CN101041822B - 编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途 - Google Patents
编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途，特别涉及其凝集性适合于酿造目的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料、其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及一种酵母，通过控制编码与酿造酵母的凝集性相关的蛋白质的基因MHP1，特别是啤酒酵母的特征基因non-ScMHP1的表达量，而赋予该酵母适合于酿造目的酒精饮料的凝集性，还涉及使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。
Description
技术领域
本发明涉及编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途，特别涉及具有适度凝集性的制造酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料、其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及通过控制编码与酿造酵母的凝集性相关的蛋白质的MHP1基因，特别是啤酒酵母的特征基因nonScMHP1的表达量而具有适当凝集性的酵母、其选择方法、育种方法、以及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。
背景技术
在制造酒精饮料的过程中，供与酿造使用的酵母的凝集性非常重要，这里，酵母的凝集性是指各酵母细胞之间相互作用形成凝集块，在液体培养基中沉降于液体底部的性质。
例如，现在普遍喜欢饮用的储藏型啤酒，其酿造中使用的酵母的特征在于，接近发酵结束时酵母发生凝集沉降于发酵液的底部，所以称其为下层发酵酵母。在啤酒酿造过程中，要回收发酵结束后的酵母以在下次发酵中使用(将此称为连续酿造)，所以从酿造过程的工作效率来看酵母的凝集性是非常重要的特性。也就是说，凝集性低的酵母即使发酵结束时也不发生沉降，存在回收时必需进行例如离心分离等多余工序的问题。另一方面，凝集性太高的酵母在发酵途中发生沉降，有可能不能进行充分的发酵，这种情况下会极大影响产品的香味，所以使用其凝集性适合于制造目的酒精饮料的酵母非常重要。
此外，不仅限于酒精饮料，在工业用酒精生产(参照新型凝集性酒精发酵酵母、日本国特公平6-36734号公报)、废水处理(高凝集活性突变株、日本国特许第3044284号)，以及酒精饮料的生产领域，更加要求效率性，所以有关酵母凝集性的研究非常盛行。
这样在有关产业上具有重要性质的酵母凝集性的大量研究中，作为与酵母的凝集性相关的基因，到目前为止确定有FLO基因家族(FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO10、FLO11)和SFL1等。
作为这方面的研究，例如已对FLO1基因进行了分子水平的分析(Bidardet al.，YEAST，11(9)，809(1995))，已对通过使用Flo1p控制啤酒酵母的凝集性的方法进行了研究(日本国特许第3643404号)。此外还报道了下述方法，即，通过FLO8基因的表达调节控制酵母凝集性的方法(日本国日本特开平08-270号公报)、使用FLO5基因的碱基序列判定凝集性的方法(国际公开号：WO01/040514)等。
另一方面，还知道几种凝集性酵母的特异性酵母细胞表面蛋白，但对每一种蛋白质的认识还不足以达到用于控制啤酒酵母的凝集性的研究。
发明内容
在上述状况下，要求利用编码与酿造酵母凝集性相关的蛋白质的基因以及该蛋白质，对其凝集性适合于制造目的酒精饮料的酵母进行育种，以能够高效率制造酒精饮料。
本发明者为了解决上述课题进行精心研究，结果从啤酒酵母中成功鉴定、分离出编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因。此外，制备所得基因的表达得到控制的转化酵母，证明凝集性可实际上得到控制，从而完成了本发明。
本发明涉及编码与酿造酵母的凝集性相关的蛋白质的基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达受到调节的转化酵母、通过使用该基因表达受到调节的酵母来控制酵母凝集性的方法等。具体来说，本发明提供下述所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或DNA片段、导入该载体或DNA片段的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。
(1)多核苷酸，其选自下述(a)～(f)组成的群组：
(a)多核苷酸，其含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸；
(b)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列；
(c)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有赋予酵母凝集性的活性；
(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有赋予酵母凝集性的活性；
(e)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严格条件下与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有赋予酵母凝集性的活性的蛋白质；以及
(f)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严格条件下，与具有与编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有赋予酵母凝集性的活性的蛋白质。
(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其选自下述(g)～(i)组成的群组：
(g)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2的氨基酸序列或在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有赋予酵母凝集性的活性；
(h)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有赋予酵母凝集性的活性；以及
(i)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在高严格条件下，与具有序列号1的碱基序列的多核苷酸或具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有赋予酵母凝集性的活性的蛋白质。
(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸。
(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。
(6)多核苷酸，其选自下述(j)～(m)组成的群组：
(j)多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；
(k)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；
(l)多核苷酸，其编码RNA，该RNA对上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割活性；以及，
(m)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达。
(7)蛋白质，其为被上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
(8)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。
(8a)上述(8)所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：
(x)在酵母细胞内可转录的启动子；
(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其连接在该启动子的正义方向或反义方向；以及
(z)涉及RNA分子的转录终止及多腺苷酸化作用，并在酵母内起作用的信号。
(8b)上述(8)所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：
(x)在酵母细胞内可转录的启动子；
(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其连接在该启动子的正义方向；以及
(z)涉及RNA分子的转录终止及多腺苷酸化作用，并在酵母内起作用的信号。
(8c)上述(8)所述的载体，其包括表达盒，该表达盒包括下述构成要素(x)～(z)：
(x)在酵母细胞内可转录的启动子；
(y)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其连接在该启动子的反义方向；以及
(z)涉及RNA分子的转录终止及多腺苷酸化作用，并在酵母内起作用的信号。
(9)载体，其含有上述(6)所述的多核苷酸。
