CN100415898C - 确定底层发酵酵母的絮凝特性的方法 - Google Patents

确定底层发酵酵母的絮凝特性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可重复的方法，不需发酵即可在短时间内容易、快速地确定底层发酵酵母的絮凝特性。其特征在于使用实验室酵母(酿酒酵母)絮凝基因FLO5的ORF序列。

Description

确定底层发酵酵母的絮凝特性的方法
技术领域
本发明涉及一种确定底层发酵酵母(窖藏啤酒酵母)存在絮凝特性或检测非絮凝的遗传学改变的方法。
背景技术
窖藏啤酒在日本、德国和其它国家生产。用于该类型啤酒酿造的大多数酵母在酿造后期具有絮凝特性，在罐底具有沉淀特性，因此被称为底层发酵酵母。在啤酒酿造中，该酵母的沉淀特性对于酵母的回收及随后的过滤，以及啤酒的味道和质量等的影响都是重要的。此外，当底层发酵酵母的性质稳定时，该酵母具有在啤酒生产步骤中能反复作为回收酵母的优点。在这种情况中，确定底层发酵酵母的絮凝特性在新酵母的筛选和选择中是重要的。
作为确定酵母絮凝特性的常用方法，有许多方法，如Burns法(J.Inst.Brew.，43，31，1937)、Helm法(Wallerstein LaboratoryCommunications 16，315，1953)等。在这些方法中，在培养和发酵酵母后，收集的酵母在Ca离子存在下在酵母容易絮凝和沉淀的空气下人工絮凝。利用这些方法确定絮凝和沉淀特性。
当实际啤酒生产步骤中酵母的絮凝特性降低或消失时，需要确定收集的酵母是否能被重复使用。为了确定非絮凝是由于酵母本身的不可逆改变(即由于突变)引起的，还是并非由于酵母而是由于环境的可逆改变引起的，大约需要两周的时间来获得结果，因为这种确定絮凝特性的方法应当在特定评价条件下培养和发酵酵母后进行。
酵母的突变不会在所有细胞中同时引起。分离单菌落、研究絮凝特性并了解突变群体是重要的。然而，在确定絮凝特性的方法中，在常规培养和发酵后难以一次处理多个菌株。
最近几年，搞清了实验室酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))所有染色体中的DNA序列，证实了参与絮凝特性的几种基因的存在(Science 274，546(1996)，Nature 387，7(1997))。在这些基因中，对染色体I上的FLO1基因研究得最多，分离并分析了该基因(日本专利Hyohei-7-509372，Yeast，9，1(1993)，Yeast，10，211(1994))。也报道了对FLO5基因的分离和分析，该基因与FLO1基因位于不同的染色体上，具有高度同源的DNA序列(Science，265，2077(1994)，Curr.Genet.，25，196(1994))。也报道了FLO8基因的分离和分析(Agric.Biol.Chem.，47，2889(1983)，Mol.Gen.Genet.，251，707(1986))。
发现底层发酵酵母具有来自酿酒酵母和贝酵母(Saccharomycesbayanus)两者的染色体。然而，通过研究来自这两种酵母的基因确定底层发酵酵母的絮凝特性未获成功(Yeast，14，923(1998)，System.Appl.Microbiol.待发表(1999))。
在研究具有絮凝特性的酿酒酵母的FLO1和FLO8基因的一种方法中，确定啤酒酵母的絮凝特性未获成功。此外，最近发现了啤酒酵母的具有絮凝特性的一部分基因。据报道，根据这些基因的一部分DNA序列的存在，能确定啤酒酵母类型的絮凝特性的存在。然而未报道絮凝特性的降低和消失能根据酵母的遗传学改变确定(日本专利公开Hei 8-205900)。
发明内容
本发明目的在于容易地获得一种方法，根据极好的可重复性在短时间内确定底层发酵酵母的絮凝特性的存在。
