KR100929998B1 - 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 및그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 및 그의 용도, 특히 목적하는 알콜 음료의 제조에 적절한 응집성을 가진 양조 효모, 상기 효모를 사용해 제조된 알콜 음료, 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 양조 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 MHP1 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비-ScMHP1 유전자의 발현 수준을 조절함으로써 목적하는 알콜 음료의 양조에 적합한 응집성이 부여된 효모, 상기 효모를 사용하여 제조된 알콜 음료, 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

효모의 응집성

Description

효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 및 그의 용도 {GENE ENCODING PROTEIN RESPONSIBLE FOR FLOCCULATION PROPERTY OF YEAST AND USE THEREOF}

본 발명은 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 및 그의 용도, 특히 적절한 응집성을 가진 알콜 음료를 제조하는 양조 효모, 상기 효모로 제조된 알콜 음료, 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 양조 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 MHP1 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비-ScMHP1 유전자의 발현 수준을 조절함으로써 적절한 응집성을 보여주는 효모, 상기 효모의 선별 방법, 상기 효모의 배양 방법, 및 상기 효모를 이용해 알콜 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

알콜 음료의 발효에 사용되는 효모의 응집성은 매우 중요하다. 효모의 응집성은 각각의 개별 효모 세포 사이의 상호작용의 결과로서 집합체를 형성하여, 액체 배양 배지 내에서 액체 바닥에 침전되는 성질을 의미한다.

예를 들어, 현재 보편적으로 마시고 있는 라거-형 맥주의 발효에 사용되는 효모를 하면 (bottom) 발효 효모라고도 하는데, 그 이유는 상기 효모가 발효가 끝날 때쯤에 응집을 형성하고 침전되는 특징을 갖고 있기 때문이다. 맥주 양조 시, 효모는 발효 후에 회수되고, 회수된 효모는 연속한 발효를 의미하는 "렌조 (Renjo)" 라고 하는 후속한 발효에 사용된다. 따라서, 효모의 응집성은 양조 과정의 작업 효율의 관점에서 매우 중요한 특성이다. 즉, 불량한 응집성을 가진 효모는 발효종료 시 침전되지 않아서, 그것을 회수하려면 원심분리와 같은 외부 단계가 필요하다는 문제점이 있다. 반면, 불필요하게 높은 응집성을 가진 효모는 발효 동안에 침전될 수 있고, 이는 발효의 미성숙한 종료를 초래할 수 있다. 그러한 경우, 생성 제품의 향 및 맛이 또한 심각하게 영향을 받는다. 따라서, 원하는 알콜 음료의 제조를 위해서는 적합한 응집성을 가진 효모를 사용하는 것이 매우 중요하다.

또한, 효율이 산업 알콜 제조 (신규 응집성 알콜 발효 효모 (Novel agglutinative alcohol fermenting yeast), 일본 심사청구된 특허 공개 (Kokoku) 제 H6-36734 호) 및 폐수 처리 분야 (일본 특허 제 3044284 호), 뿐만 아니라 알콜 음료 제조 분야에서 특히 필요하기 때문에, 효모의 응집에 대한 연구가 적극적으로 이루어져 있다.

FLO 유전자 패밀리 (FLO1, FLO5, FLO8, FLO9, FLO10, FLO11) 및 SFL1 등은 상기 언급된 효모의 산업상 중요한 응집성에 관한 대량의 연구 결과, 효모의 응집성을 초래하는 유전자로서 인지되어 왔다.

상기 연구에서, 예를 들어, FLO1 유전자의 특성을 분자 수준에서 분석하였다 (Bidard 등, YEAST, 11(9), 809, 1995). 맥주 효모의 응집성을 조절하는 방법을 Flo1p 를 이용해 연구하였다 (일본 특허 제 3643404 호).

FLO8 유전자의 발현을 조절함으로써 효모의 응집성을 조절하는 방법, 및 FLO5 유전자의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 응집 특성을 판단하는 방법 (국제 특허 제 WO01/040514 호) 등이 또한 보고되어 있다.

반면, 응집하는 효모에 특이적인 효모 세포 표면 단백질의 일부가 또한 공지되어 있다. 그러나, 각각의 단백질에 대한 지식은 맥주 효모의 응집성을 조절하는 연구를 하기에는 충분하지 못하다.

발명의 개시

상기 상황 하에, 양조 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 단백질을 사용하여 가능한 한 알콜 음료를 고-효율로 제조하기 위해서는, 원하는 알콜 음료의 제조에 적합한 응집성을 가진 효모를 배양할 필요가 있다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 심도 있는 연구를 하여, 그 결과, 맥주 효모로부터, 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자를 동정하고 단리하는데 성공하였다. 더욱이, 본 발명자들은 응집성이 실제로 조절될 수 있음을 증명하기 위해, 수득된 유전자의 발현을 조절한 형질전환된 효모를 제조하였고, 그리하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 양조 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 조절된 형질전환된 효모, 상기 유전자의 발현이 조절된 효모를 사용하여 응집성을 조절하는 방법 등에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 DNA 절편, 상기 벡터 또는 DNA 절편이 도입된 형질전환된 효모, 상기 형질전환된 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

(a) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(b) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(c) 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입 및/또는 첨가된 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열로 이루어지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(d) SEQ DD NO:2 의 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ;

(e) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(f) 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(2) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 (1) 에 따른 폴리뉴클레오티드 :

(g) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하거나, 또는 1 내지 10 개의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 상기 단백질은 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가짐 ;

(h) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 가지고, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(i) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(3) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 (1) 에 따른 폴리뉴클레오티드.

(4) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 (1) 에 따른 폴리뉴클레오티드.

(5) 폴리뉴클레오티드가 DNA 인, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드.

(6) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

(j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사체에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ;

(k) RNAi 효과를 통해, 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시키는 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ;

(l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사체를 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(m) 공-억제 효과를 통해, 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시키는 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.

(8) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.

(8a) 하기 성분을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 상기 (8) 의 벡터 :

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터 ;

(y) 센스 또는 안티센스 방향으로 프로모터에 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 ; 및

(z) RNA 분자의 전사 종료 및 폴리아데닐화에 대해 효모에서 작용할 수 있는 신호.

(8b) 하기 성분을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 상기 (8) 의 벡터 :

(x) 효모 세포 내에서 전사될 수 있는 프로모터 ;

(y) 프로모터에 센스 방향으로 연결되는 상기 (1) 내지 (5) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 ; 및

(z) RNA 분자의 전사 종료 및 폴리아데닐화에 대해 효모에서 작용할 수 있는 신호.

(8c) 하기 성분을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 상기 (8) 의 벡터 :

(x) 효모 세포 내에서 전사될 수 있는 프로모터 ;

(y) 프로모터에 안티센스 방향으로 연결되는 상기 (1) 내지 (5) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 ; 및

(z) RNA 분자의 전사 종료 및 폴리아데닐화에 대해 효모에서 작용할 수 있는 신호.