(10)酵母，其为导入上述(8)～(9)中任一项所述的载体的酵母。
(11)如上述(10)所述的酵母，其凝集性得到增大。
(12)如上述(11)所述的酵母，其中，凝集性的增大是通过增加上述(7)所述的蛋白质的表达量而获得。
(13)酵母，其为通过：
(A)导入上述(8)～(9)中任一项所述的载体，
(B)破坏上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的基因，或
(C)使启动子突变、或重组启动子，
而使上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母。
(14)如上述(13)所述的酵母，其凝集性得到降低。
(15)酒精饮料的制造方法，其中，使用上述(10)～(14)中任一项所述的酵母。
(16)如上述(15)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
(17)如上述(15)所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。
(18)酒精饮料，其为采用上述(15)～(17)中任一项所述的方法制造的酒精饮料。
(19)评价被检酵母的凝集性的方法，其包括使用根据具有序列号1的碱基序列且编码具有赋予酵母凝集性活性的蛋白质的基因的碱基序列而设计的引物或探针。
(19a)利用上述(19)所述的方法，选择出凝集性高或低的酵母的方法。
(19b)使用根据上述(19a)所述的方法选择的酵母，制造酒精饮料(如啤酒)的方法。
(20)评价被检酵母的凝集性的方法，其包括：培养被检酵母；以及测定具有序列号1且编码具有赋予酵母凝集性活性的蛋白质的基因的表达量。
(20a)酵母的选择方法，其包括：根据上述(20)所述的方法评价被检酵母；以及选择出编码具有赋予酵母凝集性活性的蛋白质的基因的表达量高或低的酵母。
(20b)使用根据上述(20a)所述的方法选择的酵母，制造酒精饮料(如啤酒)的方法。
(21)酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；定量上述(7)所述的蛋白质或者测定具有序列号1的碱基序列且编码具有赋予酵母凝集性活性的蛋白质的基因的表达量；以及选择所述蛋白质的量或所述基因表达量与目标凝集性相应的被检酵母的方法。
(22)如上述(21)所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母和被检酵母；测定具有序列号1的碱基序列且赋予酵母凝集性的基因在各酵母中的表达量；以及选择该基因的表达高于或低于标准酵母的被检酵母。
(23)如上述(21)所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母和被检酵母；定量各酵母中的上述(7)所述的蛋白质；选择其中该蛋白质的量多于或少于标准酵母的被检酵母。即，培养多个酵母；对各酵母中的上述(7)所述的蛋白质进行定量；以及选择各酵母中该蛋白质的量较多或较少的被检酵母。
(24)酒精饮料的制造方法，其包括，使用上述(10)～(14)中任一所述的酵母或根据上述(21)～(23)中任一所述的方法选择的酵母，进行制造酒精饮料的发酵，并调节酵母的凝集性。
根据本发明所述的使用转化酵母的酒精饮料的制造方法，通过使用其凝集性适合于制造目的酒精饮料的酵母，能够高效率地制造酒精饮料。
附图说明
图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。
图2表示啤酒酿造试验中浸出物(糖)消耗量的经时变化，横轴表示发酵时间，纵轴表示表观浸出物浓度(W/W％)。
图3表示啤酒酿造试验中的酵母中nonScMHP1基因的表达行为，横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号强度。
图4表示nonScMHP1破坏株的凝集性试验结果，纵轴表示凝集性指标沉降指数。
具体实施方式
本发明者根据日本国特开2004-283169公开的方法解读的啤酒酵母基因组的信息，分离、鉴定出编码与酿造酵母的凝集性相关的蛋白质的基因nonScMHP1，该碱基序列用序列号1表示，此外由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列用序列号2表示。
1.本发明的多核苷酸
首先，本发明提供：(a)多核苷酸，其含有具有序列号1的碱基序列的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作为本发明对象的多核苷酸，并不限定于编码上述来自于啤酒酵母的与凝集性相关的蛋白质的多核苷酸，而且还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以为(c)蛋白质，其为具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且赋予酵母凝集性的蛋白质。
此类蛋白质可以为：具有在序列号2的氨基酸序列中如缺失、取代、插入及/或添加1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个氨基酸残基后的氨基酸序列，且赋予酵母凝集性的蛋白质。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。并且此类蛋白质还可以为：(d)蛋白质，其具有与序列号2的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上的同一性的氨基酸序列，且赋予酵母凝集性。上述同源性的数值一般优选大的数值。
此外，对于酵母的凝集性，例如可以根据日本特开平H8-205890号公报所述的方法进行测定。
本发明还包括：(e)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严格条件下与具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码赋予酵母凝集性的蛋白质；以及(f)多核苷酸，其含有一种多核苷酸，该种多核苷酸在严格条件下，与具有与编码具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码赋予酵母凝集性的蛋白质。
这里所述的“严格条件下进行杂交的多核苷酸”，是指将具有与序列号1的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸的全部或一部分、或将编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、southern杂交法等得到的多核苷酸，例如DNA。杂交方法可以利用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997等所述的方法。
本说明书所述的“严格条件”，可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严格条件”，如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件下，预期温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸，如DNA。虽然影响杂交的严格度的因素有多种，如温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等，但本领域技术人员可通过适当选择这些要素得到类似的严格度。
使用市售的试剂盒进行杂交时，如可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。这种情况下，按照试剂盒中附带的说明书，与标记探针过夜培养后，在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的第一次洗涤缓冲液将膜洗涤后，由此检测杂交的多核苷酸，例如DNA。
除此之外可能杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1以上％、99.2以上％、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上的同一性的多核苷酸。
氨基酸序列、碱基序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的BLASTAlgorithm(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)来确定。以BLAST Algorithm为基础的称为BLASTN、BLASTX的程序已被开发(Altschul SF，et al：J Mol Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数为如score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数为如score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序系统设定的默认参数值。