使用根据实验室酵母(酿酒酵母)染色体VIII上的絮凝基因FLO5的ORF序列设计的引物(Science，265，2077(1994))，进行PCR探寻目的片段扩增的存在和大小。使用絮凝的底层发酵酵母的基因组作为模板，用上述引物进行PCR，产生的扩增产物作为Southern杂交的探针。通过这些步骤，发现能确定底层发酵酵母的絮凝特性的存在，并检测非絮凝特性的遗传学改变。
也就是，第一个发明是利用实验室酵母(酿酒酵母)的絮凝基因FLO5的ORF序列，确定底层发酵酵母存在絮凝特性的一种方法。
第二个发明是利用ORF序列根据具有最初絮凝特性的底层发酵酵母的遗传学改变，确定非絮凝特性和絮凝特性降低的一种方法。
第三个发明是利用该序列根据具有最初絮凝特性的底层发酵酵母的遗传学改变，预知非絮凝特性和絮凝特性降低的一种方法。
第四个发明是确定底层发酵酵母存在絮凝特性一种方法，其中使用根据该序列设计的引物，并进行PCR反应检测扩增产物的存在。
第五个发明是根据底层发酵酵母的遗传学改变，确定非絮凝特性和絮凝特性降低的一种方法，其中使用根据该序列设计的引物，并进行PCR反应检测扩增产物的存在。
第六个发明是根据底层发酵酵母的遗传学改变，预知非絮凝特性和絮凝特性降低的一种方法，其中使用根据ORF序列设计的引物，并进行PCR反应比较显示絮凝特性的酵母菌株的扩增产物的DNA大小。
第七个发明是根据底层发酵酵母的遗传学改变确定，非絮凝特性和絮凝特性降低的一种方法，其中从该酵母中分离几个单菌落，用根据该序列设计的引物进行PCR反应，获取酵母中的变体群体。
第八个发明是根据底层发酵酵母的遗传学改变，预知非絮凝特性和絮凝特性降低的一种方法，其中从该酵母中分离几个单菌落，用根据该序列设计的引物进行PCR反应，获取酵母中的变体群体。
第九个发明是确定底层发酵酵母存在絮凝特性的一种方法，其中具有絮凝特性的底层发酵酵母的所有DNA都用作模板，使用根据该序列设计的引物，进行PCR反应使用扩增产物。
第十个发明是根据底层发酵酵母的遗传学改变，确定非絮凝特性的一种方法，其中具有絮凝特性的底层发酵酵母的所有DNA都用作模板，使用根据该序列设计的引物，进行PCR反应使用扩增产物。
附图简述
图1是一张电泳图，显示几种底层发酵酵母的絮凝特性和PCR扩增产物。
图2是一张电泳图，显示絮凝株和非絮凝株的PCR扩增产物，它们来源于具有絮凝特性的底层发酵酵母。
图3是一张电泳图，显示来源于具有絮凝特性的底层发酵酵母的菌株的PCR扩增产物大小与絮凝强度之间的关系。
图4是一张照片，显示来源于具有絮凝特性的底层发酵酵母的絮凝株和非絮凝株的Southern分析结果。
实施本发明的最佳方案
本发明提供在底层发酵酵母的几个水平上和来源于絮凝窖藏酵母的变体水平上确定酵母的絮凝特性的一种方法。该方法使用实验室酵母(酿酒酵母)染色体VIII上絮凝基因FLO5的ORF区(3228bp)的DNA序列或互补序列。即，本发明是一种通过研究酵母絮凝特性发展所必需的基因的存在确定絮凝特性的方法。
本发明在下面详细描述。任何已知的方法都能在目的酵母DNA的生产中使用(例如，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室出版社，第130页(1990))。当从多个样品中制备DNA时，显著发展的自动DNA提取装置是有效的，操作更容易。
基因的存在能用迄今所知的任何方法证实。下面描述了主要方法。
