CN114480712A

CN114480712A - 一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中l/m核酸片段的方法

Info

Publication number: CN114480712A
Application number: CN202210161576.0A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 罗寒; 吕锡斌; 傅文博; 杜海; 陈良强; 王莉; 徐岩
Original assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Current assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Priority date: 2022-02-22
Filing date: 2022-02-22
Publication date: 2022-05-13

Abstract

本发明公开了一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸片段的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种鉴定酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA的SYBR Green I荧光定量方法，此方法为先将一定浓度梯度的重组质粒进行SYBR Green I荧光定量，建立质粒浓度与CT值的标准曲线，再提取样本微生物RNA逆转录为cDNA进行SYBR Green I荧光定量，以标准曲线公式为依据，直接计算得到酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA片段的浓度，以达到快速绝对定量的目的。本发明旨在快速、准确检测发酵微生物中酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA的含量，进而为揭示其在白酒发酵过程中的影响、作用和演替规律，同时为提高白酒的品质奠定基础，具有较高的实际应用价值。

Description

一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸片段的方法

技术领域

本发明公开了一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸片段的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母具有生长周期短、发酵能力强等优点，一直是基础研究与应用研究的主要对象，并且在食品、医药等领域具有广泛的应用。

研究发现，含有L/M核酸片段的酿酒酵母产生的某类因子或外毒素能够抑制或杀死某些特定的微生物，但对自身具有免疫功能。这类酵母分泌的因子通常作用于同种、亲缘关系比较近的酵母菌或者野生酵母菌的细胞受体，最近几年发现上述因子也可以抑制或杀死丝状真菌或细菌。

一般情况下，在酿酒酵母细胞中，有两种核外双链RNA所编码的蛋白质和这种现象有关：一种是分子量约为2.5×10⁶道尔顿的大分子双链RNA(Large dsRNA，简称L dsRNA，长度约为4.5kb)，占90％以上；另一种是分子量约为1～1.4×10⁶道尔顿的中等分子双链RNA(Medium dsRNA，简称M dsRNA，长度约为1.8kb)，占6％左右。两者的总和约占酿酒酵母细胞全部核酸的0.1％，且不同的酿酒酵母菌株中含有不同的M dsRNA，编码合成和分泌不同的因子，表现出不同的表型。

具有类似现象的酵母菌株，可从各种自然栖息地(如水，土壤，水果和葡萄园)和不同的地理区域分离得到，该类酵母成为占据着微生物群落生态位的优势种类时，可能会造成体系的发酵迟缓甚至停滞，导致发酵速度和产物质量下降。目前，该类型酵母在世界范围内葡萄酒、清酒等酿造过程中均被发现并证明对酒类发酵存在影响。同时，研究发现酿酒酵母中L/M核酸片段的存在可能会干扰白酒酿造过程中微生物的组成和演替速度，进而影响白酒的品质。因此，亟需一种快速、准确的定量检测方法，帮助我们进一步揭示其在白酒酿造过程中的影响、作用与演替规律，进而减少其对发酵过程的干扰，为提高和改善白酒的品质、风味奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确度高的大分子双链RNA(酿酒酵母LdsRNA和酿酒酵母M dsRNA)绝对定量的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一组检测大分子双链RNA(酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA)的引物组合和方法。

本发明的第一个目的是提供检测酿酒酵母中L/M核酸片段的引物组合，所述引物组合包含检测L dsRNA的引物对A和/或M dsRNA的引物对B。

在一种实施方式中，所述引物对A的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述引物对B的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供一种检测试剂盒，含有上述引物组合。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有标准样品，所述标准样品为过表达LdsRNA和/或M dsRNA基因片段的阳性质粒。

在一种实施方式中，所述阳性质粒以pUC57-Kan为载体。

在一种实施方式中，所述L dsRNA的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，MdsRNA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒的反应体系如下：Mixture 10μL，上游引物、下游引物各0.4μL，DNA2μL，ddH₂O补足至20μL。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒的扩增程序为：94℃2min，94℃30s，55℃45s，72℃30s，35个循环，72℃30s。

本发明的第三个目的是提供一种检测酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA的方法，所述方法为使用了上述引物组合或上述试剂盒。

在一种实施方式中，所述方法为提取微生物RNA，反转录得到cDNA，qPCR检测得到的数值代入标准曲线获得拷贝数。

在一种实施方式中，当测定L dsRNA时，标准曲线公式为y＝-3.8305x+41.259，当测定M dsRNA时，标准曲线公式为y＝-3.3286x+38.982。