(9) 상기 (6) 에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.

(10) 상기 (8) 내지 (9) 중 어느 하나에 따른 벡터가 삽입된 효모.

(11) 응집성이 증가된, 상기 (10) 에 따른 효모.

(12) 상기 (7) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 응집성이 증가되는 상기 (11) 에 따른 효모.

(13) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 하기에 의해 억제되는 효모 :

(A) 상기 (8) 또는 (9) 에 따른 벡터를 도입함 ;

(B) 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 에 따른 유전자를 방해함 ; 또는

(C) 프로모터에 돌연변이를 일으키거나, 또는 프로모터를 유전적으로 변경시킴.

(14) 응집성이 감소된 상기 (13) 에 따른 효모.

(15) 상기 (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 따른 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법.

(16) 양조된 알콜 음료가 맥아 음료인 상기 (15) 에 따른 방법.

(17) 양조된 알콜 음료가 와인인 상기 (15) 에 따른 방법.

(18) 상기 (15) 내지 (17) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는 알콜 음료.

(19) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 효모의 응집성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법.

(19a) 상기 (19) 의 방법을 사용하여 높거나 또는 낮은 응집성을 가진 효모를 선별하는 방법.

(19b) 상기 (19a) 의 방법을 사용해 선별된 효모를 사용하여, 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(20) 하기를 포함하는, 효모의 응집성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법 :

테스트 효모를 배양함 ; 및

SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함.

(20a) 상기 (20) 에서 기술된 방법에 의해 테스트 효모를 평가하고, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 높거나 또는 낮은 발현 수준을 가진 효모를 선별하는 것을 포함하는, 효모의 선별 방법.

(20b) 상기 (20a) 의 방법을 사용해 선별된 효모를 사용하여 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(21) 하기를 포함하는 효모의 선별 방법 :

테스트 효모를 배양함 ;

상기 (7) 의 단백질을 정량화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함 ; 및

관심있는 응집성에 따른 유전자 발현 수준 또는 단백질의 양을 가진 테스트 효모를 선별함.

(22) 하기를 포함하는, 상기 (21) 에 따른 효모 선별 방법 :

대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 각각의 효모에 대해 측정함 ; 및

대조군 효모의 것보다 더 높거나 더 낮은 유전자 발현을 가진 테스트 효모를 선별함.

(23) 하기를 포함하는, 상기 (21) 에 따른 효모 선별 방법 :

대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

각각의 효모 내 상기 (7) 에 따른 단백질의 양을 정량화함 ; 및

대조군 효모보다 더 큰 또는 더 작은 양의 단백질을 가진 테스트 효모를 선별함. 즉, 하기를 포함하는, 상기 (21) 의 효모 선별 방법 :

다수의 효모를 배양함 ;

각각의 효모 내 상기 (7) 의 단백질의 양을 정량화함 ; 및

그 중에서 더 큰 또는 더 작은 양의 단백질을 가진 효모를 선별함.

(24) 하기를 포함하는 알콜 음료의 제조 방법 :

상기 (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 따른 효모, 또는 상기 (21) 내지 (23) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별되는 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하기 위해 발효를 수행함 ; 및

효모의 응집성을 조정함.

본 발명의 형질전환된 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법에 따르면, 알콜 음료는 원하는 알콜 음료의 제조에 적합한 응집성을 가진 효모를 사용함으로써 고-효율로 제조될 수 있다.

도 1 은 맥주 발효 테스트 시 시간에 따른 세포 성장을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 발효 테스트 시 시간에 따른 추출물 (당) 소비를 나타낸다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 명백한 추출물 농도 (중량/중량%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 발효 테스트 시 효모 내 비-ScMHP1 유전자의 발현 프로파일을 보여준다. 수평축은 발효 시간을 나타내고, 한편, 수직축은 검출된 신호의 세기를 나타낸다.

도 4 는 비-ScMHP1 분열된 계통의 응집성 테스트 결과를 보여준다. 수직축은 응집성을 가리키는 침전 지수 (Segmentation Index) 를 나타낸다.

발명을 수행하기 위한 최상의 형태

본 발명자들은 일본 특허 출원 공개 공보 제 2004-283169 호에서 개시된 방법에 따라 지도화된 라거 양조 효모 게놈 정보를 바탕으로 양조 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 비-ScMHP1 유전자를 단리하고 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO: 1 로 나타낸다. 또한, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 2 로 나타낸다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

우선, 본 발명자들은 (a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및 (b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열의 단백 질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드는 상기 기술된 라거 양조 효모로부터 유도되는 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 제한되지 않고, 상기 단백질에 상응하는 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상응하는 기능을 가진 단백질은 예를 들어, (c) 하나 이상의 아미노산 서열이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되고, 효모에 응집성을 부여하는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열의 단백질을 포함한다.

그러한 단백질은 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내기 여러 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열로 이루어지고, 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 바람직하게는 더 적다. 또한, 상기 단백질은 (d) SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 바람직하게는 더 높다.

효모의 응집성은 예를 들어, 일본 특허 출원 공개 공보 제 H8-205890 호에 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 또한 (e) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 ; 및 (f) 엄격한 조건 하에, SEQ ID NO:2 의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에서, "엄격한 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드" 는 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드, 또는 프로브로서 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 혼성화 방법은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기술된 방법일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은, 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA 와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다.

시판의 키트가 혼성화에 사용되는 경우, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 가 사용될 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃ 에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화된 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용해 측정될 수 있다 (Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990 ; Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램을 개발하였다 (Altschul SF 등, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드 길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 이고 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 (j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사체에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ; (k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시키는 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ; (l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사체를 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ; 및 (m) 공-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시키는 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입될 수 있고, 이 벡터는 형질전환을 위해 세포에 도입되어, 상기 (a) 내지 (i) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시킬 수 있다. 따라서, 이들 폴리뉴클레오티드는 상기 DNA 의 발현의 억제가 바람직한 경우에 적합하게 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 구 "DNA 의 전사체에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드" 를 소위 안티센스 DNA 라고 한다. 안티센스 기술은 특별한 내인성 유전자의 발현을 억제시키는 방법으로서 알려져 있고, 다양한 문헌에서 기술되어 있다 (예를 들어, [Hirajima and Inoue : New Biochemistry Experiment Course 2 Nucleic Acids IV Gene Replication and Expression (Japanese Biochemical Society Ed., Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.) pp.319-347, 1993] 참조). 안티센스 DNA 의 서열은 바람직하게는 내인성 유전자 전부 또는 부분에 상보적이나, 유전자의 발현을 효과적으로 억제시킬 수 있는 한 완전히 상보적일 수는 없다. 전사된 RNA 는 바람직하게는 표적 유전자의 전사체에 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상보성을 갖는다. 안티센스 DNA 의 길이는 15 개 염기 이상, 바람직하게는 100 개 염기 이상, 및 더욱 바람직하게는 500 개 염기 이상이다.