①使用含有10bp或更多的连续碱基的引物对，用从目的酵母中提取的DNA作为模板，通过PCR方法扩增核酸。为了获得高度稳定的检测灵敏度，引物长度优选地约20bp。当设计组合引物时，一条引物在C端含有0-约2000bp的DNA分子，或者含有与0-约2000bp的DNA分子互补的DNA序列的DNA分子，而另一条引物在N端含有约2400-3228bp的DNA分子，或者含有与约2400-3228bp的DNA分子互补的DNA序列的DNA分子。表1显示了引物的例子。当选择C端序列作为有义序列时，能选择N端的任何序列作为反义序列。在引物的例子中，即，可以选择序列c或序列d确定酵母的序列a。为了序列b可以类似地选择序列c或序列d。序列a对应于1号序列，序列b对应于2号序列，序列c对应于3号序列，序列d对应于4号序列。上述DNA分子能用周知的方法化学合成。这种合成可依靠专业人员。
在PCR反应中可以使用任何聚合酶，优选地使用具有极佳热稳定性的聚合酶，它们能扩增获得稳定的长链。含有除引物对和待测基因组外的混合物的试剂盒，如TaKaRa Perfect Shot(Takara Shuzo生产)，可有效地用来容易地获得稳定的结果。反应条件是普通PCR条件，例如，优选地，90-95℃的热变性温度，40-65℃的退火温度，70-75℃的延伸温度，和20次以上的循环。
产生的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和其它常用方法分离，并经溴化乙锭检测。
②使用由具有絮凝特性的酵母制备的DNA作为模板，用上述引物经PCR方法扩增核酸。产生的扩增产物用已知方法简单纯化，用放射性同位素、荧光染料等标记。用该产物作为探针，经电泳分离待测酵母基因组，并与印迹于膜上的样品杂交。根据适合采用的标记方法检测杂交条件。
实施例
通过下列实施例更具体地描述本发明。然而，本发明不被这些实施例所限制。
实施例1：底层发酵酵母的絮凝特性的确定
①酵母DNA的提取
底层发酵酵母30种菌株分别在10ml YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中培养直到稳定期，离心收集酵母。用蒸馏水洗涤后，收集酵母。将酵母悬浮于0.2ml的2％ Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM Na2EDTA溶液中。进而，向悬液中加入0.2ml酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)和用酸溶液洗涤的0.3g玻璃珠，充分搅拌该混合液3分钟。在加入0.2ml TE(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA)后，离心混合液5分钟。分离水相后，向残余物中加入1ml 100％乙醇，在-20℃下放置10分钟或更长，离心回收沉淀。将得到的沉淀在0.4ml上述TE中溶解，加入3μl10mg/ml RNAse A溶液，在37℃下加温混合液5分钟。在加入10μl 4M乙酸铵和1ml 100％乙醇后，将混合液在-20℃下放置10分钟或更长，离心回收沉淀。得到的沉淀在50μl蒸馏水中溶解，检测一部分溶液。
②使用具有絮凝特性的基因的一部分FLO5序列，通过PCR方法对絮凝特性的确定
用酿酒酵母染色体VIII上具有絮凝特性的FLO5基因的ORF序列设计引物对。表1显示这些引物对的例子。PCR反应在下列条件下进行：94℃ 2分钟热起动；94℃ 1分钟，57.5℃ 2分钟，72℃ 2分钟，重复30个循环；72℃ 20分钟结束。取出其中一部分进行1％琼脂糖凝胶电泳。另一方面，相同菌株在YPD培养基中培养，在麦芽汁中发酵，用上述Burns法确定絮凝特性。该方法是，在适于絮凝和沉淀酵母的条件下，在加速絮凝的Ca离子存在下，人工研究酵母的絮凝特性，并确定絮凝和沉淀特性。根据沉淀量确定絮凝特性。图1显示了使用引物对a和c经PCR方法扩增的一部分结果。这表明，约5000bp扩增DNA的存在与用Burns法测定的结果相一致。根据本发明，确定底层发酵酵母的絮凝株(Bruchhefe)与非絮凝株(Staubhefe)之间的差异成为可能。根据本发明，在短时间内确定底层发酵酵母的絮凝特性成为可能，并且证实，这种测定可能是一种筛选方法。