本发明的多核苷酸还包括：(j)多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；(k)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；(l)多核苷酸，其编码RNA，该RNA对上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物具有特异切割的活性；以及(m)多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达。将这些多核苷酸整合到载体内，将该载体导入至待转化细胞内，从而抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，当上述DNA的表达受到抑制为优选时，可适宜使用这些多核苷酸。
本说明书中所述的编码具有与DNA的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸，指的是反义DNA。反义技术是公知的抑制特定的内源基因表达的方法，在各种文献中都有记载(如参照：平岛及井上：新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会主编，东京化学同人)pp.319-347，1993等)(平島および井上：新生化学実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現(日本生化学会编，東京化学同人)pp.319-347，1993)。反义DNA的序列，优选为与内源基因或其中一部分互补的序列，但只要能够有效抑制基因的表达，不完全互补也可以。被转录的RNA，优选其与靶基因的转录产物有90％以上的互补性，更优选有95％以上的互补性。反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱基以上，更优选为500个碱基以上。
本说明书中所述的编码通过RNAi效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸，指的是通过RNA干扰(RNAi)来抑制内源基因表达的多核苷酸。“RNAi”是指将具有与靶基因序列相同或类似的序列的双链RNA导入细胞内，导入的外源基因及内源靶基因的表达均被抑制的现象。这里使用的RNA，例如可以是21～25碱基长度的产生RNA干扰的双链RNA，如dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpin RNA)。此类RNA可以通过脂质体等输送系统局部输送到所需的部位，或者使用可生成上述双链RNA的载体能够使其局部表达。这种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等，在多种文献中是公知的(参照日本国特表2002-516062号公报；US 2002/086356A；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000April；Nature，407：6802，319-20，2002Sep.21；Genes & Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，99：9，6047-6052，2002Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002May；NatureBiotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002May；Nucleic Acids Res.，30：10，e46，2002May 15等)。
本说明书中所述的编码对DNA转录产物具有特异切割活性的RNA的多核苷酸，一般是指核酶(Ribozyme)。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA的转录产物来阻断其基因功能。关于核酶的设计可以参照各种公知文献(如参照FEBS Lett.228：228，1988；FEBS Lett.239：285，1988；Nucl.Acids.Res.17：7059，1989；Nature 323：349，1986；Nucl.Acids.Res.19：6751，1991；Protein Eng 3：733，1990；Nucl.Acids Res.19：3875，1991；Nucl.Acids Res.19：5125，1991；Biochem Biophys Res Commun186：1271，1992等)。此外，编码通过共抑制效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸是指通过共抑制来阻断靶DNA功能的核苷酸。
本说明书中所述的“共抑制”，是指通过转化作用在细胞内导入具有与内源靶基因相同或类似序列的基因，导入的外源基因和内源靶基因的表达均被抑制的现象。具有共抑制效应的多核苷酸的设计也可以参照各种公知文献(例如参照Smyth DR：Curr.Biol.7：R793，1997、Martienssen R：Curr.Biol.6：810，1996等)。
2.本发明的蛋白质
本发明还提供由上述(a)～(i)中任意一种多核苷酸所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质是：具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且赋予酵母凝集性的蛋白质。
此类蛋白质包括具有在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列，且赋予酵母凝集性的蛋白质。此外，此类蛋白质还包括具有与序列号2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且赋予酵母凝集性的蛋白质。
此类蛋白质可使用《Molecular Cloning 3》、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：6409(1982)”、“Gene，34：315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13：4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488(1985)”等所述的定点诱变法获得。
本发明所述的在蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基，是指在同一序列中的任意1个或多个位置缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基，并且缺失、取代、插入及添加中的2种以上情形可同时发生。
下面列举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯基丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造，并且也可以利用Advanced Chem Tech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、Shimazu公司等制造的肽合成仪进行化学合成。
3.本发明的载体及导入该载体的转化酵母
本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)或上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸。并且，构成的本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒包括的结构要素为：(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)在该启动子的正义或反义方向连接的上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)涉及RNA分子的转录终止及多腺苷酸化作用并在酵母内起作用的信号。
在本发明中，在下述酒精饮料(如啤酒)的酿造中，为使上述本发明的蛋白质进行高表达，将上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以该启动子的正义方向导入，以促进这些多核苷酸(DNA)的表达。此外，在下述酒精饮料(如啤酒)酿造中，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，将上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)以该启动子的反义方向导入，以抑制这些多核苷酸(DNA)的表达。
此外，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，也可将上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸导入其能够表达的载体内。此外，在本发明中，通过破坏作为靶基因的上述基因(DNA)，可以抑制上述DNA的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏可通过下述方式进行，在与靶基因的基因产物表达相关的区域如编码区或启动子区的内部添加或缺失一个或多个碱基，或者使上述区域整体缺失。上述基因破坏的方法可参照公知文献(例如参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本国特开平6-253826号公报等)。