본원에서 사용된 구 "RNAi 효과를 통해 DNA 발현을 억제시키는 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드" 는 RNA 방해 (RNAi) 를 통해 내인성 유전자의 발현을 억제시키는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 용어 "RNAi" 는 표적 유전자 서열에 동일하거나 또는 유사한 서열을 가진 이중-가닥 RNA 가 세포에 도입되는 경우, 도입된 외부 유전자 및 표적 내인성 유전자 둘 다의 발현이 억제되는 현상을 말한다. 본원에서 사용된 RNA 는 예를 들어, 21 내지 25 개의 염기 길이의 RNA 방해를 야기하는 이중-가닥 RNA, 예를 들어, dsRNA (이중 가닥 RNA), siRNA (작은 방해성 RNA) 또는 shRNA (짧은 헤어핀 RNA) 를 포함한다. 그러한 RNA 는 리포좀과 같은 전달계를 사용해 목적 부위에 국소 전달될 수 있거나, 또는 상기 기술된 이중-가닥 RNA 를 생성하는 벡터가 그의 국소 발현에 사용될 수 있다. 상기 이중-가닥 RNA (dsRNA, siRNA 또는 shRNA) 를 생성하거나 또는 사용하는 방법은 많은 문헌에서 공지되어 있다 (예를 들어, 일본 국내 단계 공개 공보 특허 출원 제 2002-516062 호 ; US 2002/086356A ; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb. ; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April ; Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21 ; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16 ; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19 ; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30 ; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May ; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May ; Nucleic Acids Res., 30:10, e46, 2002 May 15] 참조).

본원에서 사용된 구 "DNA 의 전사체를 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드" 는 일반적으로 리보자임을 말한다. 리보자임은 표적 DNA 의 전사체를 절단하고 상기 유전자의 기능을 억제시키는 촉매 활성을 가진 RNA 분자이다. 리보자임의 디자인은 다양한 공지된 문헌에서 찾아볼 수 있다 (예를 들어, [FEBS Lett. 228: 228, 1988] ; [FEBS Lett. 239: 285, 1988] ; [Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989] ; [Nature 323: 349, 1986] ; [Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991] ; [Protein Eng 3: 733, 1990] ; [Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991] ; [Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991] ; [Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992] 참조). 또한, 구 "공-억제 효과를 통해 DNA 발현을 억제시키는 RNA 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드" 는 "공-억제" 에 의해 표적 DNA 의 기능을 억제시키는 뉴클레오티드를 말한다.

본원에서 사용된 용어 "공-억제" 는 표적 내인성 유전자와 동일하거나 또는 유사한 서열을 가진 유전자가 세포 내로 형질전환되는 경우, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자 둘 다의 발현이 억제되는 현상을 말한다. 공-억제 효과를 가진 폴리뉴클레오티드의 디자인은 또한 다양한 문헌에서 발견될 수 있다 (예를 들어, [Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996] 참조).

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 (a) 내지 (i) 의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것에 의해 암호화되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 하나 또는 다 수의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 포함하고, 효모에 응집성을 부여한다.

그러한 단백질은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 십입, 및/또는 첨가된, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 가지고, 효모에 응집성을 부여하는 것을 포함한다. 또한, 그러한 단백질은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열과 상기 언급된 바와 같은 상동성을 가지고, 효모에 응집성을 부여하는 것을 포함한다.

그러한 단백질은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, NUC. Adds. Res., 10: 6487 (1982), Proc. Natl. Acad Sci. USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc. Acids. Res., 13 : 4431 (1985), Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488 (1985)] 에서 기술된 부위-특이적 돌연변이를 적용함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기의 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 동일한 아미노산 서열 내 임의의 하나 이상의 위치에서 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 것을 의미한다. 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가 중 2 가지 이상의 유형은 동시에 발생할 수 있다.

이후, 서로 치환가능한 아미노산 잔기의 예가 열거된다. 동일한 군 내의 아미노산 잔기는 서로 치환가능하다. 군은 하기 제공된다.

A 군 : 루신, 이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌 ;

B 군 : 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 ;

C 군 : 아스파라긴, 글루타민 ;

D 군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산 ;

E 군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린 ;

F 군 : 세린, 트레오닌, 호모세린 ; 및

G 군 : 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 또한, [Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp.] 사의 펩티드 합성화제가 또한 예를 들어, 화학 합성에 사용될 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

다음, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (j) 내지 (m) 에서 기술된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 성분으로서 (x) 효모 세포에서 전사할 수 있는 프로모터 ; (y) 센스 또는 안티센스 방향으로 프로모터에 연결된 상기 (a) 내지 (i) 중 임의에서 기술된 폴리뉴클레오티드 ; 및 (z) RNA 분자의 전사 종료 및 폴리아데닐화에 대해 효모에서 작용하는 신호를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

본 발명에 따르면, 하기 기술된 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 의 양조 시 상기 기술된 본 발명의 단백질을 고도로 발현시키기 위해, 상기 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 센스 방향으로 도입하여, 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것에서 기술된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 촉진시킨다. 또한, 하기 기술된 알콜 음료 (예를 들어, 맥주) 의 양조 시 본 발명의 상기 단백질을 억제시키기 위해, 상기 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 안티센스 방향으로 도입하여, 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것에서 기술된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시킨다.

본 발명의 상기 단백질을 억제시키기 위해, (j) 내지 (m) 중 임의의 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 폴리뉴클레오티드를 벡터에 도입시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 유전자 (DNA) 는 상기 기술된 DNA 의 발현 또는 상기 기술된 단백질의 발현을 억제시키기 위해 방해받을 수 있다. 유전자는 표적 유전자 내 유전자 생성물의 발현에 관여하는 영역, 예를 들어, 코딩 영역 또는 프로모터 영역에 또는 영역으로부터 하나 이상의 염기를 첨가하거나 또는 소실시킴으로써, 또는 상기 영역을 완전히 소실시킴으로써 방해받을 수 있다. 그러한 유전자 방해는 공지된 문헌에서 찾을 수 있다 (예를 들어, [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979), Methods in Enzymology, 101, 202(1983), 일본 특허 출원 공개 공보 제 6-253826 호] 참조).

추가로, 본 발명에서, 표적 유전자의 발현 수준은 프로모터에 돌연변이를 일 으키거나 또는 상동 재조합에 의해 프로모터를 유전적으로 변경시킴으로써 조절될 수 있다. 그러한 돌연변이 도입 방법은 [Nucleic Acids Res. 29, 4238-4250 (2001)] 에 기술되어 있고, 그러한 프로모터의 변경은 예를 들어, [Appl Environ Microbiol.,72, 5266-5273 (2006)] 에 기술되어 있다.

