CN117603963A - 一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker、试剂盒及方法和应用 - Google Patents

一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker、试剂盒及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物分子生态学检测技术领域，具体公开了一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker、试剂盒及方法和应用，所述DNA Marker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.20所示。本发明提供的DNA Marker是通过其物种特异性序列(ITS1区)来精准表征样品DNA所属的菌属地位，Marker的每条组成条带都为单一序列，代表特定的菌种，仅限于在变性梯度凝胶电泳中使用，结果可靠，特异性好，灵敏度高、安全、直观、多个样本可同时分析并体现各样本的差异。

Description

一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker、试剂盒及方法和 应用
技术领域
本发明涉及微生物分子生态学检测技术领域，具体涉及一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker、试剂盒及方法和应用。
背景技术
酵母和霉菌是中国白酒发酵中主要的真核微生物，对于白酒酿造中大分子物质的分解、酒精发酵、风味物质的合成等起着重要的作用。清香型白酒的主体香味物质是乙酸乙酯和乳酸乙酯，主要合成途径分别是酵母菌代谢与酸和醇在酯化酶作用下的化学合成，这两种途径都需要微生物的参与。酵母在白酒生产中的功能主要分成两方面，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是主要的酒精发酵酵母，合成白酒中主要成分-乙醇；non-Saccharomyces则能够形成酯类、
酸类、高级醇类和醛类等代谢产物。霉菌也主要起两种作用。一方面，霉菌能分泌多种水解酶，分解原料中的大分子底物，以供酵母生长所需；另一方面，也能形成酯类等代谢产物。
清香型白酒发酵阶段包括大茬发酵和二茬发酵两个阶段，不同发酵阶段的发酵工艺均存在差异。因此，不同发酵条件下酒醅中微生物群落结构存在差异，对酒的品质也会造成一定的影响。以汾酒酿造的两大重要环节—制曲和发酵为突破点，认识酿造微生物群体生态特征，寻找关键功能微生物，对于丰富中国白酒的酿造科学理论和实现白酒现代化生产具有重要的意义和价值。
现在多采用实时荧光定量PCR和高通量测序探究不同环境真菌群落的丰度、多样性、组成和结构，实时荧光定量PCR检测真菌受制于：所需试剂价格昂贵，实验使用次数少，无法做到批量检测鉴定真菌。基因测序虽然操作简便，但存在的问题是测序成本贵，测序错误率高，同时依赖大型科研仪器与专业的生物信息分析人员，并且检测周期也比较长(用时长达1-2个月)。而生产工过程调控又要求快速检测微生物的动态变化，以便掌握发酵状态并制定相应的调控策略。目前，仍然缺乏快速、准确检测微生物的动态变化的方法。
目前缺乏汾酒酿造过程中适用于中国白酒酿造环境中真菌菌群结构的快速检测的试剂盒及方法。因此，建立适用于中国白酒酿造环境中真菌菌群结构的快速检测的试剂盒及方法，有助于深入解析酵母和霉菌对白酒品质的作用，为明确白酒中功能微生物、监控白酒生产过程、优化生产菌种组合提供技术支持。
发明内容
为建立一种适用于酿酒过程的真菌群落的快速检测方法，本发明提供了一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker、试剂盒及方法和应用。本发明提供的DNA Marker是通过其物种特异性序列(ITS1区)来精准表征样品DNA所属的菌属地位，Marker的每条组成条带都为单一序列，代表特定的菌种，结果可靠，特异性好，灵敏度高、安全、直观、多个样本可同时分析并体现各样本的差异。
本发明提供了一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker，所述DNA Marker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.20所示。
进一步地，所述DNA Marker中SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.20所示的片段依次指示的菌为Rhizopus oryzae、Candida humilis、Aspergillus chevalieri、UnculturedAspergillus、Monascus purpureus、Preussia terricola、Preussia terricola、Saccharomycopsis fibuligera、Kazachstania humilis、Pichia Kudriavzevii、Monascuspurpureus、Aspergillus flavus、Cortinarius rubricosus、Thermoascus aurantiacus、Saccharomyces cerevisiae、Hanseniaspora osmophila和Torulaspora delbrueckii。
本发明提供了一种包含所述的DNA Marker的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括引物组、PCR缓冲液和STE缓冲液。
进一步地，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的片段。
本发明还提供了一种所述的清香型白酒真菌快速检测DNA Marker的制备方法，包括如下步骤：