在本发明中，通过使启动子突变或通过同源重组对启动子进行重组，能够控制靶基因的表达量。这种突变的导入方法在Nucleic Acids Res.29、4238-4250(2001)中有记载，此外，通过改变启动子来控制基因表达的方法如在Appl Environ Microbiol.，72，5266-5273(2006)中有记录。
导入酵母时使用的载体可以是多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任意一种。例如作为YEp型载体，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)，作为YIp型载体，已知有YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)，上述载体都容易获得。
只要在酿造用酵母中起作用的同时不受发酵液中的成分影响，用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子可以任意组合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因都已被克隆，如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知的方法能够容易地获得。
作为转化时使用的选择性标记，因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，可利用遗传霉素抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(猪腰淳嗣等，生物化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991。日语原名；猪腰淳嗣ら，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
将上述构建的载体导入宿主酵母内，宿主酵母的实例包括可在酿造中使用的任何酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等酿造用酵母等。具体可以为如酵母属(Saccharomyces)等酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、Saccharomyces carlsbergensisNCYC453或NCYC456等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953或NBRC1954等。并且还可使用威士忌酵母如Saccharomycescerevisiae NCYC90等，葡萄酒酵母如日本酿造协会的葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如日本酿造协会的清酒用7号、清酒用9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。
酵母的转化方法可利用一般使用的公知方法，如可以根据下述方法实施，电穿孔法(Meth.Enzym.，194：182(1990))、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1929(1978))”、醋酸锂法(J.Bacteriology，153：163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等所述的方法，但并不限于这些方法。
更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养至OD600nm值为1～6。将该培养酵母离心分离并收集，洗涤，用浓度约为1M～2M的碱金属离子，优选为锂离子进行预处理。上述细胞在约30℃下，静置约60分钟后，与欲导入的DNA(约1μg～20μg)同时在约30℃下，静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。约30℃下静置约30分钟后，将上述细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗涤，然后加入到预定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约30℃下静置约60分钟。然后，将其接种于含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。此外，一般的克隆技术可参照《Molecular Cloning 3》、“Methods in Yeast Genetics，A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本发明的酒精饮料制造方法以及根据该方法制造的酒精饮料
将上述本发明的载体或DNA片段导入适于酿造目标酒精饮料的酵母中，通过控制该基因的表达量，能够得到凝集性适于目的酒精饮料的酵母，从而能够高效率地制造酒精饮料。也就是说，使用导入上述本发明的载体或DNA片段的酵母、上述本发明的多核苷酸(DNA)的表达受到控制(促进或抑制)的酵母、或通过下述本发明的酵母的评价方法选择的酵母，进行制造酒精饮料的发酵，通过调节凝集性(增大或降低)，能够制造所期望的酒精饮料。目标酒精饮料包括但并不限于，例如啤酒，发泡酒(happoushu)等啤酒味饮料，葡萄酒，威士忌，清酒等，除此之外，还可以为作为燃料用的实用酒精等。
制造上述酒精饮料时，除使用本发明得到的酿造酵母代替亲株之外，还可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与传统方法完全相同，不会因制造酒精饮料而增加成本。即，根据本发明，使用已有的设备就可高效率地制造酒精饮料而不增加成本。
5.本发明的酵母的评价方法
本发明涉及评价方法，该评价方法使用根据具有序列号1的碱基序列且编码赋予酵母凝集性的蛋白质的基因的碱基序列设计的引物或探针评价被检酵母的凝集性。上述评价方法的一般方法为公知方法，例如在WO01/040514、日本国特开平H8-205900号公报等中有记录。下面，对该评价方法进行简单说明。
首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可采用Hereford法或乙酸钾法等任何一种公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，130(1990))。以得到的基因组为对象，使用根据编码赋予酵母凝集性的蛋白质的基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被检酵母的基因组中是否存在该基因或该基因的特异序列。可采用公知的方法设计引物或探针。
基因或特异序列的检测可采用公知的方法实施，例如，用含有特异序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与其碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为一个引物，用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有与所述碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为另一个引物，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增产物的有无、扩增产物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的碱基对数通常为10bp以上，优选15bp～25bp。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300bp～2000bp为宜。
PCR法的反应条件无特别限定，如可采用变性温度：90℃～95℃，退火温度：40℃～60℃，延伸温度：60℃～75℃，循环数：10次以上等条件。得到的反应生成物可通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，测定扩增产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量是否包含特定DNA分子的大小，来预测、评价该酵母的凝集性。并且，通过分析扩增产物的碱基序列，可以更准确地预测、评价上述性质。
在本发明中，也可通过培养被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列且编码赋予酵母凝集性的蛋白质的基因的表达量，评价被检酵母的凝集性。此时，也可以培养被检酵母，通过对编码赋予酵母凝集性的蛋白质的基因的产物mRNA或蛋白质进行定量来实施。mRNA或蛋白质的定量可以采用公知的方法进行，如可采用Northern杂交法、定量RT-PCR对mRNA进行定量，如可采用Western印迹法对蛋白质进行定量(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
培养被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列且编码赋予酵母凝集性的蛋白质的基因的表达量，通过选择上述基因表达量与目标凝集性相应的酵母，能够选择出适合酿造所期望的酒精饮料的酵母。此外，培养标准酵母及被检酵母，测定上述基因在各酵母中的表达量，通过比较上述基因在标准酵母和被检酵母中的表达量，可以选择出期望的酵母。具体来说，例如培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1的碱基序列的基因在各酵母中的表达量，通过选择与标准酵母相比该基因为高表达(即促进表达)或低表达(即抑制表达)的被检酵母，能够选择出适合酿造目的酒精饮料的酵母。