효모에 도입된 벡터는 멀티카피 유형 (YEp 유형), 단일카피 유형 (YCp 유형), 또는 염색체 통합 유형 (YIp 유형) 중 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTAL MINIPULATION OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 유형 벡터로서 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 은 YCp 유형 벡터로서 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl. Acad Sd. USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 유형 벡터로서 알려져 있고, 이들 모두는 쉽게 이용가능하다.

효모 내 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 그것들이 양조 효모에서 작용하고, 발효액 내 구성성분에 의해 영향을 받지 않는 한, 임의로 병용해서 있을 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터가 사용될 수 있다. 이들 유전자는 이전에 클로닝되었고, 예를 들어, [M. F. Tuite 등, EMBO J, 1, 603 (1982)] 에 상세히 기술되어 있고, 공지된 방법에 의해 쉽게 이용가능하다.

영양요구성 마커가 양조 효모에 대한 형질전환 시 선택성 마커로서 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네시틴-내성 유전자 (G418r), 구리-내성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌-내성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각 [Junji Inokoshi 등, Biochemistry, 64, 660, 1992] ; 및 [Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991]) 가 사용될 수 있다.

상기 기술된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예는 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 및 쉐이크용 양조 효모를 포함한다. 구체적으로는, 속 (genus) 사카로미세스 (Saccharomyces) 가 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 사칼로미세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로미세스 칼스베르게니스 (Saccharomyces carlsbergenis) NCYC453 또는 NCYC456 등, 또는 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC 1951, NBRC 1952, NBRC 1953 또는 NBRC 1954 등과 같은 라거 양조 효모가 사용될 수 있다. 또한, 사카로미세스 세레비시애 NCYC90 과 같은 위스키 효모, 일본 양조 협회 (Brewing Society of Japan) 의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본 양조 협회의 쉐이크 효모 #7 및 9 와 같은 쉐이크 효모가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 사카로미세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모가 바람직하게 사용될 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법에는 전기영동 방법 (Meth. Enzym., 194 : 182 (1990)), 스페로플라스트 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153 : 163 (1983)), 및 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기술된 방법이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

더욱 구체적으로는, 숙주 효모는 OD600 nm 가 1 내지 6 일 표준 효모 배양 배지 (예를 들어, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 내에서 배양된다 . 상기 배양 효모를 원심분리에 의해 수합하고, 세정하고, 약 1 내지 2 M 의 농도에서 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 전-처리한다. 세포를 약 30℃ 에서 약 60 분 동안 방치한 후, DNA (약 1 내지 20 μg) 가 도입되도록 약 30℃ 에서 약 추가의 360 분 동안 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 약 20% 내지 50% 의 최종 농도로 첨가한다. 약 30℃ 에서 약 30 분 동안 방치한 후, 세포를 약 42℃ 에서 약 5 분 동안 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁액을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 예정된 양의 새로운 효모 영양 배지에 첨가하고, 약 30℃ 에서 약 60 분 동안 방치한다. 그런 후, 선택성 마커로서 항생제 등을 함유하는 표준 한천 배지에 심어서, 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은 예를 들어, [MOLECULAR CLONING 3rd Ed., and METHODS IN YEAST GENEICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾을 수 있다.

4. 본 발명의 방법에 따른 알콜 음료의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조되는 알콜 음료

유전자의 발현 수준을 조절하기 위해 본 발명의 벡터 또는 상기 기술된 DNA 절편을 표적 알콜 음료를 양조하는데 적합한 효모에 도입하여 표적 알콜 음료에 적합한 응집성을 가진 효모를 수득할 수 있다. 따라서, 알콜 음료는 고-효율적으로 제조될 수 있다. 즉, 본 발명의 벡터 또는 DNA 절편이 상기 기술된 바와 같이 도입된 효모, 상기 기술된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 조절 (촉진 또는 억제) 된 효모, 또는 알콜 음료를 제조하는 발효에 대한 하기 기술된 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여, 응집성을 조절 (상승 또는 감소) 함으로써 목적하는 종류의 알콜 음료를 고-효율적으로 제조할 수 있다. 표적 알콜 음료는 예를 들어, 스파클링 알콜음료 (하포우시 (happoushii)), 와인, 위스키, 쉐이크 등과 같은 맥주-맛 음료, 맥주를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 연료용 알콜과 같이 실용적인 용도를 위한 알콜이 또한 그 중에에 포함된다.

이러한 알콜 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모 계통 대신에 사용하는 것을 제외하고는, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장치, 제조 조건 등이 통상의 것과 정확히 동일할 수 있기 때문에, 알콜 음료 제조 비용이 증가될 필요는 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 비용 증가 없이 기존의 설비를 사용해 알콜 음료를 고-효율적으로 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열을 갖고 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프로 브 또는 프라이머를 사용해 효모의 응집성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 평가 방법에 대한 일반적인 기술은 알려져 있으며, 예를 들어, [WO 01/040514, 일본 공개 공보 특허 출원 제 HS-205900 호] 등에 기술되어 있다. 이러한 평가 방법은 하기에 기술된다.

첫째, 테스트 효모의 게놈을 제조한다. 이러한 제조를 위해, Hereford 방법 또는 칼륨 아세테이트 방법과 같은 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, METHODS IN YEAST GENEICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 을 바탕으로 디자인된 프로브 또는 프라이머를 사용해, 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재를 수득된 테스트 효모 게놈에서 측정한다. 프라이머 또는 프로브를 공지 기술에 따라 디자인할 수 있다.

유전자 또는 특정 서열의 검출을 공지 기술을 사용해 수행할 수 있다. 예를 들어, 특정 서열 모두 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 사용하고, 한편 상기 서열의 상부 또는 하부 서열 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 또다른 프라이머로서 사용하여, PCR 방법에 의해 효모의 핵산을 증폭시켜서, 증폭된 생성물의 존재 및 증폭된 생성물의 분자량을 측정한다. 프라이머에 사용되는 폴리뉴클레오티드의 염기 수는 일반적 으로 10 개 염기 (bp) 이상, 및 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 프라이머 사이의 염기의 수는 적합하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 반응 조건은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 변성 온도가 90 내지 95℃, 어닐링 온도가 40 내지 6O℃, 신장 온도가 60 내지 75℃ 이고, 순환 수가 10 회 이상일 수 있다. 생성 반응 생성물은 예를 들어, 아가로스 겔을 사용한 전기영동에 의해 분리되어, 증폭된 생성물의 분자량을 측정할 수 있다. 이러한 방법은 증폭된 생성물의 분자량이 특정 부분의 DNA 분자를 함유하는 크기인지에 의해 결정되어, 효모의 응집성을 예견 및 추정하게 한다. 또한, 증폭된 생성물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 특성을 더욱 정확하게 예견하고/하거나 또는 추정할 수 있다.