提取清香型白酒酿造微生物总基因组DNA，以提取的微生物基因组DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ITS1F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ITS1R为引物，第一次PCR扩增真菌ITS1区序列，将第一次PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收真菌ITS1区序列片段；
分别以回收的真菌ITS1区序列片段为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的ITS1F-GC和ITS1R为引物进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物进行DGGE分析，从DGGE胶上切下的DNA片段为真菌ITS1区DNA片段；
分别以DGGE胶上切下的真菌ITS1区DNA片段为模板，以ITS1F和ITS1R为引物进行第三次PCR扩增，回收第三次PCR扩增产物；
分别将第三次PCR扩增产物克隆到T载体上获得连接产物，连接产物转入感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，DGGE分析，验证条带在DGGE胶片上的位置，筛选条带在DGGE图谱上与模板条带电泳行为一致的质粒；
将所有在DGGE图谱上与模板条带电泳行为一致的质粒混合获得混合质粒，以混合质粒为模板，以序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的片段为引物，进行第四次PCR扩增，第四次PCR扩增产物与6×DNA Loading buffer以体积比5：1混合均匀，即获得DNA Marker。
本发明还提供了一种利用所述的DNA Marker检测清香型白酒中真菌的方法，包括如下步骤：
提取待测样品微生物基因组总DNA；
以待测样品微生物基因组总DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
琼脂糖凝胶电泳结束后，将含有DNA条带的凝胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品某一条带与DNA Marker中条带在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品中含有DNA Marker中条带所指示的真菌；当待测样品没有条带或条带与DNA Marker中条带在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有对应的真菌。
进一步地，以超纯水为模板获得的扩增产物作为阴性对照，以DNA Marker为模板获得的扩增产物作为待测样品对比的标准。
本发明还提供了一种所述的DNA Marker或所述的试剂盒在清香型白酒酿造过程真菌检测中的应用。
进一步地，所述DNA Marker由ZM1、ZM2和ZM3组成，使用时同时加入单独泳道作为标准Marker。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的DNA Marker是通过其物种特异性序列(ITS1区)来精准表征样品DNA所属的菌属地位，Marker的每条组成条带都为单一序列，代表特定的菌种，仅限于在变性梯度凝胶电泳中使用。
利用本发明的检测方法检测白酒中的真菌只需要20小时左右，比传统的高通量检测用时节省将近30-40天；且本发明具有以下优点：结果可靠，特异性好，灵敏度高、安全、直观、多个样本可同时分析并体现各样本的差异。在实验耗材上，价格低，同时实验技术易普及，操作简单。本发明是一种高效快速经济便捷的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明使用汾酒酒醅基因组DNA提取结果0.7％琼脂糖凝胶电泳图，M为Lambda DNA/HindIII。
图2为本发明使用汾酒酒醅基因组DNA进行PCR扩增真菌ITS1区的结果1.5％琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明使用汾酒酒醅基因组DNA进行PCR扩增真菌ITS1区扩增产物的DGGE图谱，DGGE的电泳条件为预电泳200V，5min，然后85V，11h，胶浓度为8％，变性范围为30％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国BIO-RAD公司生产的D-Code UniversalMutation Detection System(Bio-Rad,USA)；
图4为本发明筛选阳性克隆子菌落PCR结果1.5％琼脂糖凝胶电泳图。
图5为本发明筛选部分DGGE Marker组成条带的DGGE图谱，图中a、b、c、d、e、f、g、h、i分别为DGGE Marker的组成条带，DGGE的电泳条件为预电泳200V，5min，然后85V，11h，胶浓度为8％，变性范围为30％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国BIO-RAD公司生产的D-Code Universal Mutation Detection System(Bio-Rad,USA)。
图6为本发明制备的清香型白酒微生物PCR-DGGE检测中真菌物种DNA Marker(命名为6CBMbac1)的DGGE电泳图谱，以及各序列菌属相似性比对结果。DGGE的电泳条件为预电泳200V，5min，然后85V，11h。胶浓度为8％，变性范围为30％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国BIO-RAD公司生产的D-Code Universal Mutation Detection System(Bio-Rad,USA)。