或者，培养被检酵母，通过选择凝集性高或低的酵母，能够选择出适合于酿造所期望的酒精饮料的被检酵母。
所述情况下，作为被检酵母或标准酵母，可以使用如导入上述本发明的载体或DNA片段的酵母、上述本发明的多核苷酸(DNA)的表达受到控制的酵母、实施突变处理的酵母、或发生自然突变的酵母等。酵母的凝集性可以根据如日本国特开平H8-205890号公报所述方法进行测定。突变处理，例如可以使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等任何方法(如参照大
泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等。日语原名；大
泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一)。
能够作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可以为可在酿造中使用的任意酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等酿造用酵母等。具体可以为酵母属(Saccharomyces)等酵母(例如Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae及Saccharomyces carlsbergensis)。本发明中可使用的啤酒酵母可为，如Saccharomyces pastorianus W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953或NBRC1954等。并且也可以使用葡萄酒酵母如日本酿造协会的葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等，清酒酵母如日本酿造协会的清酒用7号、清酒用9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。标准酵母、被检酵母也可以从上述酵母中以任意组合选择。
实施例
以下结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明不限于以下实施例。
实施例1：编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因(nonScMHP1)的克隆
使用日本国特开2004-283169中所述的比较数据库进行检索，结果发现编码与酿造酵母凝集性相关的蛋白质的基因nonScMHP1(序列号1)。根据获得的碱基序列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物nonScMHP1_F(序列号3)/nonScMHP1_R(序列号4)，通过以基因组解读株Saccharomycespastorianus W34/70株(简称“W34/70株”)的染色体DNA为模板的PCR，取得包括nonScMHP1的全长基因的DNA片段。
将上述方法得到的nonScMHP1基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，214：1215，1981)分析并确定nonScMHP1基因的碱基序列。
实施例2：啤酒酿造试验中的nonScMHP1基因表达的分析
使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒酿造试验。
麦芽汁浸出物浓度 12.69％
麦芽汁体积 70L
麦芽汁中溶解氧浓度 8.6ppm
发酵温度 15℃
酵母添加量 12.8×106细胞/mL
对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，制备的mRNA用生物素进行标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列杂交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检出，nonScMHP1基因的表达模式如图3所示。根据该结果确认在通常的啤酒发酵中nonScMHP1基因进行表达。
实施例3 nonScMHP1基因的破坏
按照文献(Goldstein et al.，yeast.15，1541(1999))的方法，通过以含有抗药性标记的质粒(pAG25(nat1))为模板的PCR，制作用于破坏基因的片段。作为PCR用的引物，使用nonScMHP1_delta_for(序列号5)、nonScMHP1_delta_rv(序列号6)。
使用上述方法制作的用于破坏基因的片段，对从啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株分离的孢子克隆株(W34/70-2)进行转化。根据日本国特开平07-303475号公报所述的方法进行转化，使用含有50mg/L诺尔丝菌素(Nourseothricin)的YPD平板培养基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。
实施例4 nonScMHP1破坏株的凝集性评价
根据下述方法对实施例3得到的破坏株及亲株(W34/70-2株)的凝集性进行评价。
将酵母接种于50mL的葡萄糖CM培养基(3％葡萄糖，1％细菌蛋白胨、0.5％酵母浸出物，0.5％KH2PO4，0.2％MgSO4·7H2O)中，30℃静置培养2天。将此全部培养物转移到450mL的葡萄糖CM培养基中，15℃静置培养4天。通过离心，随后用5℃的冷水洗涤2次，收集酵母菌体。将得到的湿菌体精确称量1.5g，使其悬浮于20mL的含2mM Ca的0.1M乙酸缓冲液中，在15℃恒温室内使温度平衡。
以下测定是在15℃恒温室内进行。使用涡流搅拌机将酵母悬浮液搅拌30秒，然后注入量筒内，直接抽取2mL作为0min的样品。保持原样静置，10分钟后抽取2mL作为10min的样品。
分别测定抽取的酵母悬浮液的OD600，用下述计算式求出酵母的凝集性沉降指数(SI)。结果如图4所示。数值表示n＝2时的测量平均值。
SI＝(OD10min-OD0min)/OD0min*100
如图4所示，亲株的SI＝244，而破坏株的SI＝139，由此表明nonScMHP1的破坏使酵母的凝集性降低。
实施例5 nonScMHP1高表达株的构建
将实施例1所述的nonScMHP1/pCR2.1-TOPO用限制酶SacI及NotI酶解，制备包括蛋白质编码区全长的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot上，从而构建出nonScMHP1高表达载体nonScMHP1/pYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括遗传霉素抗性基因G418r，大肠菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用上述方法制作的高表达载体，根据日本国特开平07-303475所述的方法，对Saccharomyces pastorianus Weihenstepan34/70株进行转化。使用含有300mg/L遗传霉素的YPD平板培养基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。
上述方法得到的高表达株及亲株(W34/70株)的凝集性采用与实施例4同样的方法进行评价。
根据本发明的酒精饮料的制造方法，能够控制发酵中酵母的凝集性，所以通过使用凝集性适合于制造目的酒精饮料的酵母，能够高效率地制造酒精饮料。
序列表
<110>三得利株式会社(Suntory Limited)
<120>编码与酵母的凝集性相关的蛋白质的基因及其用途(Gene encoding a protein responsible forflocculation properties of yeast and use thereof)
<130>G06-0091CN
<150>JP2006-49135
<151>2006-02-24
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>4074
<212>DNA
<213>酵母属(Saccharomyces sp.)
<400>1
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ggctggctgg tcaggcccaa cgcctccgcc ctcaggcacg agaggtccaa gtcgacggct 120
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aaaaggaagg gagaacaaga gcagcagaag cgcgaaaaag acaaggagga acaagaacaa 540
aaccgctcgc cctccccggg ccacgtgaac cgcaactcca taagaagaga acgaaccgcg 600
accatttctg ctgagtcacc tccgcccttg cagtacgtgg ccccgccgtc gtacaacgac 660
accgtggtgc cgctgacgag gtccaagact gaatccgagg tgtactacga gaaccatccg 720
cagaacaaca ctcacggtca catccacacg caacacactt tcgatgaagg tcaaactgat 780