表1
Figure C0081645500091
实施例2：底层发酵酵母的絮凝变体的评价
絮凝株和非絮凝株自发丢失来源于三种絮凝窖藏酵母的絮凝特性，这些菌株用实施例1所示的方法培养直到稳定期，并提取DNA。类似地，使用以上表1中的引物对，进行PCR反应。扩增产物进行电泳。
图2显示了一部分结果。它证实，能根据约5000bp的扩增DNA的存在与否确定絮凝细胞和非絮凝细胞，并能评价絮凝变体。包括FLO5序列两侧的任何引物对(引物a和c)都能用来确定絮凝特性的存在。
实施例3：酵母群中变体的群体搜索
①单菌落的分离和酵母DNA的提取
将啤酒发酵中具有不同絮凝特性的同一酵母株衍生的三种酵母群分别加到YPD平板培养基中(1％酵母提取物，2％蛋白胨、2％葡萄糖，2％琼脂糖)，在25℃下培养3天以分别分离几十个单菌落。使用实施例1所述的方法培养每个单菌落直到稳定期。收集得到的酵母，洗涤，用自动DNA提取装置(Toyobo Mag-Extractor II)提取酵母DNA。
②利用PCR方法对絮凝特性的确定
利用上述方法，用与表1所示相同的引物对进行PCR反应，对扩增产物进行电泳。
图3显示了一部分结果，即使用引物对a和c的结果。约5000bp的DNA扩增产物的存在和具有不同条带大小的扩增产物的存在得到证实。经PCR获得不同大小扩增产物的菌株用麦芽汁以50ml的小规模进行发酵试验，用上述Burns法确定絮凝特性。结果发现约5000bp的扩增DNA片段的存在与絮凝特性的存在相一致。在具有缩短的扩增DNA片段的菌株中证实有较差的絮凝特性。根据该方法，不仅能检测失去絮凝特性的菌株，而且能检测可能减少或失去絮凝特性的菌株，到目前为止这从未报道过。
③变体的群体搜索
根据如表2所示的上述结果，证实三种酵母群有不同比例的絮凝株。有极好絮凝特性的酵母群显示高比例的絮凝株，而有较差絮凝特性的酵母群显示低比例的絮凝株。低比例絮凝株的酵母群在发酵过程中在麦芽汁中有许多酵母细胞，预计发酵后的酵母收集较为困难。利用本方法，可能知道实际有影响力的絮凝变体的比例。
表2
  酵母群   A   B   C
  后期的絮凝   极好   较差   差
  絮凝株的比例   100％   68％   37％
实施例4：通过Southern杂交确定底层发酵酵母絮凝特性的方法
在YPD培养基中培养来源于絮凝酵母的絮凝株和经过自发突变产生的非絮凝株直到稳定期后，用《细胞生物学方法》(学院出版社，第12卷，第39-44页，1975)所述的方法提取所有DNA。提取的DNA用限制酶EcoRI或BamHI(Takara Shuzo)消化，用1％琼脂糖凝胶电泳，在尼龙膜high bond N+(Amasham Pharmacia生产)上印迹，进行Southern分析。
用絮凝酵母DNA作为模板，使用以上表1的引物对，通过PCR方法扩增产物。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离。在紫外照射下切下约5000bp的片段，用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)提取DNA。用提取物作为探针，用手册所示的ECL检测系统进行检测。
使用引物对a和c经PCR获得的扩增片段用作探针。结果显示于图4中。在非絮凝株中没有发现在絮凝株中发现的约9.3kb。因此，利用本发明确定絮凝特性是可能的。
工作应用可能性
利用本发明，能提供一种精确的方法，能不经过底层发酵酵母发酵，在短时间内容易、快速地确定底层发酵酵母的絮凝特性的存在，并检测非絮凝变体。能一次处理多个样品，因此该方法可用于酵母的研究与发展，以及工业生产的过程控制和质量控制。
序列表
<110>Asahi Breweries Ltd.