图7为应用本发明制备的真菌物种DNA Marker(CBMbac1)对其他样品进行检测的DGGE电泳图谱，图中ZM1、ZM2、ZM3为本发明制备的用于检测清香型白酒酿造过程真菌物种的DNA Marker，其他为培养样品，DGGE的电泳条件为预电泳200V，5min，然后85V，11h。胶浓度为8％，变性范围为30％-60％，电泳液温度为60℃，采用的设备为美国BIO-RAD公司生产的D-Code Universal Mutation Detection System(Bio-Rad,USA)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：一种用于检测清香型白酒真菌物种的DNA Maker及其制备方法。
检测清香型白酒真菌物种的DNA Maker由17条DNA片段组成，其核苷酸序列如SEQID NO.4-SEQ ID NO.20所示。
SEQ ID NO.4：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATTATGTTAAAGCGCCTTACCTTAGGGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGTACCCTTCATAATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGATCGATGAAGAACGCAGC
SEQ ID NO.5：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAATATTTTGGTTACTGCGTAAGCAGATTTGATGGCACTGTATAATAGAAAATAATTGTTTGTGTTTGGCGAGCTGGACTTTCGCCCAGCCCAAGAATAAGTAATTACTCCACTGTGTGTAAGAGGCGGAGCGCCACCGCGCAGCTAAGCGCAGGCGGGCTCCCCCAATCATTTCTTTAATGATTCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.6：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACGATTGTCTAACTAAAAACTCAGACTGCAAACTTCAGACAGCGTTCAAATGTTAGTCTCCGGCGGGCCGTGGCCACGCCGAAGCAACAGGGTACAGATAGACACGGATGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.7：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGAGAACCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTTTAACGATTGTTTGACTAAAAACTCAGACTGCAAACTTCAGACAGCGTTCAAATGTTAGTCTCCGGCGGGCCGTGGCCACGCCGAAGCAACAGGGTACAGATAGACACGGATGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCGCACTCGGTAATGATCCGTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.8：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACCGATTTGGTATGTTCACTCAGACAGCAATCCTTTTCAAAGACAGCGTTCGAGAAGATGTCTCCGGCGGGCCCCAGGGGGCCGCGCCGAAGCAACAGGAGGTACAATAATCACGGGTGGGAGGTTGGGTCCCACGAAGGGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.9：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGTGACCCTGACCAAAACAGACCGTGCTCGCGTCATCCAATCCTCCGACGATGGCATTGTTCGTCGTTCGGCCAATTCCTCGACCGCCTCCACTCCTAGGAGCGGGGGCTCGTGGTAAAAGAACCCACGGCGCCGAAGGCGTCAAGGAACACTGTGCCTAACCCGGGGAGATGGCTAGCTTGCTGGTCGTCACCTGTGTTGCAAATATATTTAATCCACACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGATCGATGAAGAACGCAGC
SEQ ID NO.10：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTGTGGATTAAGATAGCATCGCTGCACGAGGTGTGCTCGGCAAGCCGAGCACAGCCCCGAGCAAGGCAATATCAGTTTTCCTTGACGCCTTCGGCGCCGTGGGTTCTTTTGCGGCCCCTCTCCTTCGGAAAGGTCGGGGGCCTTGCACGGGTAGAACCACGTGCGGGATGGATGACATGTTCACGGTCTGTTTTGTTTAAGGGTCACGACAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.11：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGTTATTTGTTTTTAGACCTGCGCTTAACTGCGCGGTTTAATAAACTCTTATACACAGTGTTTTTGTTTGCGAATTTGGTTTAGTTTGTTGGTTTTCATTCGAAAGGATGAAGATTGATTGCTAAATCTTATTCAGCTTTTTAAACTCAGATCTCTTTTTAAGAGAAATGTATTTTTTTAATTACAACTAGTCGATTTTACAAACTAAAAGTTTAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTCGATCGATGAAGAACGCAGC
SEQ ID NO.12：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAAGAAATGATTGGGGGAGCCCGCCTGCGCTTAGCTGCGCGGTGGCGCTCCGCCTCTTACACACAGTGGAGTAATTACTTATTCTTGGGCTGGGCGAAAGTCCAGCTCGCCAAACACAAACAATTATTTTCTATTATACAGTGTCATCAAATCTGCTTACGCAGTAACCAAAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGATCGATGAAGAACGCAGC
SEQ ID NO.13：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAATATTTTGGTTACTGCGTAAGCAGATTTGATGGCACTGTATAATAGAAAATAATTGTTTGTGTTTGGCGAGCTGGACTTTCGCCCAGCCCAAGAATAAGTAATTACTCCACTGTGTGTAAGAGGCGGAGCGCCACCGCGCAGCTAAGCGCAGGCGGGCTCCCCCAATCATTTCTTTAATGATTCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.14：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACCGATTTGGTATGTTTACTCAGACAGCAATCCTTTTCAAAGACAGCGTTCGAGAAGATGTCTCCGGCGGGCCCCAGGGGGCCGCGCCGAAGCAACAGGAGGTACAATAATCACGGGTGGGAGGTTGGGTCCCACGAAGGGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.15：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGAGAACCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.16：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAAATAAACCTGATGGGTTGTCGCTGGTTCCCTCTAAGGAGCATGTGCACGCCTTGTCATCTTTATATCTCCACCTGTGCACTTTTTGTAGACCTCTCTCAGGTCTATGTTGCTTCATTTACCCCCCAATGTATGTCAATAGAATGTTGTGCCTTATAATAACATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCCGATCGATGAAGAACGCAGC
SEQ ID NO.17：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTCACGATTTCTCACGCGACTCAGACGGCACGCCTTCAAAAGCTCAGCGTTCGAAGGGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGGACACGCCCCCCGGCGGCCTTGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACGGTACACACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGGAGGACCCGCACTCGGTAATAATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.18：
GCTGCGTTCTTCATCGATCGGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTAATATTTTAAAATTTCCAGTTACGAAAATTCTTGTTTTTGACAAAAATTTAATGAATAAATAAAATTGTTTGTGTTTGTTACCTCTGGGCCCCGATTGCTCGAATGCCCAAAGAAAAAGTTGCAAAGATATGAAAACTCCACAGTGTGTTGTATTGAAACGGTTTTAATTGTCCTATAACAAAAGCACAGAAATCTCTCACCGTTTGGAATAGCAAGAAAGAAACTTACAAGCCTAGCAAGACCGCGCACTTAAGCGCAGGCCCGGCTGGACTCTCCATCTCTTGTCTTCTTGCCCAGTAAAAGCTCTCATGCTCTTGCCAAAACAAAAAAAATCCATTTTCAAAATTATTAAATTTCTTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
SEQ ID NO.19：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTTAAGAAAATTACTGAATATATGAGCTACTTGTGTGGCTGCAGACAGAGAACAAGCCTGTGCGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCTGCGGGTGGCCTTCTTGCTATTGGCTGCAGTTTGCACGGTGGTTTTGATTTCATTTCACACTGTGAAGATTTTTTTCATACTTTACTTCTTTGGGCTGCAAGGCCCAAAGGTTATAAACACAAACAACTTTTTTTTTTTATTACAGACAATCAAGAAATTTTCTATTGAAATAAAATATTTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCCGATCGATGAAGAACGCAGC
SEQ ID NO.20：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGAGAAATCTATATGAATGAAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGCTTAATTGCGCGGTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGTCTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTTCTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTATAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCCGATCGATGAAGAACGCAGC
上述用于检测清香型白酒真菌物种的DNA Maker的制备方法包括如下步骤：
一、提取酒醅中的基因组DNA，进行PCR扩增。
1、酒醅中的基因组DNA提取步骤如下：
(1)将3g样品(酒醅)放入含有10mLSTE缓冲液的离心管中，在摇床中200r/min震荡20min；
(2)将离心管放入离心机中2000r/min离心，取上清；
(3)重复上述步骤(1)和(2)2次；
(4)收集菌体：收集(3)步骤中的上清，12000r/min，取沉淀，即菌体；
(5)STE洗涤菌体两次，12000r/min再次离心，收集菌体；
(6)洗涤之后，在收集的菌体中加入STE 600μL，溶菌酶60μL，裂解菌体，震荡20min；
(7)加入蛋白酶k 10μL与SDS 70μL，继续对菌体裂解，震荡20分钟；
(8)室温冷却后加入Nacl 140μL，12000r/min，离心5min，取上清；
(9)加入与上清等体积的Tris-饱和酚，颠倒混匀10min，12000r/min离心2min；
(10)取上清液，加入上清液等体积的氯仿，颠倒混匀10min，12000r/min离心2min，取上清重复该步骤一次；
(11)在最后取得的上清加入其0.6倍体积的异丙醇，沉淀DNA 1h，12000r/min离心5min，用枪头吸出异丙醇；
(12)75％乙醇洗涤沉淀DNA，洗3次，每次加完乙醇后，吹洗并静置5min。充分混匀，最后烘干；
(13)烘干后加入50μL ddH2O溶液，2μL RNAseA水浴55℃，20min之后将样品放入4℃冰箱过夜，待用。
将提取到的酒醅中的基因组DNA于0.7％琼脂糖凝胶验证图谱如图1所示。
2、验证后的基因组DNA进行PCR扩增，具体步骤如下：
(1)第一次PCR扩增：
以提取到的酒醅中的基因组DNA为模板，以ITS1F(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和ITS1R(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为引物，进行第一次PCR扩增，得到的PCR产物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，-20℃保存备用。PCR反应在PTC-200,Bio-Rad，USA PCR仪上运行。
PCR反应体系：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L)：1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH20：37μL。
(2)第二次PCR扩增：
以第一次PCR扩增的产物为模板，以ITS1F-GC(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和ITS1R(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为引物，进行第二次PCR扩增，PCR扩增产物1.5％琼脂糖凝胶验证图谱如图2所示。得到的PCR扩增产物于-20℃条件下保存备用，PCR反应在PTC-200,Bio-Rad，USA PCR仪上运行。
PCR反应体系：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L)：1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH20：37μL。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30S，59℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min，12℃保存。
3、将第二次PCR扩增产物进行DGGE分析，从DGGE胶上切下的DNA片段为真菌ITS1区DNA片段。具体如下：
(1)选择浓度为8％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为30％～60％，取30％、60％胶各16mL，分别加入50μL的TEMED及40μL的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，凝胶时间3h；加样前，将电泳液温度上升至60℃时，后220V预电泳5min，PCR扩增产物上样量为3μL，后于60℃、85V条件下电11h；电泳完毕后，将胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照观察，进行分析，见图3。
(2)将特异性目的条带切下，分别放入无菌的EP管中，编号；
用去离子水洗涤胶条，并将胶条弄碎成小段，加入30μL去离子水浸泡，4℃过夜；