tgcagctccc ccatagatgg cgccgcctgc agcggcactc gtcctgaccc gagattgatg 840
gatttcttgc ggtactacaa atctaaggac tacaaattag ccgcctttaa agaggggaac 900
ttcctgcaat ccacgccctc gtcgccgatc aagagaaaca cacgggcctc gttttccctt 960
cagaatgaca gacaattgcc ccccaagtta gccgcccgcc agaaattcga cgttaagggc 1020
agacctatcc cgccgcatcc ggacaaaccg aggttggcgc ccgccttcaa gaagaagaag 1080
caaccagtcg ctatggcatc gttggaggcc gtggactcta actcagacgt ctcgtcctcc 1140
gcgcagaaca acaacgcggc gccgtcttct cacaagttcg gcgcatttct cagaaaggtt 1200
acctcttacg ggaacaacgc ctcatcctcc tccgccaata ccaacaacct gctcaatgcc 1260
tcgtccacgt ccgtatggtc tgccaactcg ctcgagttcg atcctgcaaa gataaccgtc 1320
gtgcccgggc ttgagtacgt caagcccttg aaacacgtct cctttgctac gaacacctac 1380
ttcaacgacc ctccacagca gatctgtagt aaaaacccca gaagaggcga agtggaggtg 1440
gagcccaacg ggtccgtcgt tatacacaga ctgacaccgc aagagaggaa gaaaattatg 1500
gagtcgacaa gcctgggcgt cgtcgttggg ggcactggcc aattgaaact gctaaatcca 1560
gaagaggacg acatcaacgc caagagcaaa gaggagatgg ctccgcaaag gcaaaacgca 1620
gccgaagcgc ccgatgagga agatggcaac ccgcagagaa gaaacatcgt tatggctgcc 1680
gcagaagccg ccgcagaagc cagagccaaa gaggccccca acgagttgaa gcgtattgtc 1740
acgaacaatg aggaggaagt catcgttagt aagaccgcgt gtcatttaac cattgataag 1800
ccgatgatct caagaagggg tgcttccaca acctctctgg cctccatggt gtcgagtgat 1860
actaatggta cgaacgcaga tgacgagaag gagaccatgc ccccacccaa ccaaaagatc 1920
ccccacgata tcgtgtatac ccgctgctgt catttaagag aaattttgcc aataccggcc 1980
actttgaaac agttgaaaaa gggatccacc gaccccatcc ccatcttaca attgcgtaac 2040
ccaagaccct ccatggtgga aatttggtca tttagcgact tcttgagtgt ggcccccgtt 2100
ttgtgtcttt cgttggacgg tgtgcaatta acggtgcaaa tgctcagaag cattttgagt 2160
tctttgattt acaacccaca tttccaaaaa ctgtccttga gaaacacttt cctggatgaa 2220
gaaggctgga aaatgttatg ctattttgtc tccaaggcca ggtctttgca ttccatcgat 2280
ttgaccatgg tcccctccat caagacaaat gtacagaagc cctccaaatc ctctttgaag 2340
tcaaccatcc tcagaatgca gtgcaataca gacgacaggt ccgacatgaa ttgggatctc 2400
ttgactgctt ccatcgccct tagaggcggt ttggacgaaa ttgtcatttc gggggcaaaa 2460
atgaatggag cacaattcaa aaattttatc cttgtcgctt gtatcgctac cgaaagactg 2520
ggcctggctt ataatggctt gtccaagagt caatgtgacg atctggccag ttgggtggtg 2580
caatccgaag tgacaggttt ggatatcgga ttcaatgatc tgaatgggaa actatcgtcc 2640
ttcactaatg ctgtcctggg caaaattcaa aaggtcaacg agaaaaacgt cttcaagttt 2700
ctatctttaa atggaacaaa tttagaagta aaggaacacg atacttatga aaacaacgag 2760
gttttgaaat tgatcagtgt cctgtgctat tcagaaaacc tgaagttctt agatatctcg 2820
aacaaccctg caatctttcc gtattgtgtc ccgacactaa ttgattttct gcccgttttc 2880
gtcaacttgg tccgtttaca aatcgactac aataatttaa gctccaccag tgtggttatg 2940
ttggctgaag tattgcccat gtgttcgaga ctgagttact tctccatgtt ggggacagaa 3000
ttggatctgg catcctctaa agccctagcg gaagccgtga gaaagagctc atcgttgatg 3060
accttggacg tggattacgc ttacatgcca gagaatatca aggaaaaaat ttcactatat 3120
gccatgagaa acattcaagg tgaattgaaa agagttcaaa acgacgacaa agatatcaaa 3180
gacactcaat tttcaagttt acaagaccaa ctatcgcttt tattaactga aaaggcagac 3240
gattccgaac actataaaaa aatggtcgaa aacttcatgg ccaaaatcgc attggcccgt 3300
atcaagatca gtaaagtggt tcacgacctt ttcggtttaa aacttaatgg tcaattaaat 3360
ttggaaggca aagaagcttt gattagattg tgtttcatcg aggcaagttt ggaaagaggt 3420
tccgacttat taagacaaag acatcataat gctttgaaac cacgaagctc attctcggca 3480
aaccaaacag acgcaaattc agaaagttgt caaagaatgt tattgagttc atctatccta 3540
caaaattcag accacattgc cctgatgcca tttggcagtg cactagtcga aaaatctagc 3600
gcggacgcag aagacgctgt agagtttaga gaaggcgatg attcaaatac caaccatgaa 3660
gagggcccag ctaatgatct acaagcccaa gatcaagtcg atattaagaa taaatactct 3720
atcatcaaaa aagaactaga acacgaaaag cttgttggcg gtggggattt accagtggac 3780
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ttgaaaaatg acgtttctac tatcttgggt gttattgacg aattgcatag ccagggatat 3900
catttgcatc atattttcaa aaagcaggga aaccaatctg ataaacaaga agacgctacc 3960
cttcaagcga aggatgcgcc agaccagtcc caagcagaca attcaagtga taacatatct 4020
cttacgaccg accaaacatc gacagggttc tgccagtgcc aagacgaaca atga 4074
<210>2
<211>1357
<212>PRT
<213>酵母属(Saccharomyces sp.)
<400>2
Met Asp Ser Lys Asp Thr Gln Lys Leu Leu Lys Glu His Arg Ile Pro
1 5 10 15
Ser Ile Asp Val Gly Trp Leu Val Arg Pro Asn Ala Ser Ala Leu Arg
20 25 30
His Glu Arg Ser Lys Ser Thr Ala Glu Ser Val Ala Pro Asp Val Gln