더욱이, 본 발명에서, 테스트 효모를 배양하여, SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 효모의 응집성에 대해 테스트 효모를 평가한다. 이러한 경우, 테스트 효모를 배양한 다음, 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자로부터 생성되는 mRNA 또는 단백질을 정량화한다. mRNA 또는 단백질의 정량화는 공지된 기술을 사용해 수행할 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 혼성화 또는 정량화 RT-PCR 에 의해 정량화될 수 있고, 한편 단백질은 예를 들어, 웨스턴 블로팅에 의해 정량화될 수 있다 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

더욱이, 테스트 효모를 배양하고, SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 효모에 응집성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하여, 표적 응집성에 따라 유전자 발현 수준을 가진 테스트 효모를 선별하여, 목적하는 알콜 음료를 양조하기에 바람직한 효모를 선별한다. 또한, 대조군 효모 및 테스트 효모를 배양하여, 효모의 각각에 있는 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여, 바람직한 테스트 효모를 선별할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어, 대조군 효모 및 하나 이상의 테스트 효모를 배양하고, SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 유전자의 발현 수준을 각각의 효모에서 측정한다. 대조군 효모의 것보다 더 높게 (즉, 발현 수준이 향상됨) 또는 더 낮게 (즉, 발현 수준이 억제됨) 발현되는 유전자가 있는 테스트 효모를 선별함으로써, 알콜 음료 양조에 적합한 효모를 선별할 수 있다.

대안적으로는, 테스트 효모를 배양하고, 높거나 또는 낮은 응집성을 가진 효모를 선별하여, 목적하는 알콜 음료의 양조에 적합한 효모를 선별한다.

이러한 경우, 테스트 효모 또는 대조군 효모는 예를 들어, 본 발명의 벡터 또는 DNA 절편이 도입된 효모, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 조절된 효모, 인공적으로 돌연변이된 효모, 또는 자연적으로 돌연변이된 효모일 수 있다. 효모의 응집성은 예를 들어, 일본 특허 출원 공개 공보 제 H8-205890 호에 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다. 돌연변이 처리는 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약물로의 처리와 연관된 화학적 방법을 포함하여, 임의의 방법을 적용할 수 있다 (예를 들어, [Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP] 참조).

또한, 대조군 효모 또는 테스트 효모로서 사용되는 효모의 예는 맥주, 와인, 쉐이크 등에 대한 양조 효모를 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모를 포함한다. 더욱 구체적으로는, 속 사카로미세스와 같은 효모가 사용될 수 있다 (예를 들어, S. 파스토리아누스, S. 세레비시애, 및 S. 칼스베르게니스). 본 발명에 따르면, 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 ; 사카로미세스 칼스베르게니스 NCYC453 또는 NCYC456 ; 또는 사카로미세스 세레비시애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등과 같은 라거 양조 효모가 사용될 수 있다. 추가로, 일본 양조 협회의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모 ; 및 일본 양조 협회의 쉐이크 효모 #7 및 9 와 같은 쉐이크 효모가 또한 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 사카로미세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모가 바람직하게는 사용될 수 있다. 대조군 효모 및 테스트 효모는 임의로 병용해서 상기 효모로부터 선택될 수 있다.

이후, 본 발명은 작동 실시예를 참조로 더욱 상세히 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 하기 기술된 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1 : 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 (비 ScMHP1 ) 의

클로닝

일본 특허 출원 공개 공보 제 2004-283169 호에 기술된 비교 데이타베이스를 이용한 연구 결과, 양조 효모의 응집성을 초래하는 단백질을 암호화하는 유전자 (비ScMHP1) (SEQ ID NO: 1) 를 발견하였다. 획득된 뉴클레오티드 서열 정보를 바탕으로, 프라이머 비ScMHP1-F (SEQ ID NO: 3) 및 비ScMHP1_R (SEQ ID NO: 4) 을 유전자의 전장을 증폭시키기 위해 디자인하였다. 주형으로서 게놈 서열화 계통인 사카로미세스 파스토리아누스 바이헨슈테판 (Weihenstephan) 34/70 (종종 "W34/79 계통" 이라고 줄여서 말함) 의 염색체 DNA 를 사용하여 PCR 을 수행하여, 비ScMHP1 의 전장 유전자를 포함한 DNA 절편을 수득하였다.

그렇게 해서 수득된 비ScMHP1 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하였다. 비ScMHP1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 Sanger's 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 에 의해 분석하여, 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2 : 맥주 발효 동안에 비ScMHP1 유전자의 발현 분석

맥주 발효 테스트를 라거 양조 효모인 사카로미세스 파스토리아누스 W34/70 을 사용하여 수행하였다.

맥아 추출물 농도 12.69%

맥아 함량 70 L

맥아 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15℃

효모 피칭률 12.8 x 10⁶ 세포/mL

발효액을 시간 경과에 따라 샘플링하고, 효모 세포 성장의 양 (도 1) 및 명확한 추출물 농도 (도 2) 에 있어서의 시간-경과 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포를 제조된 mRNA 에 샘플링하고, 제조된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. 유전자칩 조작 시스템 (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0, Affymetrix Co 에 의해 제조됨) 을 사용해 신호를 검출하였다. 비ScMHP1 유전자의 발현 패턴을 도 3 에 나타낸다. 상기 결과는 일반적인 맥주 발효에서 비ScMHP1 유전자의 발현을 확인시켜 주었다.

실시예 3 : 비 ScMHP1 유전자의 방해

문헌 (Goldstein 등, Yeast, 15, 1541 (1999)) 에서 기술된 방법에 따라 주형으로서 약물 내성 마커 (pAG25(nat1)) 를 함유하는 플라스미드를 사용한 PCR 에 의해 유전자 방해를 위한 절편을 제조하였다. 비ScMHP1_델타_for (SEQ ID NO. 5) 및 비ScMHP1_델타_rv (SEQ ID NO. 6) 로 이루어진 프라이머를 PCR 프라이머로 사용하였다.

라거 양조 효모 사카로미세스 파스토리아누스 계통 W34/70 에서 단리한 스포어 클론 (spore clone) (W34/70-2) 을 상기 기술된 바와 같이 제조된 유전자 방해를 위한 절편을 사용해 형질전환시켰다. 일본 특허 출원 공개 공보 제 H07-303475 호에 기술된 방법에 따라 형질전환시키고, 형질전환체를 50 mg/L 노우세오트리신 (nourseothricin) 을 함유하는 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스, 2% 한천) 상에서 선별하였다.

실시예 4 : 비- ScMHP1 방해된 계통의 응집성 평가

실시예 3 에서 수득된 방해된 계통 및 모 계통 (W34/70-2 계통) 의 응집성을 하기 기술된 방법에 의해 평가하였다.

효모에 글루코스 CM 배지 (3% 글루코스, 1% 박토 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% KH₂PO₄, 0.2% MgSO₄·7H₂O) 50 mL 을 주입한 다음, 30℃ 에서 2 일 동안 정적으로 배양하였다.