本发明还保护上述引物组合或上述检测试剂盒或上述方法在酿造领域方面的应用。

本发明还保护上述引物组合或上述检测试剂盒或上述方法在监测酿造过程中酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA动态变化中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了可用于对样本中酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA进行绝对定量的重组质粒，将此两组重组质粒浓度在1×10¹～1×10⁸copies/μL的浓度进行SYBRGreen I荧光定量时，标准曲线R²>0.99，从而能对酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA片段的绝对含量进行较为准确地评估。

(2)本发明提供了可用于对样本中酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA进行绝对定量的方法，此方法先将酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA特异性片段嵌入重组质粒中，且此特异性片段双端带有酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA特异性引物，在无LdsRNA和M dsRNA的酿酒酵母cDNA中无特异性扩增，且在样本cDNA中出现特异性扩增单峰，PCR产物双端测序为相应酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA序列，表明此方法对酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA有较强的特异性。

(3)本发明提供的两对引物的定量限为均为1×10¹copies/μL，可以分别检测到反应体系中2个拷贝的酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA。

附图说明

图1：(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母M dsRNA重组质粒内标DNA片段的结构。

图2：(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母M dsRNA重组质粒的质粒图谱。

图3：(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母M dsRNA重组质粒的内标DNA片段双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

图4：(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母M dsRNA重组质粒初始浓度的Lg值为横坐标、qPCR测得的CT值为纵坐标绘制得到的标准曲线。

图5：酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA特异性引物对不携带L dsRNA和MdsRNA的酿酒酵母1296的cDNA进行荧光定量PCR；(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母MdsRNA。

图6：酱香酒醅cDNA为模板进行荧光定量PCR的熔解曲线；(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母M dsRNA。

图7：酱香酒醅cDNA为模板进行荧光定量PCR的CT值；(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母M dsRNA。

图8：酱香酒醅cDNA为模板进行荧光定量PCR的熔解曲线；(A)酿酒酵母L dsRNA和(B)酿酒酵母M dsRNA。

具体实施方式

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

下述实施例中涉及的培养基如下：

培养基均使用ddH₂O配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。

LB液体培养基(Kan⁺)：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、卡那霉素100μg/L。

LB固体培养基(Kan⁺)：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉15g/L、卡那霉素100μg/L。

YPD液体培养基：酵母粉10.0g/L、胰蛋白胨20.0g/L、葡萄糖20.0g/L。

YPD固体培养基：酵母粉10.0g/L、胰蛋白胨20.0g/L、葡萄糖20.0g/L、琼脂粉15g/L。

下述实施例中涉及的酵母菌如下：

酿酒酵母k1(S.cerevisiae k1)：中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC 32366。

酿酒酵母1296(S.cerevisiae 1296)：中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC32365。

实施例1：构建标准样品

基于NCBI NT核酸非冗余数据库中酿酒酵母L dsRNA(NC_003745.1)和酿酒酵母MdsRNA(NC_001782.1)的全基因序列，设计酿酒酵母L dsRNA特异性内标DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，图1(A))和M dsRNA特异性内标DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，图1(B))。

通过金唯智公司合成上述L dsRNA和M dsRNA特异性内标DNA片段并在两端添加BamHⅠ(3’端)、SalⅠ(5’端)酶切位点后分别连接经BamHⅠ和SalⅠ酶切后的载体pUC57-Kan，分别得到酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA片段重组质粒pUC57-L和pUC57-M(质粒图谱见图2)，酿酒酵母L dsRNA重组质粒pUC57-L插入DNA片段总长度为208bp，酿酒酵母M dsRNA重组质粒pUC57-M插入DNA片段总长度为180bp。

通过金唯智公司将重组质粒pUC57-L和pUC57-M分别转化大肠杆菌E.coli，并涂布于LB固体培养基(Kan+)，于37℃培养12h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基(Kan+)，于37℃培养12h，4℃、8000rpm离心5min后，收集菌体；从菌体中提取质粒，获得重组质粒pUC57-L和pUC57-M。

分别以重组质粒pUC57-L和pUC57-M为模板，使用BamHⅠ、SalⅠ进行双酶切(酶切体系见表1)，双酶切之后，取5μL双酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果见图3，大小分别在208bp和180bp左右，确定此两组质粒为可用于检测酿酒酵母L dsRNA和M dsRNA绝对含量的标准样品。