分别以获得的不同的特异性目的条带为模板，以ITS1F(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)和ITS1R(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为引物，再次进行PCR扩增，即第三次PCR扩增。得到的PCR产物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，-20℃保存备用；
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L)：1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH20：37μL。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30S，59℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min，12℃保存。
4、TA克隆转化，上述纯化回收的PCR产物的TA连接方法按擎科生物公司的pClone007 Versatile Simple Vector Kit进行；具体包括如下步骤：
(1)克隆反应体系：PCR产物：2μL；5×pClone007 Versatile Simple Vector Mix：2μL。轻轻混合，25℃反应10min，反应结束后，将PCR管置于冰上，将连接产物加入刚解冻的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激45s，立即置于冰上2min，加入500μL的LB培养基，200rpm、37℃培养1h。之后，4000rpm离心菌液1min，弃掉部分上清，悬浮菌体，涂布在准备好的Amp+抗性的LB固体平板上，37℃恒温培养12h左右；
使用的LB培养基配方(1L):胰蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母提取物5g，琼脂粉15g。使用的感受态细胞为DH5α；
(2)使用菌落PCR的方法鉴定阳性克隆；具体包括如下步骤：
a.挑取白色单克隆菌落于Amp+抗性的LB固体平板上备份菌种后，放入盛有10μL去离子水的EP管中，沸水浴煮样液5min；
b.取2μL沸水浴煮过的样液作模板进行PCR扩增；
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L)：1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH20：37μL；
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30S，55℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min，12℃保存。
引物为M13F和M13R，M13F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，M13R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
SEQ ID NO.21：TGTAAAACGACGGCCAGT；
SEQ ID NO.22：CAGGAAACAGCTATGACC。
上述PCR扩增获得的PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶验证大小，片段大小在400-500bp之间的克隆子视为阳性克隆，PCR产物1.5％琼脂糖凝胶验证图谱如图4所示。
挑取确定的阳性克隆接种于5mL的LB液体培养基(接种前加入5μL50mg/mL的Amp)中，37℃，200rmp培养14h，用生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，溶于50μL的去离子水中，-20℃保存备用。其中，提取质粒PCR的1.5％琼脂糖凝胶验证图谱如图4所示；
使用的LB液体培养基配方(1L):胰蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母提取物5g。
5、再次进行DGGE分析，验证条带在DGGE胶片上的位置，条带在DGGE图谱上与模板条带电泳行为一致的，其相应质粒送出测序，测序结果提交至NCBI，在线比对确定序列的菌属地位。具体包括如下步骤：
(1)酶标仪测提取质粒的浓度，用去离子水稀释质粒浓度至5ng/μL左右，以稀释质粒为模板，以ITS1F-GC(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和ITS1R(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)为引物进行PCR扩增，PCR反应体系和程序如下所示；
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L)：1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH20：37μL；
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30S，59℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min，12℃保存。
(2)第四次PCR扩增产物用于DGGE上样分析，DGGE图谱上条带电泳行为与模板条带电泳行为一致者则视为目的阳性克隆子。验证的DGGE图谱如图5所示。将阳性克隆子的质粒送至上海华大基因科技有限公司测序。
(3)测序结果提交至NCBI，在线比对确定序列的菌属地位。
SEQ ID NO：1
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
SEQ ID NO：2
GCTGCGTTCTTCATCGATCG
SEQ ID NO：3
CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTCCGTAGGTGAACCTGCGG
6、制作清香型白酒酿造过程微生物PCR-DGGE检测中真菌物种的DNA Marker。
(1)将所有在DGGE图谱上与模板条带电泳行为一致的质粒(目的阳性克隆子)混合获得混合质粒，以混合质粒为模板，序列为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3的片段为引物进行第四次PCR扩增，各质粒模板量控制在8-12ng/μL范围内，扩增体系、条件、所用引物如下：
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L)：1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH20：37μL；
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30S，59℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min，12℃保存。
(2)PCR扩增产物与6×DNA Loading buffer以体积比5：1混合均匀，即获得DNAMarker，制备好的DNA Marker用于DGGE上样分析，DGGE图谱如图6所示，共获得三条DNAMarker。
7、结合每条DNA Marker条带所代表的菌属地位，对制备的PCR-DGGE检测中DNAMarker进行命名，本发明制备的DNA Marker命名为ZM1、ZM2、ZM3。
ZM1、ZM2和ZM3分别对应的条带信息如下所示：
DNA Marker ZM1的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.18；
SEQ ID NO.4对应的真菌为Rhizopus oryzae；SEQ ID NO.5对应的真菌为Candidahumilis；SEQ ID NO.6对应的真菌为Aspergillus chevalieri；SEQ ID NO.7对应的真菌为Uncultured Aspergillus；SEQ ID NO.8对应的真菌为Monascus purpureus；SEQ ID NO.9对应的真菌为Preussia terricola；SEQ ID NO.10对应的真菌为Preussia terricola；SEQID NO.18对应的真菌为Saccharomyces cerevisiae。
DNA Marker ZM2的核苷酸序列包括SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.15；
SEQ ID NO.11对应的真菌为Saccharomycopsis fibuligera；SEQ ID NO.12对应的真菌为Kazachstania humilis；SEQ ID NO.13对应的真菌为Pichia Kudriavzevii；SEQID NO.14对应的真菌为Monascus purpureus；SEQ ID NO.15对应的真菌为Aspergillusflavus。
DNA Marker ZM3的核苷酸序列包括SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.19-SEQ ID NO.20；
SEQ ID NO.16对应的真菌为Cortinarius rubricosus；SEQ ID NO.17对应的真菌为Thermoascus aurantiacus；SEQ ID NO.19对应的真菌为Hanseniaspora osmophila；SEQID NO.20对应的真菌为Torulaspora delbrueckii。
实施例2
一种利用实施例1制备得到的DNA Maker检测清香型白酒酿造过程微生物真菌的方法，包括以下步骤：
1、提取汾酒大曲基因组DNA，进行PCR扩增，基因组提取及PCR扩增步骤参照实施例1。所述汾酒大曲为待测样品。
2、DGGE分析：
(1)选择聚丙烯酰胺凝胶胶浓度为8％，胶变性范围为30％～60％，取30％、60％胶各18mL，分别加入50μL的TEMED及40μL的8％过硫酸铵，梯度混合制胶，夏天室温凝固，冬天可放在37℃培养箱里凝固，若室温凝固，凝胶时间3h；
(2)待胶凝固完全之后，拔掉梳子，将整个板子安装在DGGE支架上，将安装有板子的DGGE支架放入电泳槽中，清洗胶孔，接通电源，待电泳液温度上升至60℃时，200V预电泳5min，用50微升微量进样器快速上样，上样样品为汾酒大曲的真菌ITS1区PCR扩增产物及具体实施方案1中制备的真菌DNA Marker。汾酒大曲的真菌ITS1区PCR扩增产物及真菌DNAMarker上样量均为50μL。于60℃、85V条件下电泳11h；
(3)电泳完毕后，将胶放入3×GelRed染液中染色30min左右，拍照，DGGE图谱如图7所示；
(4)结果分析：如图7中所示，本发明制备的DNA Marker部分组成条带与样品所含的部分条带一一对应，初步认为样品中与Marker对应的条带为Marker组成条带相对应的菌属，即汾酒大曲中真菌的菌群结构包含本发明制备Marker所对应的部分菌属。
3、样品条带序列分析：
(1)将汾酒大曲样品中与制备的真菌DNA Marker位于同一位置的条带切下，放入无菌的EP管中，编号；
(2)用去离子水洗涤胶条，并将胶条弄碎成小段，加入30μL去离子水浸泡，4℃过夜；
(3)再次进行PCR扩增，PCR扩增反应体系、条件及引物参照实施例1的相关步骤。得到的PCR产物用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，回收的DNA片段送至上海华大基因科技有限公司进行测序；