배양물 전체량을 글루코스 CM 배지 450 mL 에 옮기고, 15℃ 에서 4 일 동안 정적으로 배양하였다. 효모 세포를 원심분리에 의해 수합한 다음, 이어서 5℃ 의 냉수로 2 회 세정하였다. 수득된 젖은 효모 세포 1.5 그램 (1.5 g) 을 정확하게 무게를 재고, 2mM Ca 를 함유하는 0.1 M 아세테이트 완충액 20 mL 중에서 현탁시키고, 15℃ 에서 온도 조절된 방 안에서 온도를 평형화시켰다.

15℃ 에서 온도 조절된 방 안에서 후속한 측정 과정을 수행하였다. 보텍스 혼합기에 의해 30 초 동안 혼합시킨 효모 현탁액을 뷰렛에 부은 다음, 즉시 현탁액 2 mL 을 0 분째 샘플로서 수합하였다. 나머지는 10 분 동안 방치한 후, 현탁액 2 mL 을 10 분째 샘플로서 수합하였다.

수합된 효모 현탁액의 OD600 를 각각 측정하고, 응집성 (침전 지수 (Segmentation Index) ; SI) 을 하기 화학식에 의해 계산하였다. 결과를 도 4 에 나타내었다. 값은 n = 2 의 측정값의 평균이었다.

SI = (OD_{10 분} - OD_{0 분})/OD_{0 분} * 100

도 4 에서 나타낸 바와 같이, 방해된 계통의 SI = 139 는, 효모의 응집성이 모 계통에서의 SI = 244 과 비교해 비-ScMHP1 의 방해에 의해 감소되었음을 보여준다.

실시예 5 : 비 ScMHP1 -고도 발현 계통의 구축

실시예 1 에서 기술된 비ScMHP1/pCR2.1-TOPO 를 제한 효소 SacI 및 NotI 로 잘라서, 단백질-암호화 영역의 전장을 함유하는 DNA 절편을 제조하였다. 이 절편을 제한 효소 SacI 및 NotI 로 처리한 pYCGPYNot 에 연결하여, 비ScMHP1 고도 발현 벡터 비ScMHP1/pYCGPYNot 를 구축하였다. pYCGPYNot 는 YCp-유형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도 발현된다. 제네티신-내성 유전자 G418^r 을 효모 내에 선택성 마커로서 포함하고, 앰피실린-네성 유전자 Amp^r 을 대장균 (Escherichia coli) 에서 선택성 마커로서 포함하였다.

상기 방법에 의해 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, 사카로미세스 파스테리아누스 바이헨슈테판 34/70 계통을 일본 특허 출원 공개 공보 제 H07-303475 호에서 기술된 방법에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 제네티신 300 mg/L 를 함유하는 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스 및 2% 한천) 상에서 선별하였다.

상기 기술된 방법에 의해 수득된 고도 발현 계통 및 모 계통 (W34/70 계통) 의 응집성을 실시예 4 와 동일한 방법에 의해 평가하였다.

본 발명의 알콜 음료 제조 방법은 목적하는 알콜 음료 제조에 적합한 효모를 사용함으로써 알콜 음료를 고-효율적으로 제조할 수 있게 하는데, 그 이유는 발효 동안에 효모의 응집성이 조절될 수 있기 때문이다.