表1双酶切体系

实施例2设计用于绝对定量的检测引物

基于实施例1设计的酿酒酵母L dsRNA特异性DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和M dsRNA特异性DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，通过Primer 6.0软件设计并通过金唯智公司合成检测L dsRNA特异性DNA片段的特异性荧光定量PCR引物LAF：5'-GCAGTAAGAATAATGGACGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)、LAR：5'-CTGACAGTGGTTCGTTAGACTC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和检测M dsRNA特异性DNA片段的特异性荧光定量PCR引物M1F：5'-TGTTTAGTGAGGATGAGGGAC-3'(核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)、M1R：5'-ATCAGAGGTCAGACACGATG-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；通过DNAMAN软件检查引物无二级结构和互补情况；通过NCBI blast比对验证酿酒酵母L dsRNA和M dsRNA的qPCR引物和相应DNA片段之间具有特异性。

实施例3：可用于检测样本中酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA绝对含量的重组质粒建立标准曲线

将实施例1获得的重组质粒pUC57-L和pUC57-M分别稀释到浓度为1×10¹～1×10⁸copies/μL后，分别以浓度为1×10¹～1×10⁸copies/μL的重组质粒pUC57-L和pUC57-M为模板，然后分别以实施例2设计的引物对LAF/LAR和M1F/M1R进行SYBR Green I荧光定量PCR(荧光定量PCR体系见表2)；以重组质粒初始浓度的Lg值(对数函数)为横坐标，qPCR测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线(标准曲线见图4)，当测定酿酒酵母L dsRNA时，标准曲线公式为y＝-3.8305x+41.259，当测定酿酒酵母M dsRNA时标准曲线公式为y＝-3.3286x+38.982。

由图4可知，酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA重组质粒浓度为1×10¹～1×10⁸copies/μL时，标准曲线R²>0.99，准确性较高，可以使用。且两对引物的定量限为均为1×10¹copies/μL。

表2 qPCR体系

实施例4：引物的特异性验证

将携带L dsRNA和M dsRNA的酿酒酵母k1和不携带L dsRNA和M dsRNA的敏感型酿酒酵母1296分别划线于YPD固体培养基，于30℃培养12h，获得单菌落；挑取单菌落接入YPD液体培养基，于30℃培养12h，8000rpm离心5min后，收集菌体；使用RNAiso Plus(Takara)试剂分别提取酵母RNA，然后使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)逆转录为cDNA。

以酿酒酵母1296的cDNA为模板，分别以实施例2设计的引物对LAF/LAR和M1F/M1R进行SYBR Green I荧光定量PCR(荧光定量PCR体系见表2)。

由图5可知，实施例2设计的2组特异性引物对酿酒酵母1296的cDNA进行荧光定量PCR时，CT值均大于35，表明引物特异性良好，无特异性扩增。

以携带酿酒酵母L dsRNA和M dsRNA的酿酒酵母k1的cDNA为模板分别以实施例2设计的引物对LAF/LAR和M1F/M1R进行PCR反应(反应体系见表3)。对PCR反应产物进行Sanger双端测序，得到序列为LA1(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、LA2(核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示)和M11(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、M12(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)；通过NCBI blast比对，LA1、LA2序列具有酿酒酵母L dsRNA特异性，M11、M12序列具有酿酒酵母M dsRNA特异性，表明引物特异性良好。

表3 PCR验证体系

PCR反应参数：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环之后，72℃延伸30s。

实施例5：SYBR Green I荧光定量方法的验证

称取50g新鲜酱香白酒酒醅(取自某酱香酒厂)在100g PBS缓冲溶液中用玻璃棒混匀，于4℃、200rpm振荡15min，六层无菌纱布过滤，得到菌液；于4℃、12000rpm离心10min，收集菌体沉淀；使用PBS缓冲溶液洗涤三次，得到菌体；提取微生物RNA，并逆转录为cDNA。

以所得酱香酒醅cDNA为模板，分别以实施例2设计的引物对LAF/LAR和M1F/M1R进行SYBR Green I荧光定量PCR(荧光定量PCR体系见表2)。

由图6可知，以酱香酒醅cDNA为模板得到的熔解曲线一致，只有特异性扩增单峰，无非特异性扩增峰，说明该扩增基因在复杂样本中同样具有较高的特异性。

由图7可知，L dsRNA的CT值为21.74，M dsRNA的CT值为23.32；分别代入标准曲线公式y＝-3.8305x+41.259和y＝-3.3286x+38.982中，得到L dsRNA浓度为1×10^5.1copies/μL，M dsRNA浓度为1×10^4.7copies/μL。证明了检测酿酒酵母L dsRNA和酿酒酵母M dsRNA的SYBR Green I荧光定量方法在酒醅样本中可以使用。