35 40 45
Met Asp Thr Ala His Ser Ser Val Phe Asp Lys Ser Val Asp Thr Ser
50 55 60
Cys Gly Ile Leu Ser Pro Asn Asp Arg Val Arg Arg His Ser Val Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Leu Met Asn Asn Gln His Ile Thr Val Ala Pro Thr Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Asn Phe Pro Ser Gly Arg Gly Arg Ser Lys Ser Val Val
100 105 110
Glu Ile Thr Met Pro Gly Ser Gly Val Asp Ala Asp Ala Asp Ala Gly
115 120 125
Leu Arg His His His His His His His His His Ala Glu Asp Ala Ala
130 135 140
Ser Ser Pro Ala Pro Lys Lys Ile Gly Phe Phe Lys Ser Leu Phe Gly
145 150 155 160
Lys Arg Lys Gly Glu Gln Glu Gln Gln Lys Arg Glu Lys Asp Lys Glu
165 170 175
Glu Gln Glu Gln Asn Arg Ser Pro Ser Pro Gly His Val Asn Arg Asn
180 185 190
Ser Ile Arg Arg Glu Arg Thr Ala Thr Ile Ser Ala Glu Ser Pro Pro
195 200 205
Pro Leu Gln Tyr Val Ala Pro Pro Ser Tyr Asn Asp Thr Val Val Pro
210 215 220
Leu Thr Arg Ser Lys Thr Glu Ser Glu Val Tyr Tyr Glu Asn His Pro
225 230 235 240
Gln Asn Asn Thr His Gly His Ile His Thr Gln His Thr Phe Asp Glu
245 250 255
Gly Gln Thr Asp Cys Ser Ser Pro Ile Asp Gly Ala Ala Cys Ser Gly
260 265 270
Thr Arg Pro Asp Pro Arg Leu Met Asp Phe Leu Arg Tyr Tyr Lys Ser
275 280 285
Lys Asp Tyr Lys Leu Ala Ala Phe Lys Glu Gly Asn Phe Leu Gln Ser
290 295 300
Thr Pro Ser Ser Pro Ile Lys Arg Asn Thr Arg Ala Ser Phe Ser Leu
305 310 315 320
Gln Asn Asp Arg Gln Leu Pro Pro Lys Leu Ala Ala Arg Gln Lys Phe
325 330 335
Asp Val Lys Gly Arg Pro Ile Pro Pro His Pro Asp Lys Pro Arg Leu
340 345 350
Ala Pro Ala Phe Lys Lys Lys Lys Gln Pro Val Ala Met Ala Ser Leu
355 360 365
Glu Ala Val Asp Ser Asn Ser Asp Val Ser Ser Ser Ala Gln Asn Asn
370 375 380
Asn Ala Ala Pro Ser Ser His Lys Phe Gly Ala Phe Leu Arg Lys Val
385 390 395 400
Thr Ser Tyr Gly Asn Asn Ala Ser Ser Ser Ser Ala Asn Thr Asn Asn
405 410 415
Leu Leu Asn Ala Ser Ser Thr Ser Val Trp Ser Ala Asn Ser Leu Glu
420 425 430
Phe Asp Pro Ala Lys Ile Thr Val Val Pro Gly Leu Glu Tyr Val Lys
435 440 445
Pro Leu Lys His Val Ser Phe Ala Thr Asn Thr Tyr Phe Asn Asp Pro
450 455 460
Pro Gln Gln Ile Cys Ser Lys Asn Pro Arg Arg Gly Glu Val Glu Val
465 470 475 480
Glu Pro Asn Gly Ser Val Val Ile His Arg Leu Thr Pro Gln Glu Arg
485 490 495
Lys Lys Ile Met Glu Ser Thr Ser Leu Gly Val Val Val Gly Gly Thr
500 505 510
Gly Gln Leu Lys Leu Leu Asn Pro Glu Glu Asp Asp Ile Asn Ala Lys
515 520 525
Ser Lys Glu Glu Met Ala Pro Gln Arg Gln Asn Ala Ala Glu Ala Pro
530 535 540
Asp Glu Glu Asp Gly Asn Pro Gln Arg Arg Asn Ile Val Met Ala Ala
545 550 555 560
Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Arg Ala Lys Glu Ala Pro Asn Glu Leu
565 570 575
Lys Arg Ile Val Thr Asn Asn Glu Glu Glu Val Ile Val Ser Lys Thr
580 585 590
Ala Cys His Leu Thr Ile Asp Lys Pro Met Ile Ser Arg Arg Gly Ala
595 600 605
Ser Thr Thr Ser Leu Ala Ser Met Val Ser Ser Asp Thr Asn Gly Thr
610 615 620
Asn Ala Asp Asp Glu Lys Glu Thr Met Pro Pro Pro Asn Gln Lys Ile
625 630 635 640
Pro His Asp Ile Val Tyr Thr Arg Cys Cys His Leu Arg Glu Ile Leu
645 650 655
Pro Ile Pro Ala Thr Leu Lys Gln Leu Lys Lys Gly Ser Thr Asp Pro
660 665 670
Ile Pro Ile Leu Gln Leu Arg Asn Pro Arg Pro Ser Met Val Glu Ile
675 680 685
Trp Ser Phe Ser Asp Phe Leu Ser Val Ala Pro Val Leu Cys Leu Ser
690 695 700
Leu Asp Gly Val Gln Leu Thr Val Gln Met Leu Arg Ser Ile Leu Ser
705 710 715 720
Ser Leu Ile Tyr Asn Pro His Phe Gln Lys Leu Ser Leu Arg Asn Thr
725 730 735
Phe Leu Asp Glu Glu Gly Trp Lys Met Leu Cys Tyr Phe Val Ser Lys
740 745 750
Ala Arg Ser Leu His Ser Ile Asp Leu Thr Met Val Pro Ser Ile Lys
755 760 765
Thr Asn Val Gln Lys Pro Ser Lys Ser Ser Leu Lys Ser Thr Ile Leu
770 775 780
Arg Met Gln Cys Asn Thr Asp Asp Arg Ser Asp Met Asn Trp Asp Leu
785 790 795 800
Leu Thr Ala Ser Ile Ala Leu Arg Gly Gly Leu Asp Glu Ile Val Ile
805 810 815
Ser Gly Ala Lys Met Asn Gly Ala Gln Phe Lys Asn Phe Ile Leu Val
820 825 830
Ala Cys Ile Ala Thr Glu Arg Leu Gly Leu Ala Tyr Asn Gly Leu Ser
835 840 845
Lys Ser Gln Cys Asp Asp Leu Ala Ser Trp Val Val Gln Ser Glu Val
850 855 860
Thr Gly Leu Asp Ile Gly Phe Asn Asp Leu Asn Gly Lys Leu Ser Ser
865 870 875 880
Phe Thr Asn Ala Val Leu Gly Lys Ile Gln Lys Val Asn Glu Lys Asn
885 890 895