<120>确定底层发酵酵母的絮凝特性的方法
<130>99T6-24
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>1
atgacaattg cacaccactg
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>2
atttcctcctc agtaatttc
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>3
ttaaataatt gccagcaata
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>4
catgagattc gcaggatgtc

Claims (8)

1. 一种通过使用实验室酵母-酵酒酵母(Sacchalomyces cerevisiae)絮凝基因FLO5的ORF序列确定底层发酵酵母存在絮凝特性的方法，其特征在于培养样品酵母株，提取DNA，使用根据絮凝基因FLO5的ORF序列设计的含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物的引物组，用所述DNA进行PCR反应，检测扩增产物的存在。
2. 一种通过使用实验室酵母-酿酒酵母絮凝基因FLO5的ORF序列根据底层发酵酵母絮凝特性的遗传学改变确定存在非絮凝特性或较差絮凝特性的方法，其特征在于培养样品酵母株，提取DNA，使用根据絮凝基因FLO5的ORF序列设计的含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物的引物组，用所述DNA进行PCR反应，检测扩增产物的存在。
3. 一种通过使用实验室酵母-酿酒酵母絮凝基因FLO5的ORF序列根据底层发酵酵母絮凝特性的遗传学改变预知存在非絮凝特性或较差絮凝特性的方法，其特征在于培养样品酵母株，提取DNA，使用根据絮凝基因FLO5的ORF序列设计的含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物的引物组，用所述DNA进行PCR反应，比较所述DNA大小与具有絮凝特性的酵母株的扩增产物DNA大小。
4. 一种通过使用实验室酵母-酿酒酵母絮凝基因FLO5的ORF序列根据底层发酵酵母絮凝特性的遗传学改变确定非絮凝特性和较差絮凝特性的方法，其特征在于从酵母群中分离几个单菌落，培养每个菌落，提取DNA，使用根据絮凝基因FLO5的ORF序列设计的含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物的引物组进行PCR反应，检测扩增产物的存在，证实酵母群中的絮凝变体群体。
5. 一种通过使用实验室酵母-酿酒酵母絮凝基因FLO5的ORF序列预知底层发酵酵母的非絮凝特性和较差絮凝特性的方法，其特征在于从酵母群中分离几个单菌落，培养每个菌落，提取DNA，使用根据絮凝基因FLO5的ORF序列设计的含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物的引物组进行PCR反应，检测扩增产物的存在，证实酵母群中的絮凝变体群体。
6. 一种通过使用实验室酵母-酿酒酵母絮凝基因FLO5的ORF序列确定底层发酵酵母存在絮凝特性的方法，其特征在于，用絮凝酵母DNA作为模板，用PCR反应扩增的产物作为探针，其中PCR反应使用根据絮凝基因FLO5的ORF序列设计的含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物的引物组进行，与从培养的样品酵母中提取的DNA进行杂交。
7. 一种通过使用实验室酵母-酿酒酵母絮凝基因FLO5的ORF序列根据底层发酵酵母的遗传学改变确定非絮凝特性或较差絮凝特性的方法，其特征在于，用絮凝酵母DNA作为模板，用PCR反应扩增的产物作为探针，其中PCR反应使用根据絮凝基因FLO5的ORF序列设计的含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物的引物组进行，与从培养的样品酵母中提取的DNA进行杂交。
8. 根据权利要求1-7中任一项的方法，其中引物组含有序列表中的1或2号序列的第一条引物和3或4号序列的第二条引物。
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