1h；再加入2μL溶菌酶(50g/L)，37℃水浴30min；再加入5μLRNA酶(10g/L)，37℃水浴1h，最后加入2.5μL蛋白酶K(10g/L)，65℃水浴30min。
表1为实施例和对比例所提取的基因组DNA的检测结果。由表可以看出，实施例中所提取的基因组DNA的浓度在45～70ng/uL，所提浓度较为稳定，而用化学法提取的基因组DNA不同的预处理方法得到的浓度相差很大，但可以看到对比例6也就是采用反复冻融和酶法进行预处理得到的基因组浓度更高，这也是本发明选择此方法进行预处理的原因。OD260/OD280和OD260/OD230的值则是用来判断基因组纯度的，其标准范围分别为1.7～1.8和1.7～2.0。实施例中所提取的基因组DNA相比较于对比例其值更接近于标准范围，证明实施例所提取的基因组DNA纯度更高。
图1和图3是实施例和对比例所提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图，可以看到实施例所提取的基因组DNA片段大小都在15000bp上，且几乎没有弥散现象，而对比例所提取的基因组DNA片段大小很小，为250bp左右，弥散现象较为严重。因此实施例方法所提取的基因组DNA较为完整。图2为实施例基因组DNA扩增16S rDNA和ITS琼脂糖凝胶电泳检测结果图，均有明显的条带出现，证明该方法能同时提出真菌和细菌的基因组。
表1所提取基因组DNA检测结果
序列表
<110> 宜宾五粮液股份有限公司
<120> 从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法及用途
<130> A210336K（序）
<141> 2021-05-26
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Aartificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Aartificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Aartificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Aartificial Sequence)
<400> 4
tacggctacc ttgttacgac tt 22
Claims (8)
1.从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
从白酒大曲或酒醅中收集菌体，反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。
2.根据权利要求1所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、白酒大曲或酒醅中加PBS缓冲液震荡、离心后，收集上清液；重复前述步骤，合并上清液；
b、将收集的上清液离心后，收集菌体沉淀；
c、将菌体沉淀重悬于PBS缓冲液中，得菌体重悬液；
d、将菌体重悬液反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。
3.根据权利要求1或2所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：所述白酒大曲种类为高温大曲、中温大曲或低温大曲。
4.根据权利要求2或3所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：步骤a中，PBS缓冲液加入量为每克白酒大曲或酒醅加入2～4mL PBS缓冲液。
5.根据权利要求1～4任一项所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：所述反复冻融过程中，液氮冷冻时间为10～120s，加热温度为50～70℃，加热时间为1～4min，反复冻融次数为2～5次。
6.根据权利要求1～5任一项所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：反复冻融后依次加入溶壁酶、溶菌酶、RNA酶和蛋白酶K并分别在相应的酶反应温度下反应。
7.根据权利要求6所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：所述溶壁酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L，反应温度为30℃，时间为1～2h；所述溶菌酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L，反应温度为37℃，时间为0.5～1.5h；所述RNA酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L，反应温度为37℃，时间为1～2h；所述蛋白酶K的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.05～0.5g/L，反应温度为65℃，时间为0.5～1.5h。
8.根据权利要求1或2所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：使用的试剂盒为土壤基因组提取试剂盒。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘念: "浓香型白酒糟醅中真菌菌群的研究", 《食品与发酵科技》 * |
| 沈才萍等: "酒醅微生物的分子生物学研究", 《技术与市场》 * |
| 闫亮珍等: "汾酒大曲和酒醅样品DNA提取方法的优化", 《食品与发酵工业》 * |
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