3、测序结果提交至NCBI，在线比对确定序列的菌属地位，经比对分析，样品中与Marker位于同一位置的条带所属菌属地位与对应的Marker相同，且菌属相似性均大于97％。证明了汾酒大曲中真菌的菌群结构确实包含了本发明制备Marker所对应的部分菌属。即汾酒大曲中富含Sacchayomycopsis fibμLigera、Kazachstania hunilis、Aspergillus flavus等真菌。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种清香型白酒真菌快速检测DNA Marker，其特征在于，所述DNA Marker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的清香型白酒真菌快速检测DNA Marker，其特征在于，所述DNAMarker中SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.20所示的片段依次指示的菌为Rhizopus oryzae、Candida humilis、Aspergillus chevalieri、Uncultured Aspergillus、Monascuspurpureus、Preussia terricola、Preussia terricola、Saccharomycopsis fibuligera、Kazachstania humilis、Pichia Kudriavzevii、Monascus purpureus、Aspergillusflavus、Cortinarius rubricosus、Thermoascus aurantiacus、Saccharomycescerevisiae、Hanseniaspora osmophila和Torulaspora delbrueckii。
3.一种包含权利要求1所述的DNA Marker的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的包含DNA Marker的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括引物组、PCR缓冲液和STE缓冲液。
5.根据权利要求4所述的包含DNA Marker的试剂盒，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的片段。
6.一种权利要求1所述的清香型白酒真菌快速检测DNA Marker的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取清香型白酒酿造微生物总基因组DNA，以提取的微生物基因组DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ITS1F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ITS1R为引物，第一次PCR扩增真菌ITS1区序列，将第一次PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并回收真菌ITS1区序列片段；
分别以回收的真菌ITS1区序列片段为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的ITS1F-GC和ITS1R为引物进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物进行DGGE分析，从DGGE胶上切下的DNA片段为真菌ITS1区DNA片段；
分别以DGGE胶上切下的真菌ITS1区DNA片段为模板，以ITS1F和ITS1R为引物进行第三次PCR扩增，回收第三次PCR扩增产物；
分别将第三次PCR扩增产物克隆到T载体上获得连接产物，连接产物转入感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，DGGE分析，验证条带在DGGE胶片上的位置，筛选条带在DGGE图谱上与模板条带电泳行为一致的质粒；
将所有在DGGE图谱上与模板条带电泳行为一致的质粒混合获得混合质粒，以混合质粒为模板，以序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示的片段为引物，进行第四次PCR扩增，第四次PCR扩增产物与6×DNA Loading buffer以体积比5：1混合均匀，即获得DNA Marker。
7.一种利用权利要求1所述的DNA Marker检测清香型白酒中真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样品微生物基因组总DNA；
以待测样品微生物基因组总DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
琼脂糖凝胶电泳结束后，将含有DNA条带的凝胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品某一条带与DNAMarker中条带在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品中含有DNA Marker中条带所指示的真菌；当待测样品没有条带或条带与DNAMarker中条带在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有对应的真菌。
8.根据权利要求7所述的DNA Marker检测清香型白酒中真菌的方法，其特征在于，以超纯水为模板获得的扩增产物作为阴性对照，以DNAMarker为模板获得的扩增产物作为待测样品对比的标准。
9.一种权利要求1-2任一项所述的DNAMarker、或权利要求3-5任一项所述的试剂盒在清香型白酒真菌检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述DNA Marker由ZM1、ZM2和ZM3组成，使用时同时加入单独泳道作为标准Marker。
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