<110> Suntory Limited <120> Gene encoding protein responsible for flocculation property of yeast and use thereof <130> G07-0107 <140> PCT/JP2006/326399 <141> 2006-12-27 <150> JP2006-49135 <151> 2006-02-24 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4074 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atggattcca aggacacgca aaagttgctt aaggagcacc gaattccctc catcgatgtc 60 ggctggctgg tcaggcccaa cgcctccgcc ctcaggcacg agaggtccaa gtcgacggct 120 gagagcgtgg cccccgacgt ccagatggac actgctcact cgtccgtctt cgacaagtct 180 gtagacacgt cttgcggcat tctctcccca aatgataggg tgcgccgcca ctccgtggcg 240 gcggccgctc tgatgaataa ccagcacatc actgttgccc ctaccgcgcc ctccacgaac 300 ttcccctccg gtagaggacg gtccaaatcc gtggtagaga tcacgatgcc aggctccggc 360 gttgacgccg atgctgacgc tggacttcgc catcaccatc accatcatca ccatcatgcg 420 gaagacgcag cttcgtcacc tgcccccaag aagatcggtt tcttcaagag tttatttggc 480 aaaaggaagg gagaacaaga gcagcagaag cgcgaaaaag acaaggagga acaagaacaa 540 aaccgctcgc cctccccggg ccacgtgaac cgcaactcca taagaagaga acgaaccgcg 600 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ggtccgtcgt tatacacaga ctgacaccgc aagagaggaa gaaaattatg 1500 gagtcgacaa gcctgggcgt cgtcgttggg ggcactggcc aattgaaact gctaaatcca 1560 gaagaggacg acatcaacgc caagagcaaa gaggagatgg ctccgcaaag gcaaaacgca 1620 gccgaagcgc ccgatgagga agatggcaac ccgcagagaa gaaacatcgt tatggctgcc 1680 gcagaagccg ccgcagaagc cagagccaaa gaggccccca acgagttgaa gcgtattgtc 1740 acgaacaatg aggaggaagt catcgttagt aagaccgcgt gtcatttaac cattgataag 1800 ccgatgatct caagaagggg tgcttccaca acctctctgg cctccatggt gtcgagtgat 1860 actaatggta cgaacgcaga tgacgagaag gagaccatgc ccccacccaa ccaaaagatc 1920 ccccacgata tcgtgtatac ccgctgctgt catttaagag aaattttgcc aataccggcc 1980 actttgaaac agttgaaaaa gggatccacc gaccccatcc ccatcttaca attgcgtaac 2040 ccaagaccct ccatggtgga aatttggtca tttagcgact tcttgagtgt ggcccccgtt 2100 ttgtgtcttt cgttggacgg tgtgcaatta acggtgcaaa tgctcagaag cattttgagt 2160 tctttgattt acaacccaca tttccaaaaa ctgtccttga gaaacacttt cctggatgaa 2220 gaaggctgga aaatgttatg ctattttgtc tccaaggcca ggtctttgca ttccatcgat 2280 ttgaccatgg 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aggatgcgcc agaccagtcc caagcagaca attcaagtga taacatatct 4020 cttacgaccg accaaacatc gacagggttc tgccagtgcc aagacgaaca atga 4074 <210> 2 <211> 1357 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 2 Met Asp Ser Lys Asp Thr Gln Lys Leu Leu Lys Glu His Arg Ile Pro 1 5 10 15 Ser Ile Asp Val Gly Trp Leu Val Arg Pro Asn Ala Ser Ala Leu Arg 20 25 30 His Glu Arg Ser Lys Ser Thr Ala Glu Ser Val Ala Pro Asp Val Gln 35 40 45 Met Asp Thr Ala His Ser Ser Val Phe Asp Lys Ser Val Asp Thr Ser 50 55 60 Cys Gly Ile Leu Ser Pro Asn Asp Arg Val Arg Arg His Ser Val Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Leu Met Asn Asn Gln His Ile Thr Val Ala Pro Thr Ala 85 90 95 Pro Ser Thr Asn Phe Pro Ser Gly Arg Gly Arg Ser Lys Ser Val Val 100 105 110 Glu Ile Thr Met Pro Gly Ser Gly Val Asp Ala Asp Ala Asp Ala Gly 115 120 125 Leu Arg His His His His His His His His His Ala Glu Asp Ala Ala 130 135 140 Ser Ser Pro Ala Pro Lys Lys Ile Gly Phe Phe Lys Ser Leu Phe Gly 145 150 155 160 Lys Arg Lys Gly Glu Gln Glu Gln Gln Lys Arg Glu Lys Asp Lys Glu 165 170 175 Glu Gln Glu Gln Asn Arg Ser Pro Ser Pro Gly His Val Asn Arg Asn 180 185 190 Ser Ile Arg Arg Glu Arg Thr Ala Thr Ile Ser Ala Glu Ser Pro Pro 195 200 205 Pro Leu Gln Tyr Val Ala Pro Pro Ser Tyr Asn Asp Thr Val Val Pro 210 215 220 Leu Thr Arg Ser Lys Thr Glu Ser Glu Val Tyr Tyr Glu Asn His Pro 225 230 235 240 Gln Asn Asn Thr His Gly His Ile His Thr Gln His Thr Phe Asp Glu 245 250 255 Gly Gln Thr Asp Cys Ser Ser Pro Ile Asp Gly Ala Ala Cys Ser Gly 260 265 270 Thr Arg Pro Asp Pro Arg Leu Met Asp Phe Leu Arg Tyr Tyr Lys Ser 275 280 285 Lys Asp Tyr Lys Leu Ala Ala Phe Lys Glu Gly Asn Phe Leu Gln Ser 290 295 300 Thr Pro Ser Ser Pro Ile Lys Arg Asn Thr Arg Ala Ser Phe Ser Leu 305 310 315 320 Gln Asn Asp Arg Gln Leu Pro Pro Lys Leu Ala Ala Arg Gln Lys Phe 325 330 335 Asp Val Lys Gly Arg Pro Ile Pro Pro His Pro Asp Lys Pro Arg Leu 340 345 350 Ala Pro Ala Phe Lys Lys Lys Lys Gln Pro Val Ala Met Ala Ser Leu 355 360 365 Glu Ala Val Asp Ser Asn Ser Asp Val Ser Ser Ser Ala Gln Asn Asn 370 375 380 Asn Ala Ala Pro Ser Ser His Lys Phe Gly Ala Phe Leu Arg Lys Val 385 390 395 400 Thr Ser Tyr Gly Asn Asn Ala Ser Ser Ser Ser Ala Asn Thr Asn Asn 405 410 415 Leu Leu Asn Ala Ser Ser Thr Ser Val Trp Ser Ala Asn Ser Leu Glu 420 425 430 Phe Asp Pro Ala Lys Ile Thr Val Val Pro Gly Leu Glu Tyr Val Lys 435 440 445 Pro Leu Lys His Val Ser Phe Ala Thr Asn Thr Tyr Phe Asn Asp Pro 450 455 460 Pro Gln Gln Ile Cys Ser Lys Asn Pro Arg Arg Gly Glu Val Glu Val 465 470 475 480 Glu Pro Asn Gly Ser Val Val Ile His Arg Leu Thr Pro Gln Glu Arg 485 490 495 Lys Lys Ile Met Glu Ser Thr Ser Leu Gly Val Val Val Gly Gly Thr 500 505 510 Gly Gln Leu Lys Leu Leu Asn Pro Glu Glu Asp Asp Ile Asn Ala Lys 515 520 525 Ser Lys Glu Glu Met Ala Pro Gln Arg Gln Asn Ala Ala Glu Ala Pro 530 535 540 Asp Glu Glu Asp Gly Asn Pro Gln Arg Arg Asn Ile Val Met Ala Ala 545 550 555 560 Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Arg Ala Lys Glu Ala Pro Asn Glu Leu 565 570 575 Lys Arg Ile Val Thr Asn Asn Glu Glu Glu Val Ile Val Ser Lys Thr 580 585 590 Ala Cys His Leu Thr Ile Asp Lys Pro Met Ile Ser Arg Arg Gly Ala 595 600 605 Ser Thr Thr Ser Leu Ala Ser Met Val Ser Ser Asp Thr Asn Gly Thr 610 615 620 Asn Ala Asp Asp Glu Lys Glu Thr Met Pro Pro Pro Asn Gln Lys Ile 625 630 635 640 Pro His Asp Ile Val Tyr Thr Arg Cys Cys His Leu Arg Glu Ile Leu 645 650 655 Pro Ile Pro Ala Thr Leu Lys Gln Leu Lys Lys Gly Ser Thr Asp Pro 660 665 670 Ile Pro Ile Leu Gln Leu Arg Asn Pro Arg Pro Ser Met Val Glu Ile 675 680 685 Trp Ser Phe Ser Asp Phe Leu Ser Val Ala Pro Val Leu Cys Leu Ser 690 695 700 Leu Asp Gly Val Gln Leu Thr Val Gln Met Leu Arg Ser Ile Leu Ser 705 710 715 720 Ser Leu Ile Tyr Asn Pro His Phe Gln Lys Leu Ser Leu Arg Asn Thr 725 730 735 Phe Leu Asp Glu Glu Gly Trp Lys Met Leu Cys Tyr Phe Val Ser Lys 740 745 750 Ala Arg Ser Leu His Ser Ile Asp Leu Thr Met Val Pro Ser Ile Lys 755 760 765 Thr Asn Val Gln Lys Pro Ser Lys Ser Ser Leu Lys Ser Thr Ile Leu 770 775 780 Arg Met Gln Cys Asn Thr Asp Asp Arg Ser Asp Met Asn Trp Asp Leu 785 790 795 800 Leu Thr Ala Ser Ile Ala Leu Arg Gly Gly Leu Asp Glu Ile Val Ile 805 810 815 Ser Gly Ala Lys Met Asn Gly Ala Gln Phe Lys Asn Phe Ile Leu Val 820 825 830 Ala Cys Ile Ala Thr Glu Arg Leu Gly Leu Ala Tyr Asn Gly Leu Ser 835 840 845 Lys Ser Gln Cys Asp Asp Leu Ala Ser Trp Val Val Gln Ser Glu Val 850 855 860 Thr Gly Leu Asp Ile Gly Phe Asn Asp Leu Asn Gly Lys Leu Ser Ser 865 870 875 880 Phe Thr Asn Ala Val Leu Gly Lys Ile Gln Lys Val Asn Glu Lys Asn 885 890 895 Val Phe Lys Phe Leu Ser Leu Asn Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Glu 900 905 910 His Asp Thr Tyr Glu Asn Asn Glu Val Leu Lys Leu Ile Ser Val Leu 915 920 925 Cys Tyr Ser Glu Asn Leu Lys Phe Leu Asp Ile Ser Asn Asn Pro Ala 930 935 940 Ile Phe Pro Tyr Cys Val Pro Thr Leu Ile Asp Phe Leu Pro Val Phe 945 950 955 960 Val Asn Leu Val Arg Leu Gln Ile Asp Tyr Asn Asn Leu Ser Ser Thr 965 970 975 Ser Val Val Met Leu Ala Glu Val Leu Pro Met Cys Ser Arg Leu Ser 980 985 990 Tyr Phe Ser Met Leu Gly Thr Glu Leu Asp Leu Ala Ser Ser Lys Ala 995 1000 1005 Leu Ala Glu Ala Val Arg Lys Ser Ser Ser Leu Met Thr Leu Asp Val 1010 1015 1020 Asp Tyr Ala Tyr Met Pro Glu Asn Ile Lys Glu Lys Ile Ser Leu Tyr 1025 1030 1035 1040 Ala Met Arg Asn Ile Gln Gly Glu Leu Lys Arg Val Gln Asn Asp Asp 1045 1050 1055 Lys Asp Ile Lys Asp Thr Gln Phe Ser Ser Leu Gln Asp Gln Leu Ser 1060 1065 1070 Leu Leu Leu Thr Glu Lys Ala Asp Asp Ser Glu His Tyr Lys Lys Met 1075 1080 1085 Val Glu Asn Phe Met Ala Lys Ile Ala Leu Ala Arg Ile Lys Ile Ser 1090 1095 1100 Lys Val Val His Asp Leu Phe Gly Leu Lys Leu Asn Gly Gln Leu Asn 1105 1110 1115 1120 Leu Glu Gly Lys Glu Ala Leu Ile Arg Leu Cys Phe Ile Glu Ala Ser 1125 1130 1135 Leu Glu Arg Gly Ser Asp Leu Leu Arg Gln Arg His His Asn Ala Leu 1140 1145 1150 Lys Pro Arg Ser Ser Phe Ser Ala Asn Gln Thr Asp Ala Asn Ser Glu 1155 1160 1165 Ser Cys Gln Arg Met Leu Leu Ser Ser Ser Ile Leu Gln Asn Ser Asp 1170 1175 1180 His Ile Ala Leu Met Pro Phe Gly Ser Ala Leu Val Glu Lys Ser Ser 1185 1190 1195 1200 Ala Asp Ala Glu Asp Ala Val Glu Phe Arg Glu Gly Asp Asp Ser Asn 1205 1210 1215 Thr Asn His Glu Glu Gly Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Gln Asp Gln 1220 1225 1230 Val Asp Ile Lys Asn Lys Tyr Ser Ile Ile Lys Lys Glu Leu Glu His 1235 1240 1245 Glu Lys Leu Val Gly Gly Gly Asp Leu Pro Val Asp Lys Asp Ile Leu 1250 1255 1260 Asn Arg Ala Ala Gln Ser Leu Asp Ser Asp Gln Ile Lys Glu Phe Leu 1265 1270 1275 1280 Leu Lys Asn Asp Val Ser Thr Ile Leu Gly Val Ile Asp Glu Leu His 1285 1290 1295 Ser Gln Gly Tyr His Leu His His Ile Phe Lys Lys Gln Gly Asn Gln 1300 1305 1310 Ser Asp Lys Gln Glu Asp Ala Thr Leu Gln Ala Lys Asp Ala Pro Asp 1315 1320 1325 Gln Ser Gln Ala Asp Asn Ser Ser Asp Asn Ile Ser Leu Thr Thr Asp 1330 1335 1340 Gln Thr Ser Thr Gly Phe Cys Gln Cys Gln Asp Glu Gln 1345 1350 1355 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gagctcatag cggccatgga ttccaaggac acgcaaaagt 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggatcctatg cggccgctac ataaaattat catacataaa ag 42 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cttaacgcac atatatacgc aaatacacat catagctcca caactgctcc ccttgacagt 60 cttgacgtgc 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atgcaacatg atctctaaac tccaatgaaa agaaagaaag aaatccttca cgcacttaac 60 ttcgcatctg 70