Val Phe Lys Phe Leu Ser Leu Asn Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Glu
900 905 910
His Asp Thr Tyr Glu Asn Asn Glu Val Leu Lys Leu Ile Ser Val Leu
915 920 925
Cys Tyr Ser Glu Asn Leu Lys Phe Leu Asp Ile Ser Asn Asn Pro Ala
930 935 940
Ile Phe Pro Tyr Cys Val Pro Thr Leu Ile Asp Phe Leu Pro Val Phe
945 950 955 960
Val Asn Leu Val Arg Leu Gln Ile Asp Tyr Asn Asn Leu Ser Ser Thr
965 970 975
Ser Val Val Met Leu Ala Glu Val Leu Pro Met Cys Ser Arg Leu Ser
980 985 990
Tyr Phe Ser Met Leu Gly Thr Glu Leu Asp Leu Ala Ser Ser Lys Ala
995 1000 1005
Leu Ala Glu Ala Val Arg Lys Ser Ser Ser Leu Met Thr Leu Asp
1010 1015 1020
Val Asp Tyr Ala Tyr Met Pro Glu Asn Ile Lys Glu Lys Ile Ser
1025 1030 1035
Leu Tyr Ala Met Arg Asn Ile Gln Gly Glu Leu Lys Arg Val Gln
1040 1045 1050
Asn Asp Asp Lys Asp Ile Lys Asp Thr Gln Phe Ser Ser Leu Gln
1055 1060 1065
Asp Gln Leu Ser Leu Leu Leu Thr Glu Lys Ala Asp Asp Ser Glu
1070 1075 1080
His Tyr Lys Lys Met Val Glu Asn Phe Met Ala Lys Ile Ala Leu
1085 1090 1095
Ala Arg Ile Lys Ile Ser Lys Val Val His Asp Leu Phe Gly Leu
1100 1105 1110
Lys Leu Asn Gly Gln Leu Asn Leu Glu Gly Lys Glu Ala Leu Ile
1115 1120 1125
Arg Leu Cys Phe Ile Glu Ala Ser Leu Glu Arg Gly Ser Asp Leu
1130 1135 1140
Leu Arg Gln Arg His His Asn Ala Leu Lys Pro Arg Ser Ser Phe
1145 1150 1155
Ser Ala Asn Gln Thr Asp Ala Asn Ser Glu Ser Cys Gln Arg Met
1160 1165 1170
Leu Leu Ser Ser Ser Ile Leu Gln Asn Ser Asp His Ile Ala Leu
1175 1180 1185
Met Pro Phe Gly Ser Ala Leu Val Glu Lys Ser Ser Ala Asp Ala
1190 1195 1200
Glu Asp Ala Val Glu Phe Arg Glu Gly Asp Asp Ser Asn Thr Asn
1205 1210 1215
His Glu Glu Gly Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Gln Asp Gln Val
1220 1225 1230
Asp Ile Lys Asn Lys Tyr Ser Ile Ile Lys Lys Glu Leu Glu His
1235 1240 1245
Glu Lys Leu Val Gly Gly Gly Asp Leu Pro Val Asp Lys Asp Ile
1250 1255 1260
Leu Asn Arg Ala Ala Gln Ser Leu Asp Ser Asp Gln Ile Lys Glu
1265 1270 1275
Phe Leu Leu Lys Asn Asp Val Ser Thr Ile Leu Gly Val Ile Asp
1280 1285 1290
Glu Leu His Ser Gln Gly Tyr His Leu His His Ile Phe Lys Lys
1295 1300 1305
Gln Gly Asn Gln Ser Asp Lys Gln Glu Asp Ala Thr Leu Gln Ala
1310 1315 1320
Lys Asp Ala Pro Asp Gln Ser Gln Ala Asp Asn Ser Ser Asp Asn
1325 1330 1335
Ile Ser Leu Thr Thr Asp Gln Thr Ser Thr Gly Phe Cys Gln Cys
1340 1345 1350
Gln Asp Glu Gln
1355
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(Primer)
<400>3
gagctcatag cggccatgga ttccaaggac acgcaaaagt 40
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)
<220>
<223>引物(Primer)
<400>4
ggatcctatg cggccgctac ataaaattat catacataaa ag 42
<210>5
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223引物(Primer)
<400>5
cttaacgcac atatatacgc aaatacacat catagctcca caactgctcc ccttgacagt 60
cttgacgtgc 70
<210>6
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>引物(Primer)
<400>6
atgcaacatg atctctaaac tccaatgaaa agaaagaaag aaatccttca cgcacttaac 60
ttcgcatctg 70
Claims (19)
1.多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其由序列号1的碱基序列组成。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸为DNA。
4.蛋白质，其为被权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
5.载体，其含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。
6.酵母，其为导入权利要求5所述的载体的酵母。
7.如权利要求6所述的酵母，其凝集性得到增大。
8.如权利要求7所述的酵母，其中，凝集性的增大是通过增加权利要求4所述的蛋白质的表达量而获得。
9.酵母，其为通过：
破坏权利要求3所述的多核苷酸的基因
而使权利要求3所述的多核苷酸的表达受到抑制的酵母。
10.如权利要求9所述的酵母，其凝集性得到降低。
11.酒精饮料的制造方法，其使用权利要求6～10中任一项所述的酵母。
12.如权利要求11所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
13.如权利要求11所述的酒精饮料的制造方法，其中，酿造的酒精饮料是葡萄酒。
14.评价被检酵母的凝集性的方法，其包括使用根据由序列号1组成的基因的碱基序列而设计的引物，其中所述引物使用的多核苷酸的碱基对数为10-25碱基对。
15.评价被检酵母的凝集性的方法，其包括：培养被检酵母；测定由序列号1组成且编码具有赋予酵母凝集性活性的蛋白质的基因的表达量。
16.酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；定量权利要求4所述的蛋白质或测定由序列号1组成且编码具有赋予酵母凝集性活性的蛋白质的基因的表达量；选择所述蛋白质的量或所述基因表达量与目标凝集性相应的被检酵母。
17.如权利要求16所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母和被检酵母；测定由序列号1组成且编码具有赋予酵母凝集性活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量；选择其中该基因的表达高于或低于标准酵母的被检酵母。
18.如权利要求16所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母和被检酵母；对各酵母中的权利要求4所述的蛋白质进行定量；选择其中该蛋白质的量多于或少于标准酵母的被检酵母。
19.酒精饮料的制造方法，其特征在于，使用权利要求6～10中任一项所述的酵母或根据权利要求16～18中任一项所述的方法选择的酵母，进行制造酒精饮料的发酵，并调节酵母的凝集性。
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