对比例

基于实施例1设计的酿酒酵母L dsRNA特异性DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和M dsRNA特异性DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，通过Primer 6.0软件设计并通过金唯智公司合成检测L dsRNA特异性DNA片段的特异性荧光定量PCR引物L2F：5'-TCGTGCTTATGATGATGAGT-3'、L2R：5'-GTTCTATCGCCTTCTATCCAC-3'(和检测M dsRNA特异性DNA片段的特异性荧光定量PCR引物M2F：5'-GTTAAGACCAGTATCGGATATG-3'、M2R：5'-CATTGGCTCAACTACTCATC-3'。采用实施例5相同的方法检测引物特异性，以所得酱香酒醅cDNA为模板，分别以引物对L2F/L2R和M2F/M2R进行SYBR Green I荧光定量PCR。结果如图8所示，以酱香酒醅cDNA为模板得到的熔解曲线不一致，出现了非特异性扩增峰，说明该扩增基因在复杂样本中不具有特异性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州茅台酒股份有限公司

<120> 一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸片段的方法

<130> BAA211090A

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gcagtaagaa taatggacgc 20

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<212> DNA

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ctgacagtgg ttcgttagac tc 22

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tgtttagtga ggatgaggga c 21

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<212> DNA

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atcagaggtc agacacgatg 20

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gcagtaagaa taatggacgc tatgcaccgg ataaatgcgc gagcacagcc ggcgaagtgt 60

aacttgtttt cgataagtga atttctgagg gtagaacacg gtatgagcgg aggcgatggt 120

cttggggctc agtacttaag taggtcttgt gctactcttg tacacagtag gattgagtct 180

aacgaaccac tgtcag 196

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tgtttagtga ggatgaggga caatgggaga cgaattacta taaattgtat tggagtactg 60

gccagtggat aatgtcgatg aagtttattg aggaaagtat tgataacgcc aataatgact 120

ttgaaggctg tgacacaggc cactagggca tcgtgtctga cctctgat 168

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ctacttaagt actgagcccc aagaccatcg cccccgctca taccgtgttc taccctcaga 60

aattcactta tcgaaaacaa gttacacttc gccggctgtg ctcgcgcatt tatccggtgc 120

atagcgtcca ttattctcac t 141

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ccggcgagtg taacttgttt tcgataagtg aatttctgag ggtagaacac ggtatgagcg 60

ggggcgatgg tcttggggct cagtacttaa gtaggtcttg tgctactctt gtacacagta 120

ggattgagtc taacgaacca ctgtcaga 148

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tcaagtcatt attggcgtta tcaatacttt cttcaataaa cttcatcgac attatccact 60

ggccagtact ccaatacaat ttatagtaat tcgtctccca ttgtccctca tcctcactaa 120

acaa 124

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tgtattggag tactggccag tggataatgt cgatgaagtt tattgaagaa agtattgata 60

acgccaataa tgactttgaa ggctgcgaca caggccacta gggcatcgtg tctgacctct 120

Claims

1.检测酿酒酵母中L/M核酸片段的引物组合，其特征在于，包含检测L dsRNA的引物对A和/或M dsRNA的引物对B；

引物对A的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对B的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有标准样品，所述标准样品为过表达L dsRNA和/或M dsRNA基因片段的阳性质粒。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，L dsRNA的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，M dsRNA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的反应体系如下：Mixture 10μL，上游引物、下游引物各0.4μL，DNA2μL，ddH₂O补足至20μL。

6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的扩增程序为：94℃2min，94℃30s，55℃45s，72℃30s，35个循环，72℃30s。

7.一种检测检测酿酒酵母中L/M核酸片段的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述的引物组合或权利要求2～6任一所述的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为提取微生物RNA，反转录得到cDNA，qPCR检测得到的数值代入标准曲线获得L dsRNA或M dsRNA的拷贝数。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当测定L dsRNA时，标准曲线公式为y＝-3.8305x+41.259，当测定M dsRNA时，标准曲线公式为y＝-3.3286x+38.982。

10.权利要求1所述引物组合或权利要求2～6任一所述检测试剂盒或权利要求7～9任一所述的方法在酿造领域方面的应用。