Claims (30)

1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 :

   (a) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 및

   (b) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA 인 폴리뉴클레오티드.
6. 삭제
7. 제 1 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질.
8. 제 1 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
9. 삭제
10. 제 8 항에 따른 벡터가 도입된 효모.
11. 제 10 항에 있어서, 응집성이 증가된 효모.
12. 삭제
13. 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 하기에 의해 억제되는 효모 :

    (A) 제 8 항에 따른 벡터를 도입함 ;

    (B) 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 에 따른 유전자를 방해함 ; 또는

    (C) 프로모터에 돌연변이를 일으키거나 또는 프로모터를 유전적으로 변경시킴.
14. 제 13 항에 있어서, 응집성이 감소된 효모.
15. 제 10 항에 따른 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 양조된 알콜 음료가 맥아 음료인 방법.
17. 제 15 항에 있어서, 양조된 알콜 음료가 와인인 방법.
18. 제 15 항에 따른 방법에 의해 제조된 알콜 음료.
19. SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 효모의 응집성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법.
20. 하기를 포함하는, 효모의 응집성에 대해 테스트 효모를 평가하는 방법 :

    테스트 효모를 배양함 ; 및

    SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함.
21. 하기를 포함하는 효모의 선별 방법 :

    테스트 효모를 배양함 ;

    제 7 항의 단백질을 정량화하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정함 ; 및

    관심있는 응집성에 따른 유전자 발현 수준 또는 단백질의 양을 가진 테스트 효모를 선별함.
22. 제 21 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선별 방법 :

    대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

    SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가지고 효모에 응집성을 부여하는 활성을 가진 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 각각의 효모에 대해 측정함 ; 및

    대조군 효모의 것보다 더 높거나 더 낮은 유전자 발현을 가진 테스트 효모를 선별함.
23. 제 21 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선별 방법 :

    대조군 효모 및 테스트 효모를 배양함 ;

    각각의 효모 내 제 7 항에 따른 단백질의 양을 정량화함 ; 및

    대조군 효모보다 더 큰 또는 더 작은 양의 단백질을 가진 테스트 효모를 선 별함.
24. 삭제
25. 제 13 항에 따른 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 양조된 알콜 음료가 맥아 음료인 방법.
27. 제 25 항에 있어서, 양조된 알콜 음료가 와인인 방법.
28. 제 25 항에 따른 방법에 의해 제조되는 알콜 음료.
29. 삭제
30. 하기를 포함하는 알콜 음료의 제조 방법 :

    제 21 항에 따른 방법에 의해 선별되는 효모를 사용하여 알콜 음료를 제조하기 위해 발효를 수행함.

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